Diagnose der Hirschsprung-Krankheit durch die Immunofelflecken-Rectal Suction Biopsien für Calretinin, S100 Protein und Protein Gene Produkt 9.5

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Immunfärbung von rektalen Absaugbiopsien für Calretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5. Diese neuartige Adjuvan-Diagnostik für Hirschsprungs Krankheit hat bevorzugt Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten.

Zusammenfassung

Hirschsprungs Krankheit (HD) ist eine angeborene Darmerkrankung, die sich klinisch als Unfähigkeit manifestiert, Mekonium bei Säuglingen oder als langfristige Verstopfung bei Kindern zu passieren. Die Rectal-Saugbiopsie (RSB) zur Bestimmung des Fehlens von Ganglienzellen und der neuronalen Hypertrophie ist derzeit der genaueste Test für die Diagnose von HD. Der traditionellen Hämatoxlin-Eosin-Färbung fehlt es an Sensibilität und Spezifität. Die Acetylcholinesterase-Färbung kann aufgrund ihres komplexen Prozesses nicht weit verbreitet sein. Unser neuartiges Protokoll der Immunfärbung für Kalretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), das wir an RSBs durchgeführt haben, weist hohe Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall, 0,88-0,99) und 100% (95% Zuversicht auf Intervall, 0,97-1.00), bzw. Die HD-betroffenen Segmente treten oft als das Fehlen des Ausdrucks von Calretin, S100-Protein und PGP9.5 auf, die Marker der neuronalen Hypertrophie im submukosmischen Gewebe sind. Dieses Protokoll beschreibt den detaillierten Arbeitsprozess dieser neuen Diagnosemethode.

Einleitung

Hirschsprungs Erkrankung (HD) ist eine häufige angeborene Darmdarmstörung, die durch einen Mangel an Ganglienzellen in verschiedenen Segmenten des distalenDarms 1 gekennzeichnet ist. Das menschliche, enterische Nervensystem entsteht, wenn die Invasion der embryonalen Zellen abgeschlossen ist. Wenn es eine Störung des Prozesses gibt und die Invasion nicht abgeschlossen ist, wird der Distanzdarm des Neugeborenen aganglionisch². Dieser potenziell tödliche Zustand wird Hirschsprungs Krankheit genannt. Verbreitung, Beweglichkeit und Darmwachstum sind die drei Hauptbestandteile einer erfolgreichen Kolonisierung.

Die traditionelle Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann eine begrenzte submukosmale Biopsie nicht so zufriedenstellend erreichen wie die H-& E-Färbung eines aus der Operation gewonnenen Volldickengewebes. Darüber hinaus ist die Acetylcholinesterase (AChE) Färbung des rektalen Sauggewebes theoretisch eine Herausforderung, da die Empfindlichkeit von 91% nicht ausreichend ist, unddie komplexe Verarbeitung der gefrorenen Abschnitte^3,4. Mehrere andere immunhistochemische Marker von Ganglienzellen und Nervenfasern, die in formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Proben verfärbt werden können, werden nach und nach zur Mainstream-HD-Diagnostik. Calretinin ist ein Vitamin D-abhängiges Kalziumbindenprotein, das sich nicht im myenterischen und submukosmischen Plexus von HD-betroffenenSegmenten 5 ausdrückt. S100-Protein wird in Zellen ausgedrückt, die aus dem neuronalen Kamm abgeleitet werden, wie Nervenfasern und Gliazellen, die im Submukosmonalgewebe der HD-betroffenenSegmente 6 oft neuronale Hypertrophie aufweisen. Protein-Gen-Produkt 9.5 (PGP9.5) verfärbt zuverlässig Nervenfasern und Ganglienzellen; Die PGP9.5-Färbung dient als Ergänzung zur Kalretinin-Färbung, insbesondere bei isolierter Hypoganglionose. Doppelfärbung mit S100 und PGP9.5 kann die Falsch-Negativrate senken und die Empfindlichkeit erhöhen. Als Voraussetzung ist, dass die aktuelle Studie eine ausreichende Spezifität und hohe Empfindlichkeit dieser neuartigen Diagnostik gewährleisten soll. Unser neuartiges Protokoll verwendete alle drei Marker für die Diskriminierung von aganglionischen Darm und hypertrophen Nervenfasern. Eine prospektive Studie mit 318 Kindern wurde von unserem Labor durchgeführt und zuvor ohne ein detailliertes Protokoll⁷veröffentlicht. Das detaillierte Protokoll und die Vorsichtsmaßnahmen werden in diesem Artikel diskutiert. Alle Neugeborenen, die seit der Geburt an einem schweren Defekationsproblem litten, oder Kinder mit chronischer Verstopfung, die andere Volkskrankheiten ausgrenzend ausgrenzten, sind potenzielle Kandidaten für die rektale Saugbiopsie (RSB). Unser neuartiges Protokoll eignet sich zur Färbung nicht nur von RSBs, sondern auch zur Färbung von Biopsien oder chirurgischen Proben, um eine endgültige Diagnose zu stellen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Research Ethics Board des Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology genehmigt.

1. Rectal Suction Biopsie

1. Führen Sie die rektale Saugbiopsie durch einen gut ausgebildeten Kinderchirurgen und einen Assistenten mit einem Rbi2-Saugbiopsiesystem durch, nachdem Sie vom Vormund eine informierte Einwilligung erhalten haben.
   1. RSB bei Patienten durchführen, die folgende Indikationen haben: Unfähigkeit, Mekonium bei Säuglingen zu passieren oder Langzeitspeißen mit oder ohne Verstopfung bei Kindern; Kinder mit langfristiger Verstopfung, die Paraffinöl benötigen, um die Entschärfung zu vollenden; Darm-Behinderung oder Darmperforation mit unbekannten Gründen bei Kindern, die sich einer Enterostomie unterziehen.
      Hinweis: Die Kontraindikationen für die RSB sind wie folgt: Kinder, die schwere Symptome haben, die in einem schlechten körperlichen Zustand sind oder die RSB nicht tolerieren können; Kinder mit Akute-Stadium Enterocolitis; Kinder, die sich einer Darmerastomose unterziehen, ohne vollständige Heilung.
2. Führen Sie einen normalen Salzrückhalteeinlauf als Darmaufbereitung 36 h vor dem Eingriff, um lose Stühle und übermäßige Ödeme der Schleimhaut zu vermeiden. Fügen Sie Magnesiumsulfat-Lösung hinzu, wenn das Kind eine schwere Verstopfung hat. Administer Vitamin K (1 mg/kg) zu Neonaten.
   Hinweis: Führen Sie keine präoperativen Bluttests durch oder verabreichen Sie Antibiotika, da sie nicht erforderlich sind.
3. Setzen Sie den Patienten in die Lithotomie-Position. Die Oberfläche der Röhre mit Paraffinöl bedecken. Legen Sie das unverblümte Rohr 4-7 cm in das Rektum mit dem Seitenloch, das den hinteren oder seitlichen Wänden zugewandt ist.
4. Tragen Sie einen sanften Druck auf das Rohr auf, um eine ausreichende Haftung des Seitenlochs an der Rectalwand zu ermöglichen. Drücken Sie den Auslöser und ziehen Sie das Werkzeug sofort ab.
5. Mit dem Biopsie-Instrument erhalten Sie 4 Saugbiopsien mit einem Durchmesser von 2 mm bei 3 cm und 6 cm über der Dentallinie, anteriorisch und posteriorly. Verwenden Sie eine Nadel, um das Exemplar auf mit Salz befeuchtete Gaze zu legen.
6. Beobachten Sie den Patienten bis 2 Stunden nach dem Eingriff, um rektale Blutungen auszuschließen. Vermeiden Sie weitere rektale und anale Manipulationen in den ersten 24 Stunden nach RSB.

2. Vorbereitung der RSB-Sektionen

1. Legen Sie die rektalen Saugbiopsien in 4% Paraformaldehyd für 6 h, um das Gewebe zu fixieren. Verwenden Sie ein fixiertes Volumen 5-mal mehr als das Gewebevolumen.
2. Das Gewebe mit dem pathologischen Gewebedehydrierung für 11 Stunden entflehen. Der gesamte programmierte Prozess besteht aus den folgenden 5 Schritten:
   1. Das Gewebe in Formaldehyd legen und 1 Stunde fixieren.
   2. Das Gewebe in 75% Ethanol für 4 Stunden legen.
   3. Legen Sie das Gewebe in absolutes Ethanol (zwei Änderungen, je 1 h).
   4. Legen Sie das Gewebe in absolutes Ethanol (zwei Änderungen, je 30 min).
   5. Legen Sie das Gewebe in Xylol (drei Änderungen, je 1 h).
3. Das Gewebe in Paraffinwachs (58-60 ° C) (drei Änderungen, je 1 h) geben. Das RSB-Gewebe in Paraffinblöcke einbetten.
4. Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom, bis das Gewebe vollständig mit einer kompletten Sektionsebene freigelegt ist.
5. Die Blöcke mit einem Mikrotom in 0,4 μm schneiden.
6. Legen Sie die Abschnitte für jeweils einige Sekunden in 45-50 ° C Wasser, damit sich die Abschnitte in eine flache Platte ausbreiten können.
7. Übertragen Sie die Paraffinabschnitte auf Folien.
8. Die Dias in einem 60 ° C-Ofen 3-5 h backen. Vermeiden Sie zu lange Backen, was zum Verlust der Antigene führen kann.
9. Die abgefessten Dias in Xylol (2 Änderungen, je 15 min) geben.
10. Die Folien in absolutes Ethanol, 95%, 80% und 75% Ethanol für jeweils 5 min anfeueren. Dann in Umkehrosmose (RO)-Reinigtes Wasser für weitere 5 min spülen.

3. Antigen Retrieval

1. Machen Sie Arbeitsverdünnungen für die Calretinin-Abfrage, indem Sie 4 mL EDTA-Antigen-Abholpuffer mit 200 ml RO-Reinigungswasser mischen. Machen Sie Arbeitsverdünnungen für S100 und PGP9.5 Abruf, indem Sie 1 ml Natriumcitrat-Puffer (100x) mit 99 ml RO-Reinigungswasser mischen.
   Hinweis: Calretinin kann bevorzugt über EDTA Retrieval abgerufen werden. Allerdings eignet sich der Natriumcitrat-Puffer aus der Zitronensäure eher für die Rückgewinnung von S100 und PGP9.5.
2. Legen Sie die Dias in ein Coplin-Färtedgefäß. Füllen Sie das Glas mit Abhollösung und legen Sie es in ein vorgeheiztes kochendes Wasserbad. Nach dem Kochen für 20 Minuten, entfernen Sie das Glas aus dem Wasserbad und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Der Abkühlvorgang dauert ca. 10 Minuten. Entfernen Sie die Dias und spülen Sie sie mit phosphatgepufferter Saline (PBS).
3. Zeichnen Sie einen Kreis mit einem Marker-Stift um das Gewebe und bereiten Sie eine Nassbox für die folgenden Verfahren vor.

4. Blocking

1. Machen Sie Arbeitsverdünnungen, indem Sie 3 ml von 30% H₂O₂ mit 27 ml RO-Reinigungswasser mischen.
2. Zwei oder drei Tropfen von 3% H₂O₂ Lösung dropwise auf das Gewebe legen, um Peroxidate zu blockieren. Fügen Sie die H₂O_2-Lösung umgehend hinzu, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht aus dem Kreis überlaufen wird. Führen Sie die Blockierung von Peroxidaten in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten.
3. Spülen Sie die Dias sanft mit PBS (drei Waschmaschinen, je 5 min).
4. Die Dias 20 min bei 37 ° C mit 5% Rinder-Serumalbumin (BSA, hergestellt durch Mischen von 1,5 g BSA-Pulver mit 30 ml RO-Reinigungswasser) blockieren.
   Hinweis: Das Blockieren mit 3% H₂O₂ kann 95% der unspezifischen Färbung und Sperrung mit 5% BSA verhindern, die anderen 5% der unspezifischen Färbung. Kombinieren Sie die beiden Methoden, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen.

5. Antigen-Antikörperreaktion

1. Entfernen Sie die 5% BSA und fügen Sie 50 μL des primären Antikörpers (Calretinin, S100 oder PGP9.5) in das Dia. Über Nacht bei 4 ° C.
2. Waschen Sie die Folie mit PBS (dreimal, 3 min).
3. 50 μL Polymerverstärker (Reagenz A; siehe Materialtabelle) in den Abschnitt gebenund 20 Minuten in einem 37 ° C-Inkubator inkubieren. Dann die Folie mit PBS waschen (dreimal, je 3 min).
4. 50 μL sekundärer Antikörper B (Ziege Anti-Kanonnrabbit/Maus IgG sekundärer Antikörper) in den Abschnitt und Inkubat für 30 Minuten in einem 37 ° C Inkubator. Waschen Sie den Abschnitt mit PBS (dreimal, 5 min).

6.3, 3-Diaminobenzidin und Hematoxylin Staining

1. 850 μL RO-Reinigungswasser zu einem 1,5 mL Rohr hinzufügen und die Färbereagenzien (siehe Materialtabelle) in die Reihenfolge A, B und C. Addieren Sie 50 μL jedes Reagenzes, um insgesamt 1 ml 3,3-Diaminobenzid (DAB) Arbeitslösung zu erhalten. Wenn es Niederschläge gibt, verwenden Sie die Lösung nach der Filtration.
2. Fügen Sie einen Tropfen DAB-Arbeitslösung in den Gewebeabschnitt und flecken Sie 3-10 min auf. Inkubieren Sie die Dias in DAB bei Raumtemperatur, bis eine braune Färbung festgestellt wird. Überwachen Sie sorgfältig mit einem Lichtfeld-Mikroskop. Halten Sie die DAB-Arbeitslösung vom Licht fern. Dann die Rutsche mit PBS für 5 min waschen.
3. Fügen Sie einen Tropfen Hämatoxylin hinzu, um die Kerne für etwa 1 Minute zu kontern. Dann das Coplin-Glas halten und unter einem Wassertropfen für ca. 30-40 s waschen, bis der überschüssige Farbstoff entfernt ist. Achten Sie darauf, dass die Gewebeabschnitte nicht beschädigt werden.
4. Tauchen Sie die RSB-Folien in ein Coplin-Glas mit PBS für 25-30 s. Dann in 1% hydrochlorhaltigen Ethanol für 10 s unterschieden. Die Folien mit PBS für 1 min waschen.
5. Die Dias in der umgekehrten Feuchtigkeitsreihenfolge entflehen: 75%, 80%, 95% und absolutes Ethanol (je 5 min).
6. Die Dias mit Xylol aussetzen (2 Änderungen, je 5 min).
7. Montieren Sie den Küsgchen mit ultrakleer Montage. Lassen Sie Dias vor der Visualisierung mit Hilfe eines Mikroskops trocknen.

Ergebnisse

Insgesamt waren 318 Patienten in unsere Studie aufgenommen worden. Alle Patienten unterliefen RSB, und das Gewebe wurde für Calretinin, S100 und PGP9.5 gefärbt. Die Diagnose, die auf unserem neuartigen Protokoll basiert, war HD in 97 Fällen, Nicht-HD in 213 Fällen und Verdacht HD in 8 Fällen. Unter den 132 chirurgischen Patienten wurden 99 Patienten nach der Operation durch Immunfärbung von Volldickenproben mit HD diagnostiziert. Die Färbung der S100 und PGP9.5 zeigte, dass 92% bzw...

Diskussion

Hier beschrieben wir ein Verfahren mit drei verschiedenen immunhistochemischen Antikörpern, um RBS-Abschnitte für die Diagnose von HD zu verfärben. Die Empfindlichkeit unseres Diagnoseprotokolls betrug 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), und die Spezifität lag bei 100% (95% CI, 0,97-1,00).

Die kritischsten Schritte des Protokolls sind die RSB-und Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Größe der Biopsie bestimmt die Genauigkeit der Färbung. Eine kleine Biopsie liefert nicht genügend Gewebe, um eine ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument