Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5

Özet

Bu protokol, calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 için immünostasyon rektal emiş biyopsisi sürecini açıklar. Hirschsprung hastalığı için bu roman adjuvan tanı yöntemi tercih duyarlılık ve özgüllük oranları vardır.

Özet

Hirschsprung hastalığı (HD) klinik olarak bebeklerde mekonyum veya çocuklarda uzun süreli kabızlık geçmek için bir yetersizlik olarak ortaya çıkan konjenital bir bağırsak hastalığıdır. Rektal emiş biyopsisi (RSB) ganglion hücrelerinin yokluğunda belirlemek için ve nöral hipertrofisi Şu anda HD tanısı için en doğru testtir. Geleneksel hematoksislin-eozin boyama hassasiyeti ve özgüllüğü yoktur. Asetilkolinesteraz boyama karmaşık süreci nedeniyle yaygın olarak kullanılamaz. RSBs üzerinde yaptığımız calretinin, S100 proteini ve protein geni ürün 9,5 (PGP 9.5) için immünostasyonu olan yeni protokolümüz,% 96,49 (% 95 güven aralığı, 0.88-0,99) ve% 100 (% 95 güven aralığında) yüksek hassasiyet ve özgüllük oranları sergiler interval, 0.97-1.00), sırasıyla. HD etkilenen segmentler genellikle kalretinin ifadesi yokluğunda mevcut, S100 protein, ve PGP 9.5, submukozal dokuda nöral Hipertrofinin belirteçleri olan. Bu protokol, bu yeni tanılama yönteminin ayrıntılı işletim sürecini açıklar.

Giriş

Hirschsprung hastalığı (HD) distal bağırsak yolunun farklı segmentlerinde ganglion hücrelerinin eksikliği ile karakterize ortak konjenital bağırsak bağırsak bozukluğu¹. Embriyonik nöral hücrelerin istilası tamamlandığında insan enterik sinir sistemi oluşur. Eğer sürecin bir bozukluğu varsa ve istilanın tamamlanması başarısız olursa, yenidoğan distal bağırsak aganglionik²olur. Bu potansiyel ölümcül durum Hirschsprung hastalığı denir. Proliferasyon, motilite ve bağırsak büyümesi başarılı kolonizasyon üç ana bileşenleridir.

Sınırlı submukozal biyopsinin geleneksel hematoksisi ve Eozinin (H & E) boya tedavisi, ameliyattan elde edilen tam kalınlıkta bir dokunun H & E boyama sonucu tatmin edici olarak elde edilemez. Ayrıca, rektal emiş dokusunun asetilkolinesteraz (AChE) lekesi,% 91 olan yetersiz duyarlılığı ve Frozen bölümler^3,4' ün karmaşık işlenmesi nedeniyle teorik olarak zordur. Ganglion hücrelerinin ve formalin-sabit ve parafin-gömülü örneklerinde lekelenebilir sinir liflerinin birçok diğer immunhistokimyasal belirteçleri kademeli olarak mainstream HD tanılama haline gelmektedir. Calretinin, HD etkilenen segmentlerin myenterik ve submukozal pleksusunda ifade edilmez olan D vitamini bağımlı kalsiyum bağlayıcı bir proteindir⁵. , Sinir lifleri ve glial hücreler, genellikle HD etkilenen segmentler⁶submukozal dokuda nöro hipertrofisi mevcut gibi neural arması türetilen hücrelerde S100 protein ifade edilir. Protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) güvenilir lekeler sinir lifleri ve ganglion hücreleri; PGP 9.5 boyama, özellikle izole hypoganglionosis vakalarında, kalretinin lekeleme ek olarak davranır. S100 ve PGP 9.5 ile çift boyama yanlış negatif hızını azaltabilir ve hassasiyeti artırabilir. Bir önkoşul olarak, mevcut çalışma bu roman tanı yönteminin yeterli özgüllüğü ve yüksek hassasiyetini sağlamayı amaçlamaktadır. Bizim yeni protokol aganglionik bağırsak ve hipertrofik sinir lifleri ayrımcılık için her üç işaretçileri kullandı. 318 çocuk prospektif bir çalışma laboratuvarımız tarafından yapıldı ve daha önce ayrıntılı bir protokol⁷olmadan yayınlandı. Bu makalede ayrıntılı protokol ve önlemler ele alınmaktadır. Doğumdan bu yana şiddetli bir defekasyon probleminden ya da diğer ortak hastalıklar haricinde kronik kabızlık olan çocuklardan gelen herhangi bir yenidoğan, rektal emiş biyopsisi (RSB) için potansiyel adaylardır. Bizim yeni protokol sadece RSBs değil, aynı zamanda tam kalınlık biopsleri veya cerrahi numuneler son tanı yapmak için boyama için uygundur.

Protokol

Bu protokol Huazhong bilim ve Teknoloji Üniversitesi birlik Hastanesi araştırma etiği Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. rektal emiş biyopsisi

1. Rektal emiş biyopsisi ile iyi eğitimli bir Pediatrik cerrah ve Rbi2 emiş Rektal biyopsi sistemini kullanarak bir asistanın Velinden bilgilendirilmiş onay aldıktan sonra gerçekleştirin.
   1. Aşağıdaki endikasyonlara sahip hastalarda RSB gerçekleştirin: bebeklerde mekonyum veya çocuklarda kabızlık olmadan veya uzun süreli şişkinlik geçememesidir; defekasyonu tamamlamak için parafin yağa ihtiyacı olan uzun süreli kabızlık olan çocuklar; bir enterostomi geçiren çocuklarda bilinmeyen nedenlerden dolayı bağırsak tıkanıklığı veya bağırsak perforasyonu.
      Not: RSB için kontrendikasyonlar aşağıdaki gibidir: kötü fiziksel durumda olan veya RSB toleranslı olmayan ciddi semptomlara sahip çocuklar; Akut aşamalı enterokolit olan çocuklar; Tam şifa olmadan intestinal anastomoz geçiren çocuklar.
2. Bağırsak hazırlama olarak normal bir tuzlu tutma lavmanı gerçekleştirin 36 h prosedür önce gevşek dışkı ve mukoza aşırı ödem önlemek için. Çocuk şiddetli kabızlık varsa magnezyum sülfat solüsyonu ekleyin. K vitamini (1 mg/kg) yenidoğan için yönetin.
   Not: gerekli olmadığı gibi, preoperatif kan testleri yapmak veya antibiyotik yönetmek etmeyin.
3. Hastaya litotomi konumuna koyun. Ceket parafin yağı ile tüp yüzeyi. Arka veya lateral duvarlar bakan yan delik ile rektum içine künt uçlu tüp 4-7 cm yerleştirin.
4. Yan deliğin rektal duvara yeterli yapışmasını kolaylaştırmak için tüpün üzerine nazik basınç uygulayın. Tetiği basın ve aracı hemen geri çekin.
5. Biyopsi aleti, 3 cm çapı 2 mm ve diş hattının 6 cm üzerinde, anteriora ve posteriora kadar 4 emme biyopsisi elde etmek için kullanın. Numuneyi, tuz ile nemlendirilmiş gazlı bez üzerine yerleştirmek için bir iğne kullanın.
6. Hastanın rektal kanamayı çıkarmaması için prosedürden 2 h 'ye kadar dikkat edin. RSB sonra ilk 24 h daha fazla rektal ve anal manipülasyon kaçının.

2. RSB bölümlerinin hazırlanması

1. Dokuyu düzeltmek için 6 saat boyunca rektal emiş biyopsisi% 4 paraformaldehit olarak yerleştirin. Doku hacmine göre 5 kat daha fazla bir fiksatif hacmi kullanın.
2. 11 saat boyunca patolojik doku kurutucu kullanarak dokuyu kurutur. Tüm programlanmış süreç aşağıdaki 5 adımda oluşur:
   1. Dokusunu formaldehit içine yerleştirin ve 1 h için düzeltin.
   2. 4 h için 75% etanol içinde doku yerleştirin.
   3. Mutlak etanol içinde doku yerleştirin (iki değişiklik, 1 h her).
   4. Doku mutlak etanol (iki değişiklik, 30 dk her) yerleştirin.
   5. Dokuyu ksilene yerleştirin (üç değişiklik, 1 saat her biri).
3. Dokusunu Parafin balmumu (58-60 °C) (üç değişiklik, 1 saat her) yerleştirin. Parafin bloklarında RSB dokularını katıştırın.
4. Doku tamamen tam bir bölüm uçağı ile maruz kadar bir mikrotome kullanarak parafin blokları Trim.
5. Bir mikrotome ile 0,4 μm bölümlere blokları kes.
6. Bölümleri düz bir plaka içine yaymak için izin vermek için her biri birkaç saniye için 45-50 °C su içine bölümleri yerleştirin.
7. Parafin bölümlerini slaytlar üzerine aktarın.
8. 3-5 h için 60 °C ' lik bir fırında slaytlar pişirin. çok uzun süre pişirmeyi kaçının, bu da antijenlerin kaybına yol açabilir.
9. Deparafinize slaytlar Ksilin içine yerleştirin (2 değişiklikler, 15 dk her).
10. Mutlak etanol içinde slaytlar hidrat, 95%, 80%, ve 75% etanol için 5 dk her. Daha sonra, onları reverse osmoz (RO)-arıtılmış suda 5 dakika daha durulayın.

3. antijen alımı

1. 200 ml ro-arıtılmış su ile 4 ml EDTA antijen alma tamponunu karıştırarak kalretinin alımı için çalışma seyreltme yapın. 99 mL RO-arıtılmış su ile 1 mL sitrik asit sodyum sitrat tamponu (100x) karıştırarak S100 ve PGP 9.5 alımı için çalışma dilüsyonları yapın.
   Not: Calretinin, EDTA alma çözümüyle tercihen alınabilir. Ancak, sitrik asit sodyum sitrat tampon, S100 ve PGP 9.5 alınması için daha uygundur.
2. Slaytları bir danışman boyama kavanozu içine yerleştirin. Alma çözeltisi ile kavanoz doldurun ve önceden ısıtılmış kaynar su banyosu içine yerleştirin. 20 dakika boyunca Kaynatıldıktan sonra, kavanozu su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Soğutma işlemi yaklaşık 10 dakika sürer. slaytları çıkarın ve fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yavaşça bir kez yıkayın.
3. Doku etrafında bir marker kalem ile bir daire çizin ve aşağıdaki prosedürler için ıslak bir kutu hazırlayın.

4. engelleme

1. 3 mL 30% H₂O₂ ile 27 ml ro-arıtılmış su karıştırarak çalışma seyreltmeleri yapın.
2. İki veya üç damla ekleyin 3% H₂O₂ çözüm dropwise doku üzerine peroksiformlar engellemek için. Çözüm daire taşması değil emin olmak için hemen H₂O₂ çözüm ekleyin. 20 dakika boyunca 37 °C ' lik kuluçte peroksiklenin engellenmesini gerçekleştirin.
3. Slaytları PBS ile hafifçe durulayın (üç yıkanması, her biri 5 dk.).
4. 5% Sığır serum albümin (BSA, 30 mL RO-arıtılmış su ile 1,5 g BSA tozu karıştırılarak hazırlanmış) ile 37 °C ' de 20 dakika boyunca slaytları engelleyin.
   Not:% 3 H₂O₂ ile engelleme, spesifik olmayan lekenin% 95 'ini engelleyebilir ve% 5 BSA ile engelleme, spesifik olmayan lekenin% 5 'ini engelleyebilir. Güvenilir bir sonuç elde etmek için iki yöntemi birleştirin.

5. antikor reaksiyonu

1. % 5 BSA çıkarın ve 50 μL primer antikor (calretinin, S100 veya PGP 9.5) ' i slayda ekleyin. Gece 4 °C ' de inküyün.
2. Slaytı PBS ile yıkayın (üç kez, her biri 3 dakika).
3. Bölüm için 50 μL polimer arttırıcı (reaktif A; bkz. malzeme tablosu) ekleyin ve 37 °c ' lik kuluçte 20 dakika boyunca inküye yapın. Ardından, slaytı PBS ile yıkayın (üç kez, her biri 3 dakika).
4. Bölüme 50 ikincil antikor B (keçi Anti-tavşan/fare IgG ikincil antikor) μL ekleyin ve 37 °C ' lik inkübte 30 dakika boyunca Kuluçk yapın. Bölüm PBS (üç kez, 5 dk her) ile yıkayın.

6.3, 3-diaminobenzidin ve hematoxylin boyama

1. 1,5 mL 'Lik bir tüpe 850 μL RO-arıtılmış su ekleyin ve 1 ml 3, 3-diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi toplam elde etmek için her reaktif için A, B ve 50 C sıralamadaki boyama reaktiflerini ( malzeme tablosunabakın) ekleyin. Eğer çökelti varsa, filtrasyon sonra çözüm kullanın.
2. Doku bölümüne DAB çalışma solüsyonu bir damla ekleyin ve 3-10 dk için leke. kahverengi boyama tespit edilinceye kadar slaytları oda sıcaklığında DAB 'de Inküte et. Bir aydınlık alan mikroskop kullanarak dikkatle izleyin. DAB çalışma çözümünü ışıktan uzak tutun. Sonra, 5 dakika boyunca PBS ile slayt yıkayın.
3. Yaklaşık 1 dakika boyunca çekirdekleri karşı koymak için bir damla hematoksilen ekleyin. Sonra, danışman kavanozu tutun ve yaklaşık 30-40 s için su bir damlasını altında yıkayın fazla boya kaldırılıncaya kadar. Doku bölümlerine zarar vermemek için dikkatli olun.
4. 25-30 s için PBS içeren bir danışman kavanozu içinde RSB slaytları batırın. Sonra, ayırt 1% hidroklorik asit-etanol 10 s. 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar yıkayın.
5. Hidrasyon ters sırada slaytlar susuz: 75%, 80%, 95%, ve mutlak etanol (5 dk her).
6. Slaytları ksillene (2 değişiklik, 5 dk.) maruz bırakmayın.
7. UltraClean montaj kullanarak lamel magazini monte edin. Mikroskop kullanarak görselleştirmeden önce slaytların kurumasına izin verin.

Sonuçlar

Toplam 318 hasta çalışmaya alındı. Tüm hastalarda RSB yapıldı ve dokularda calretinin, S100 ve PGP 9.5 için lekelenmiş. Yeni protokolüne dayalı tanı 97 durumlarda HD, 213 vakalarda HD olmayan ve 8 olguda HD şüphesi vardı. 132 cerrahi hastalar arasında, 99 hastada ameliyattan sonra tam kalınlıkta numunelerin immünostürlenerek HD tanısı konuldu. S100 ve PGP 9.5 boyama, 99 hastaların% 92 ve% 93 ' in sırasıyla hipertrofik sinir gövdeleri olduğunu gösterdi. 186 has...

Tartışmalar

Burada HD tanısı için RBS bölümlerini lekelemek için üç farklı immunhistokimyasal antikorları kullanarak bir prosedür açıklanmıştır. Tanı protokollerimizin duyarlılığı% 96,49 (% 95 CI, 0.88-0,99) ve özgüllük% 100 (% 95 0.97-1.00) oldu.

Protokolün en önemli adımları RSB ve antijen-antikorların reaksiyonu. Biyopsinin büyüklüğü, lekeme doğruluğunu belirler. Küçük bir biyopsi hassas bir tanı yapmak için yeterli doku sağlamaz, büyük bir biyopsi ise daha y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument