Diagnóstico de doença de Hirschsprung por biopsias de sucção retal imunocoloração para Calretinina, proteína S100 e proteína gene produto 9,5

Resumo

Este protocolo descreve o processo de biópsias rectal da sucção do immunomancha para o calretinin, a proteína S100, e o produto do gene da proteína 9,5. Este método diagnóstico adjuvante novo para Hirschsprung ' a doença de s tem taxas preferíveis da sensibilidade e da especificidade.

Resumo

Hirschsprung ' a doença de s (HD) é uma doença intestinal congenital que seja manifestada clìnica como uma inabilidade passar o mecônio nos infantes ou como a constipação a longo prazo nas crianças. A biópsia rectal da sucção (RSB) para determinar a ausência de pilhas do gânglio e a hipertrofia neural é o teste o mais exato para o diagnóstico de HD no presente. A coloração tradicional da hematoxilina-eosina carece de sensibilidade e especificidade. A coloração da acetilcolinesterase não pode ser amplamente utilizada devido ao seu processo complexo. Nosso novo protocolo de imunocoloração para calretinina, proteína S100 e produto de gene de proteína 9,5 (PGP 9.5), que realizamos no RSBs, apresenta altas taxas de sensibilidade e especificidade de 96,49% (intervalo de confiança de 95%, 0,88-0,99) e 100% (95% de confiança intervalo, 0,97-1,00), respectivamente. Os segmentos afetados pela DH frequentemente apresentam-se como ausência da expressão de calretinina, proteína S100 e PGP 9.5, que são marcadores de hipertrofia neural no tecido submucoso. Este protocolo descreve o processo operacional detalhado deste método diagnóstico novo.

Introdução

Hirschsprung ' a doença de s (HD) é uma desordem intestinal congenital comum do intestino caracterizada por uma falta de pilhas do gânglio em segmentos diferentes do intervalo intestinal longe do ponto de origem¹. O sistema nervoso entérico humano é formado quando a invasão das células neurais embrionárias é completada. Se há uma perturbação do processo e a invasão não termina, o intestino distal do recém-nascido torna-se aganglionic². Esta condição potencialmente fatal é chamada de doença de Hirschsprung. Proliferação, motilidade e crescimento intestinal são os três principais componentes da colonização bem-sucedida.

A coloração tradicional da hematoxilina e da eosina (H & E) de uma biópsia submucosal limitada não pode alcançar como satisfatório de um resultado como a mancha de H & E de um tecido da cheio-espessura obtido da cirurgia. Adicionalmente, a coloração da acetilcolinesterase (ache) do tecido de sucção retal é teoricamente desafiadora devido à sua sensibilidade inadequada, que é de 91%, e processamento complexo de seções congeladas^3,4. Diversos outros marcadores immunohistochemical de pilhas do gânglio e de fibras de nervo que podem ser manchados em espécimes formalin-fixos e parafina-incorporados estão transformando-se gradualmente os diagnósticos mainstream de HD. A calretinina é uma proteína de ligação ao cálcio dependente da vitamina D que não é expressa no plexo mientérico e submucoso dos segmentos afetados pela DH⁵. A proteína S100 é expressa em células derivadas da crista neural, como fibras nervosas e células gliais, que muitas vezes apresentam hipertrofia neural no tecido submucoso de segmentos afetados pela DH⁶. O produto do gene da proteína 9,5 (PGP 9.5) mancha confiantemente fibras de nervo e pilhas do gânglio; A mancha de PGP 9.5 actua como um suplemento à mancha do calretinin, especial nos casos do hypoganglionosis isolado. A coloração dupla com S100 e PGP 9.5 pode diminuir a taxa falsa-negativa e aumentar a sensibilidade. Como pré-requisito, o presente estudo tem como objetivo garantir a especificidade adequada e a alta sensibilidade deste novo método de diagnóstico. Nosso protocolo novo usou todos os três marcadores para a discriminação do intestino aganglionic e das fibras de nervo hipertrófica. Um estudo prospectivo de 318 crianças foi realizado por nosso laboratório e previamente publicado sem um protocolo detalhado⁷. O protocolo detalhado e as precauções são discutidos neste artigo. Todos os neonatos que sofram de um problema severo da defecação desde o nascimento ou as crianças com constipação crônica que exclui outras doenças comuns são candidatos potenciais para a biópsia rectal da sucção (RSB). Nosso protocolo novo é apropriado para manchar não somente RSBs mas igualmente biópsias da cheio-espessura ou espécimes cirúrgicos para fazer um diagnóstico final.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de ética em pesquisa do hospital da União da Universidade Huazhong de ciência e tecnologia.

1. biópsia de sucção retal

1. Realize a biópsia de sucção retal por um cirurgião pediátrico bem treinado e um assistente usando um sistema de biópsia retal de sucção Rbi2 após obter o consentimento informado do tutor.
   1. Realizar RSB em pacientes que têm as seguintes indicações: incapacidade de passar o mecônio em lactentes ou inchaço a longo prazo com ou sem constipação em crianças; crianças com constipação a longo prazo que necessitam de óleo de parafina para completar a defecação; obstrução intestinal ou perfuração intestinal com razões desconhecidas nas crianças que submetem-se a uma enterostomia.
      Nota: as contraindicações para RSB são as seguintes: crianças que têm sintomas graves, que estão em mau estado físico, ou que não podem tolerar a RSB; crianças com enterocolite de estágio agudo; crianças submetidas a anastomoses intestinais sem cura completa.
2. Realize um enema de retenção salina normal como preparação intestinal 36 h antes do procedimento para evitar fezes soltas e edema excessivo da mucosa. Adicionar solução de sulfato de magnésio se a criança tem constipação severa. Administrar vitamina K (1 mg/kg) para neonatos.
   Nota: não realize análises sanguíneas pré-operatórias ou administre antibióticos, uma vez que não são necessários.
3. Coloque o paciente na posição de litotomia. Revestir a superfície do tubo com óleo de parafina. Inserir o tubo sem corte 4-7 cm no reto com o orifício lateral virado para as paredes posterior ou lateral.
4. Aplique uma pressão suave no tubo para facilitar a aderência adequada do orifício lateral à parede retal. Pressione o gatilho e retire a ferramenta imediatamente.
5. Utilize o instrumento de biópsia para obter 4 biópsias de sucção com um diâmetro de 2 mm a 3 cm e 6 cm acima da linha dentária, anteriormente e posteriormente. Use uma agulha para colocar a amostra em gaze umedecida com soro fisiológico.
6. Observe o paciente até 2 h após o procedimento para descartar sangramento retal. Evite mais manipulações rectal e anais nos primeiros 24 h após RSB.

2. preparação das secções do RSB

1. Coloque as biópsias de sucção retal em paraformaldeído 4% por 6 h para fixar o tecido. Use um volume fixador 5 vezes mais do que o volume do tecido.
2. Desidratar o tecido usando o desidratador de tecido patológico por 11 h. Todo o processo programado consiste nos seguintes 5 passos:
   1. Coloque o tecido em formaldeído e fixar por 1 h.
   2. Coloque o tecido em 75% de etanol por 4 h.
   3. Coloque o tecido em etanol absoluto (duas mudanças, 1 h cada).
   4. Coloque o tecido em etanol absoluto (duas mudanças, 30 min cada).
   5. Coloque o tecido em xileno (três alterações, 1 h cada).
3. Coloque o tecido em cera de parafina (58-60 ° c) (três mudanças, 1 h cada). Incorporar os tecidos RSB em blocos de parafina.
4. Aparar os blocos de parafina usando um micrótomo até que o tecido é totalmente exposto com um plano de seção completa.
5. Cortar os blocos em secções de 0,4 μm com um micrótomo.
6. Coloc as seções na água do ° c 45-50 por alguns segundos cada um para permitir que as seções espalhem em uma placa lisa.
7. Transfira as secções de parafina para as lâminas.
8. Cozer as lâminas em um forno de 60 ° c para 3-5 h. Evite assar por muito tempo, o que pode levar à perda dos antígenos.
9. Coloque as lâminas desparaffinizadas em xileno (2 alterações, 15 min cada).
10. Hidratar as lâminas em etanol absoluto, 95%, 80% e 75% etanol por 5 min cada. Em seguida, lave-os em osmose reversa (RO)-água purificada por mais 5 min.

3. recuperação do antígeno

1. Faça diluições de trabalho para a recuperação do calretinin misturando 4 mL do amortecedor da recuperação do antígeno do EDTA com 200 mL da água RO-purified. Faça diluições de trabalho para a recuperação de S100 e de PGP 9.5 misturando 1 mL do amortecedor do citrato de sódio do ácido cítrico (100x) com 99 mL da água RO-purified.
   Nota: a Calretinina pode ser recuperada preferencialmente pela solução de recuperação de EDTA. Entretanto, o tampão do citrato de sódio do ácido cítrico é mais apropriado para a recuperação de S100 e de PGP 9.5.
2. Coloque os slides em um frasco de coloração de copelina. Encha o jarro com solução de recuperação e coloque-o em um banho de água fervente pré-aquecido. Depois de ferver por 20 min, retire o jarro do banho de água e deixe esfriar a temperatura ambiente. O processo de resfriamento demora aproximadamente 10 min. Retire as lâminas e lave-as suavemente uma vez com soro fisiológico tampão fosfato (PBS).
3. Desenhe um círculo com uma caneta marcador em torno do tecido e prepare uma caixa molhada para os seguintes procedimentos.

4. bloqueio de

1. Fazer diluições de trabalho misturando 3 mL de 30% H₂O₂ com 27 ml de água purificada em ro.
2. Adicionar duas ou três gotas de 3% H₂O₂ solução gota para o tecido para bloquear peroxidados. Adicione a solução H₂o₂ prontamente para garantir que a solução não transbordará do círculo. Realize o bloqueio de peroxidates em uma incubadora de 37 ° c por 20 min.
3. Enxague suavemente as lâminas com PBS (três lavagens, 5 min cada).
4. Bloqueie as lâminas durante 20 min a 37 ° c com 5% de albumina sérica bovina (BSA, preparada misturando 1,5 g de BSA em pó com 30 mL de água RO-purificada).
   Nota: o bloqueio com 3% H₂O₂ pode impedir que 95% da mancha e do bloqueio não específicos com 5% BSA possa impedir os outros 5% da mancha não específica. Combine os dois métodos para obter um resultado confiável.

5. antígeno-reação do anticorpo

1. Remova o 5% BSA e adicione 50 μL do anticorpo preliminar (calretinin, S100, ou PGP 9.5) à corrediça. Incubar durante a noite a 4 ° c.
2. Lave o slide com PBS (três vezes, 3 min cada).
3. Adicionar 50 μL de potenciador de polímero (Reagente A; ver tabela de materiais) na secção e incubatê-lo durante 20 min numa incubadora de 37 ° c. Em seguida, lave o slide com PBS (três vezes, 3 min cada).
4. Adicionar 50 μL de anticorpo secundário B (anticorpo secundário de cabra anti-coelho/rato IgG) à secção e incubar durante 30 min numa incubadora de 37 ° c. Lave a secção com PBS (três vezes, 5 min cada).

6.3, 3-diaminobenzidina e coloração de hematoxilina

1. Adicionar 850 μL de água de RO-purificada a um tubo de 1,5 mL e adicionar os reagentes de coloração (ver tabela de materiais) na ordem a, B e C. Adicionar 50 μL de cada reagente para obter um total de 1 ml de 3, 3-diaminobenzidina (DAB) solução de trabalho. Se houver precipitados, use a solução após a filtração.
2. Adicione uma gota da solução de trabalho DAB à secção do tecido e manche por 3-10 min. Incubar as lâminas no DAB à temperatura ambiente até detectar coloração castanha. Monitore com cuidado usando um microscópio do brightfield. Mantenha a solução de funcionamento DAB afastada da luz. Em seguida, lave o slide com PBS por 5 min.
3. Adicione uma gota de hematoxilina para neutralizar os núcleos por aproximadamente 1 min. Em seguida, segure o frasco de copeline e lave-o um gotejamento de água para aproximadamente 30-40 s até que o corante em excesso seja removido. Tenha cuidado para não danificar as secções de tecido.
4. Mergulhe os slides RSB em um frasco de copeline contendo PBS para 25-30 s. Em seguida, diferenciar em 1% de ácido clorídrico-etanol para 10 s. Lave as lâminas com PBS durante 1 min.
5. Desidratar os slides na ordem inversa de hidratação: 75%, 80%, 95% e etanol absoluto (5 min cada).
6. Expor os slides para xileno (2 alterações, 5 min cada).
7. Monte a lamínula usando a montagem ULTRACLEAN. Permitir que os slides secar antes de visualização usando um microscópio.

Resultados

No total, 318 pacientes foram matriculados em nosso estudo. Todos os pacientes foram submetidos a RSB, e os tecidos foram corados para calretinina, S100 e PGP 9,5. O diagnóstico baseado em nosso protocolo novo era HD em 97 casos, non-HD em 213 casos, e em HD suspeitado em 8 casos. Entre os 132 pacientes cirúrgicos, 99 pacientes foram diagnosticados com HD por imunocoloração de espécimes de espessura total após a cirurgia. A coloração de S100 e de PGP 9.5 mostrou que 92% e 93% dos ...

Discussão

Aqui nós descrevemos um procedimento usando três anticorpos immunohistochemical diferentes para manchar seções de RBS para o diagnóstico de HD. A sensibilidade de nosso protocolo de diagnóstico foi de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), e a especificidade foi de 100% (95% IC, 0,97-1,00).

As etapas as mais críticas do protocolo são RSB e reação do antígeno-anticorpo. O tamanho da biópsia determina a exatidão da coloração. Uma biópsia pequena não fornecerá o suficiente tecido para faze...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument