האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור Calretinin, S100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העיבוד החיסוני שאיבה רקטלית ביופסיה עבור calretinin, S100 חלבון, חלבון מוצר גן 9.5. שיטת האבחון החדשנית של מחלת הירשפרונג מעדיפה רגישות ותעריפים מסוימים.

Abstract

מחלת הירשפרונג (HD) היא מחלת מעיים מולדת אשר מתבטאת קלינית כחוסר יכולת לעבור meconium בתינוקות או עצירות לטווח ארוך אצל ילדים. ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB) כדי לקבוע את העדר של תאים גנגליון והיפרפרס עצביים הוא המבחן המדויק ביותר עבור האבחנה של HD כיום. המטאוקסילין המסורתי-אאוזין מכתים חסר רגישות וספציפיות. כתמים אצטילכולין אסטראז לא ניתן להשתמש באופן נרחב עקב התהליך המורכב שלה. הפרוטוקול הרומן שלנו של כתמים עבור calretinin, חלבון S100, וחלבון מוצר גן 9.5 (PGP 9.5), אשר אנו מתנהלים על RSBs, תצוגות רגישות גבוהה ושיעורי ספציפיות של 96.49% (95% מרווח ביטחון, 0.88-0.99) ו 100% (95% ביטחון מרווח, 0.97-1.00), בהתאמה. מקטעים מושפעים HD לעתים קרובות להציג כהעדר הביטוי של calretinin, S100 חלבון, ו PGP 9.5, אשר הם סמנים של היפרפרס עצבי ברקמת submucosal. פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההפעלה המפורט של שיטת אבחון חדשה זו.

Introduction

מחלת הירשפרונג (HD) היא הפרעת מעיים שכיחה בבטן מולדת המאופיינת בהעדר תאים גנגליון בחלקים שונים של מערכת העיכול¹. מערכת העצבים האנושית נוצר כאשר הפלישה של התאים העצביים העובריים הושלמה. אם יש הפרעה של התהליך ואת הפלישה נכשל להשלים, המעי המרוחק של היילוד הופך aganglionic². המצב הקטלני הזה נקרא מחלת הירשפרונג. התפשטות, תנועתיות וגידול במעיים הם שלושת המרכיבים העיקריים של הקולוניזציה המוצלחת.

המטאוקסילין מסורתית ו אאוזין (H & E) כתמים של ביופסיה מוגבלת submucosal לא יכול להגיע כגורם משביע רצון של התוצאה כמו H & E כתמים של רקמה בעובי מלא שהתקבלו מהניתוח. בנוסף, אצטילכולין אסטראז (כאב) כתמים של רקמת שאיבה רקטלית הוא מאתגר תיאורטית בשל הרגישות שלה מספיק, שהוא 91%, ועיבוד מורכב של סעיפים קפואים^3,4. מספר סמנים אימונוהיסטוכימיה אחרים של תאים גנגליון וסיבי עצב שניתן לוכתם ב-formalin קבוע ו פרפין מוטבע דגימות בהדרגה להפוך את האבחון המיינסטרים HD. Calretinin הוא ויטמין D תלויי-חלבון מחייב סידן שאינו מתבטא במיקלעת myenteric ו submucosal של מקטעים מושפעים HD⁵. חלבון S100 מתבטא בתאים הנגזרים מהרכס העצבי, כגון סיבי עצב ותאי גליה, אשר לעתים קרובות מציגים היפרפרס עצביים ברקמת המשנה של מקטעים מושפעים של HD⁶. גן חלבון מוצר 9.5 (PGP 9.5) כתמים באופן אמין סיבי עצב ו גנגליון תאים; PGP 9.5 כתמים מעשים כתוספת calretinin כתמים, במיוחד במקרים של היפוגנגלארי מבודדים. מכתים כפול עם S100 ו PGP 9.5 יכול להקטין את שיעור שלילי שלילית ולהגדיל את הרגישות. כתנאי מוקדם, המחקר הנוכחי שואפת להבטיח ספציפיות הולם רגישות גבוהה של שיטה זו אבחון הרומן. הפרוטוקול הרומן שלנו השתמש בכל שלושת הסמנים לאפליה של aganglionic מעי וסיבי עצב יפרטרופית. מחקר פוטנציאלי של 318 ילדים בוצע על ידי המעבדה שלנו ופורסם בעבר ללא פרוטוקול מפורט⁷. הפרוטוקול המפורט ואמצעי הזהירות נדונים במאמר זה. כל neonates שסבלו מבעיית הצואה חמור מאז הלידה או הילדים עם עצירות כרונית למעט מחלות נפוצות אחרות הם מועמדים פוטנציאליים ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB). הפרוטוקול הרומן שלנו מתאים לצביעת לא רק RSBs אלא גם ביופסיות בעובי מלא או דגימות כירורגי כדי לבצע אבחנה סופית.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת האתיקה המחקר של בית החולים האיחוד של האוניברסיטה של Huazhong המדע והטכנולוגיה.

1. שאיבה רקטלית ביופסיה

1. בצע את ביופסיה שאיבה פי הטבעת על ידי מנתח ילדים מיומן היטב עוזר באמצעות מערכת Rbi2 יניקה ביופסיה רקטלית לאחר קבלת הסכמה מושכלת מהשומר.
   1. לבצע RSB על חולים שיש להם את הסימנים הבאים: חוסר יכולת לעבור meconium אצל תינוקות או נפיחות ארוכת טווח עם או בלי עצירות אצל ילדים; ילדים עם עצירות ארוכת טווח הזקוקים שמן פרפין כדי להשלים את הצרכים; חסימת מעיים או ניקוב מעיים בעלי סיבות לא ידועות אצל ילדים העוברים בידור.
      הערה: התוויות RSB הן כדלקמן: ילדים שיש להם תסמינים חמורים, אשר נמצאים במצב פיזי עני, או מי לא יכול לסובלנית RSB; ילדים עם כניסה חריפה לבמה; ילדים העוברים השקה מעיים ללא החלמה מלאה.
2. לבצע חוקן החזקה מלוחים רגילה כמו הכנת המעיים 36 h לפני ההליך כדי למנוע שרפרפים רופפים בצקת מוגזמת של רירית. הוסף פתרון מגנזיום גופרתי אם לילד יש עצירות חמורה. מנהל ויטמין K (1 מ"ג/ק"ג) כדי neonates.
   הערה: אין לבצע בדיקות דם לפני הניתוח או טיפול באנטיביוטיקה, מאחר שהן אינן נדרשות.
3. . שים חולה בתנוחת הלייטוטומיה מעילים את המשטח של הצינור עם שמן פרפין. הכנס את הצינור בוטה הסתיימה 4-7 ס מ לתוך הרקטום עם החור הצדדי מול הקירות האחוריים או הצדדיים.
4. הפעילו לחץ עדין על הצינורית כדי להקל על הדבקה מספקת של החור הצדדי לקיר הרקטלי. לחץ על ההדק ומלא את הכלי באופן מיידי.
5. השתמש בכלי ביופסיה כדי לקבל 4 שאיבה ביופסיות עם קוטר של 2 מ"מ ב 3 ס"מ ו 6 ס מ מעל קו השיניים, בהמתנה ופוסטיות. השתמש במחט כדי לשים את הדגימה. על גזה הלחלח בתמיסת מלח
6. שימו לב למטופל עד השעה 14:00 לאחר ההליך לשלול דימום רקטלי. הימנע מניפולציות רקטאליים ואנאלי יותר ב -24 שעות הראשונות לאחר RSB.

2. הכנת מקטעי RSB

1. מניחים את ביופסיות היניקה פי הטבעת ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 6 h כדי לתקן את הרקמה. השתמש בכרך הקבע 5 פעמים יותר מנפח הרקמה.
2. מייבשים את הרקמה בעזרת מייבש. הרקמות הפתולוגי במשך 11 שעות התהליך המתוכנת כולו מורכב מ -5 השלבים הבאים:
   1. מניחים את רקמת פורמלדהיד ולתקן עבור 1 h.
   2. הניחו את הרקמה ב-75% אתנול במשך 4 שעות.
   3. מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 1 h כל אחד).
   4. מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 30 דקות כל אחד).
   5. מניחים את הרקמה ב קסילן (שלושה שינויים, 1 h כל אחד).
3. מניחים את הרקמה בשעווה פרפין (58-60 ° c) (שלושה שינויים, 1 h כל אחד). להטביע את רקמות RSB בגושי פרפין.
4. לקצץ את גושי פרפין באמצעות מיקרוטומה עד הרקמה חשופה לחלוטין עם מטוס בסעיף שלם.
5. חותכים את גושי לתוך 0.4 יקרומטר סעיפים עם מיקרוטומה.
6. מניחים את הסעיפים לתוך 45-50 מעלות צלזיוס במשך כמה שניות כדי לאפשר לקטעים להתפשט לתוך צלחת שטוחה.
7. העבר את מקטעי הפרפין אל שקופיות.
8. אופים את השקופיות בתנור של 60 ° c עבור 3-5 h. הימנע אפייה במשך זמן רב מדי, אשר עשוי להוביל לאובדן של אנטיגנים.
9. מניחים את השקופיות היחידות לתוך קסילן (2 שינויים, 15 דקות כל אחד).
10. מימה את השקופיות באתנול מוחלט, 95%, 80%, ו 75% אתנול עבור 5 דקות כל אחד. ואז, לשטוף אותם אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים לעוד 5 דקות.

3. שליפת אנטיגן

1. להפוך את העבודה לדילול עבור calretinin אחזור על ידי ערבוב 4 מ ל של מאגר האחזור אנטיגן EDTA עם 200 mL של מים RO-מטוהרים. הפוך את העבודה לדילול עבור S100 ו PGP 9.5 אחזור על ידי ערבוב 1 מ ל של חומצת לימון מאגר ציטראט של נתרן (100x) עם 99 mL של מים RO-מטוהרים.
   הערה: ניתן לאחזר את Calretinin באמצעות פתרון האחזור EDTA. עם זאת, חומצת המלח נתרן ציטראט מאגר מתאים יותר לשליפה של S100 ו PGP 9.5.
2. הצב את השקופיות בצנצנת המכתימה של הcoplin. ממלאים את הצנצנת בתמיסת האחזור ומניחים אותו לאמבט מים רותחים מחומם. לאחר הרתיחה של 20 דקות, להסיר את הצנצנת מאמבט מים ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך הקירור נמשך כ-10 דקות. הסר את השקופיות ושטוף אותם בעדינות פעם אחת עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS).
3. ציירו עיגול עם עט סמן סביב הרקמה והכינו קופסה רטובה להליכים הבאים.

4. חסימות

1. הפוך את העבודה לדילול על ידי ערבוב 3 מ ל של 30% H₂O₂ עם 27 מ ל של המים RO-מטוהרים.
2. הוסף שתיים או שלוש טיפות של 3% H₂O 2 הפתרון dropwise על הרקמה כדי לחסום את הפרמוקסיתמרים. הוסף את הפתרון H₂O₂ בהקדם כדי לוודא שהפתרון לא גולש מהמעגל. לבצע חסימה של הפרמוקסיתמרים בחממה 37 ° c עבור 20 דקות.
3. שטפו את השקופיות בעדינות עם ה-PBS (שלוש שטיפות, 5 דקות כל אחת).
4. לחסום את השקופיות עבור 20 דקות ב 37 ° צ' עם 5% בסרום שור (BSA, שהוכנו על ידי ערבוב 1.5 g של אבקת BSA עם 30 מ ל של מים RO-מטוהרים).
   הערה: חסימת עם 3% H₂O 2 יכול למנוע 95% של כתמים לא ספציפיים חסימה עם 5% bsa יכול למנוע את 5% אחרים של כתמים לא ספציפיים. שלב את שתי השיטות כדי לקבל תוצאה אמינה.

5. אנטיגן-התגובה הנוגדן

1. הסר את 5% BSA ולהוסיף 50 μL של הנוגדן העיקרי (calretinin, S100, או PGP 9.5) לשקופית. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
2. שטוף את השקופית עם PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).
3. הוסף 50 μL של פולימר משפר (מגיב A; ראה טבלה של חומרים) לסעיף ו מודקות אותו 20 דקות בחממה 37 ° c. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).
4. הוסף 50 μL של נוגדן משני B (עז אנטי ארנב/עכבר IgG נוגדן משני) לסעיף ו דגירה עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. שטוף את הקטע עם PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד).

6.3, 3-diaminobenzidine ו המטאוקסילין כתמים

1. להוסיף 850 μL של המים RO-מטוהרים ל שפופרת 1.5 mL ולהוסיף את ריאגנטים מכתים (לראות את הטבלה של חומרים) בסדר a, B, ו-C. Add 50 μl של כל מגיב כדי לקבל סכום כולל של 1 מ"ל של 3, 3-diaminobenzidine (בתוך) פתרון העבודה. אם יש מאיצים, השתמש בפתרון לאחר סינון.
2. הוסף טיפה של הפתרון לעבוד לחלק את הרקמה ואת הכתם עבור 3-10 דקות. מודקות את השקופיות בטמפרטורת החדר עד שמתגלה כתמים חומים. הצג בזהירות על ידי שימוש במיקרוסקופ שדה ברייטאני. השאר את הפתרון העובד בקלות הרחק מהאור. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS למשך 5 דקות.
3. הוסיפו טיפה של המטאוקסילין כדי להכתים את הגרעינים במשך כ-1 דקות. ואז, להחזיק את הצנצנת הcoplin ולשטוף אותו תחת זרזיף של מים עבור כ 30-40 s עד עודף הצבע מוסר. להיזהר לא לפגוע בסעיפים הרקמה.
4. לטבול את שקופיות RSB בצנצנת coplin המכילה PBS עבור 25-30 s. ואז, להבדיל ב 1% חומצה הידרוכלורית-אתנול עבור 10 ס. לשטוף את השקופיות עם PBS עבור 1 דקות.
5. מייבשים את השקופיות בסדר הפוך של לחות: 75%, 80%, 95%, ו אתנול מוחלט (5 דקות כל אחד).
6. לחשוף את השקופיות כדי קסילן (2 שינויים, 5 דקות כל אחד).
7. הר את הכיסויים באמצעות הרכבה ultraclean. אפשר לשקופיות להתייבש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ.

תוצאות

בסך הכל, 318 חולים נרשמו במחקר שלנו. כל החולים עברו RSB, ואת הרקמות היו מוכתם calretinin, S100, ו PGP 9.5. האבחנה המבוססת על הפרוטוקול הרומן שלנו היה HD ב 97 מקרים, non-HD במקרים 213, וחשד HD ב 8 מקרים. בין 132 חולים כירורגי, 99 חולים אובחנו עם HD על ידי כתמים חיסוני של דגימות מלאות בעובי לאחר הניתוח. S100 ...

Discussion

כאן תיארנו הליך באמצעות שלושה נוגדנים אימונוהיסטוכימיה שונים כדי להכתים סעיפים RBS לאבחון של HD. הרגישות של פרוטוקול האבחון שלנו היה 96.49% (95% CI, 0.88-0.99), והספציפיות היתה 100% (95% CI, 0.97-1.00).

הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם התגובה RSB ונוגדן אנטיגן. גודל הביופסיה קובע את הדיוק של הה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument