Diagnostic de la maladie de Hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la Calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5

Résumé

Ce protocole décrit le processus d’immunocoloration des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, la protéine de 9,5 et le produit du gène protéique. Cette nouvelle méthode de diagnostic adjuvant pour la maladie de Hirschspiral a des taux de sensibilité et de spécificité préférables.

Résumé

La maladie de hirschspiral (MH) est une maladie intestinale congénitale qui est cliniquement manifestée comme une incapacité à passer le méconium chez les nourrissons ou en tant que constipation à long terme chez les enfants. La biopsie d’aspiration rectale (RSB) pour déterminer l’absence de cellules ganglionnaires et l’hypertrophie neuronale est le test le plus précis pour le diagnostic de la MH à l’heure actuelle. La coloration traditionnelle de l’hématoxyline-éosine manque de sensibilité et de spécificité. La coloration de l’acétylcholinestérase ne peut pas être largement utilisée en raison de son processus complexe. Notre protocole novateur d’immunocoloration pour la calrétinine, la protéine et le produit du gène protéine 9,5 (PGP 9.5), que nous avons réalisé sur les rsbs, présente des taux de sensibilité et de spécificité élevés de 96,49% (intervalle de confiance de 95%, 0,88-0,99) et 100% (confiance de 95% de l’intervalle, 0,97-1,00), respectivement. Les segments touchés par la MH sont souvent présents comme l’absence de l’expression de la calrétinine, de la protéine et du PGP 9.5, qui sont des marqueurs de l’hypertrophie neurale dans le tissu sous-muqueuse. Ce protocole décrit le processus d’exploitation détaillé de cette nouvelle méthode de diagnostic.

Introduction

La maladie de hirschspiral (MH) est une affection intestinale congénitale commune caractérisée par un manque de cellules ganglionnaires dans différents segments du tractus intestinal distal¹. Le système nerveux entérique humain est formé lorsque l’invasion des cellules neuronales embryonnaires est achevée. S’il y a une perturbation du processus et que l’invasion ne parvient pas à se terminer, l’intestin distal du nouveau-né devient aganglionique². Cette condition potentiellement fatale est appelée la maladie de Hirschspiral. La prolifération, la motilité et la croissance intestinale sont les trois composantes principales de la colonisation réussie.

La coloration traditionnelle de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) d’une biopsie submuqueuse limitée ne peut pas atteindre un résultat aussi satisfaisant que la coloration H & E d’un tissu d’épaisseur totale obtenu par chirurgie. En outre, la coloration de l’acétylcholinestérase (AChE) du tissu d’aspiration rectal est théoriquement difficile en raison de sa sensibilité inadéquate, qui est de 91%, et le traitement complexe des sections^3,4congelées. Plusieurs autres marqueurs immunohistochimiques des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses qui peuvent être souillés dans des spécimens fixes et paraffines sont progressivement devenus les principaux diagnostics HD. La calrétinine est une protéine liant le calcium dépendante de la vitamine D qui n’est pas exprimée dans le plexus myentérique et sous-muqueuse des segments atteints de MH⁵. La protéine est exprimée dans les cellules dérivées de la crête neurale, comme les fibres nerveuses et les cellules gliales, qui présentent souvent une hypertrophie neuronale dans le tissu sous-muqueuse des segments atteints de MH⁶. Le produit du gène protéique 9,5 (PGP 9.5) colore de manière fiable les fibres nerveuses et les cellules ganglionnaires; La coloration PGP 9.5 agit comme un complément à la coloration de la calrétinine, en particulier dans les cas d’hypogangliose isolée. Une double coloration avec les résultats de 2, 9 et 9 peut diminuer le taux de faux-négatif et augmenter la sensibilité. Comme condition préalable, l’étude actuelle vise à assurer une spécificité et une sensibilité suffisantes de cette nouvelle méthode diagnostique. Notre protocole de roman a utilisé les trois marqueurs pour la discrimination de l’intestin aganglionique et des fibres nerveuses hypertrophiques. Une étude prospective de 318 enfants a été réalisée par notre laboratoire et publiée antérieurement sans protocole détaillé⁷. Le protocole détaillé et les précautions sont discutés dans cet article. Tous les nouveau-nés qui ont souffert d’un problème de défécation sévère depuis la naissance ou les enfants souffrant de constipation chronique excluant d’autres maladies courantes sont des candidats potentiels pour la biopsie d’aspiration rectale (RSB). Notre protocole novateur est adapté pour la coloration non seulement des RSBs mais aussi des biopsies d’épaisseur complète ou des spécimens chirurgicaux pour faire un diagnostic final.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Conseil d’éthique de la recherche de l’hôpital de l’Union de l’Université de science et de technologie de Huazhong.

1. biopsie d’aspiration rectale

1. Effectuer la biopsie d’aspiration rectale par un chirurgien pédiatrique bien formé et un assistant utilisant un système de biopsie rectale d’aspiration Rbi2 après avoir obtenu le consentement éclairé du tuteur.
   1. Effectuer des RSB sur les patients qui ont les indications suivantes: incapacité de passer le méconium chez les nourrissons ou les ballonnements à long terme avec ou sans constipation chez les enfants; les enfants souffrant de constipation à long terme qui ont besoin d’huile de paraffine pour terminer la défécation; occlusion intestinale ou perforation intestinale avec des raisons inconnues chez les enfants qui subissent une enterostomie.
      Nota: les contre-indications pour le RSB sont les suivantes: les enfants qui présentent des symptômes sévères, qui sont en mauvais état physique, ou qui ne peuvent pas tolérer le RSB; les enfants présentant une entérocolite à stade aigu; les enfants subissant une anastomose intestinale sans guérison complète.
2. Effectuer un lavement de rétention saline normale comme préparation intestinale 36 h avant la procédure pour éviter les selles molles et l’œdème excessif de la muqueuse. Ajouter la solution de sulfate de magnésium si l’enfant a une constipation sévère. Administrer la vitamine K (1 mg/kg) aux nouveau-nés.
   Remarque: ne pas effectuer de tests sanguins préopératoires ou administrer des antibiotiques, car ils ne sont pas nécessaires.
3. Mettez le patient en position de lithotomie. Enduire la surface du tube d’huile de paraffine. Insérez le tube arrondi 4-7 cm dans le rectum avec le trou latéral orienté vers les parois postérieures ou latérales.
4. Appliquez une pression douce sur le tube pour faciliter l’adhérence adéquate du trou latéral à la paroi rectale. Appuyez sur la gâchette et retirez immédiatement l’outil.
5. Utiliser l’instrument de biopsie pour obtenir 4 biopsies d’aspiration d’un diamètre de 2 mm à 3 cm et 6 cm au-dessus de la ligne dentaire, antérieurement et postérieure. Utiliser une aiguille pour placer l’échantillon sur une gaze humidifiée avec une solution saline.
6. Observez le patient jusqu’à 2 h après la procédure pour exclure les saignements rectaux. Évitez d’autres manipulations rectales et anales au cours des 24 premières heures après la RSB.

2. préparation des sections du RSB

1. Placer les biopsies d’aspiration rectale dans 4% paraformaldéhyde pendant 6 h pour fixer le tissu. Utiliser un volume fixatif 5 fois plus que le volume tissulaire.
2. Déshydrater le tissu à l’aide du déshydrateur tissulaire pathologique pendant 11 h. L’ensemble du processus programmé se compose des 5 étapes suivantes:
   1. Placer le tissu dans du formaldéhyde et le fixer pendant 1 h.
   2. Placer le tissu dans de l’éthanol à 75% pendant 4 h.
   3. Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 1 h chacun).
   4. Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 30 min chacun).
   5. Placer le tissu dans du xylène (trois changements, 1 h chacun).
3. Placer le tissu dans de la cire de paraffine (58-60 ° c) (trois changements, 1 h chacun). Incorporer les tissus RSB dans des blocs de paraffine.
4. Coupez les blocs de paraffine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que le tissu soit entièrement exposé avec un plan de coupe complet.
5. Coupez les blocs en sections de 0,4 μm avec un microtome.
6. Placer les sections dans de l’eau à 45-50 ° c pendant quelques secondes chacune pour permettre aux sections de se propager dans une assiette plate.
7. Transférer les sections de paraffine sur les glissières.
8. Cuire les lames dans un four à 60 ° c pour 3-5 h. Évitez de faire cuire trop longtemps, ce qui peut entraîner la perte des antigènes.
9. Placer les lames déparaffinées dans le xylène (2 changements, 15 min chacun).
10. Hydrater les lames dans de l’éthanol absolu, 95%, 80% et 75% d’éthanol pendant 5 min chacune. Ensuite, rincez-les à l’eau purifiée par osmose inverse (RO) pendant encore 5 min.

3. récupération d’antigènes

1. Faire des dilutions de travail pour la récupération de la calrétinine en mélangeant 4 mL de tampon de récupération de l’antigène EDTA avec 200 mL d’eau purifiée au RO. Faire des dilutions de travail pour la récupération de l’acide citrique et du PGP 9.5 en mélangeant 1 mL de tampon de citrate de sodium (100X) avec 99 mL d’eau purifiée au RO.
   Remarque: la Calrétinine peut être récupérée préférentiellement par la solution de récupération d’EDTA. Cependant, le tampon de citrate de sodium d’acide citrique est plus approprié pour la récupération de la solution et du PGP 9.5.
2. Placez les lames dans un bocal de coloration de Coplin. Remplissez le bocal avec une solution de récupération et placez-le dans un bain d’eau bouillante préchauffé. Après ébullition pendant 20 min, retirez le bocal du bain d’eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Le processus de refroidissement dure environ 10 min. Retirez les lames et rincez-les délicatement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Dessinez un cercle avec un stylo marqueur autour du tissu et préparez une boîte humide pour les procédures suivantes.

4. le blocage

1. Faire des dilutions de travail en mélangeant 3 mL de 30% H₂O₂ avec 27 ml d’eau roupurifiée.
2. Ajouter deux ou trois gouttes de 3% H₂O₂ solution goutte sur le tissu pour bloquer les peroxydates. Ajoutez rapidement la solution H₂O₂ pour vous assurer que la solution ne déborde pas du cercle. Effectuer le blocage des peroxydates dans un incubateur de 37 ° c pendant 20 min.
3. Rincez doucement les lames avec du PBS (trois lavages, 5 min chacun).
4. Bloquer les lames pendant 20 min à 37 ° c avec 5% d’albumine sérique bovine (BSA, préparée en mélangeant 1,5 g de poudre de BSA avec 30 mL d’eau purifiée au RO).
   Remarque: le blocage avec 3% H₂O₂ peut empêcher 95% de coloration non spécifique et le blocage avec 5% de BSA peut empêcher les autres 5% de coloration non spécifique. Combinez les deux méthodes pour obtenir un résultat fiable.

5. réaction antigène-anticorps

1. Retirer le 5% BSA et ajouter 50 μL d’anticorps primaires (calrétinine, 2, 8 ou PGP 9.5) à la diapositive. Incuber pendant la nuit à 4 ° c.
2. Lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
3. Ajouter 50 μL d’exhausteur de polymère (réactif A; voir tableau des matériaux) dans la section et incuber pendant 20 min dans un incubateur à 37 ° c. Ensuite, lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
4. Ajouter 50 μL d’anticorps secondaire B (anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin/souris) à la section et incuber pendant 30 min dans un incubateur à 37 ° c. Lavez la section avec du PBS (trois fois, 5 min chacune).

6.3, 3-diaminobenzidine et coloration de l’hématoxyline

1. Ajouter 850 μL d’eau purifiée dans un tube de 1,5 mL et ajouter les réactifs de coloration (voir tableau des matériaux) dans l’ordre a, B et C. Ajouter 50 μl de chaque réactif pour obtenir un total de 1 ml de solution de travail à la 3,3-diaminobenzidine (DAB). S’il y a des précipités, utilisez la solution après filtration.
2. Ajouter une goutte de solution de travail DAB à la section tissulaire et colorer pendant 3-10 min. Incuber les lames en DAB à température ambiante jusqu’à ce que la coloration brune soit détectée. Surveillez avec précaution à l’aide d’un microscope fond clair. Éloignez la solution de travail DAB de la lumière. Ensuite, lavez la lame avec du PBS pendant 5 min.
3. Ajouter une goutte d’hématoxyline pour contrer la coloration des noyaux pendant environ 1 min. Ensuite, tenez le bocal de Coplin et lavez-le sous un filet d’eau pendant environ 30-40 s jusqu’à ce que l’excès de colorant soit enlevé. Veillez à ne pas endommager les sections tissulaires.
4. Immerger les lames RSB dans un bocal de Coplin contenant du PBS pour 25-30 s. Ensuite, différencier dans 1% d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 10 s. laver les lames avec du PBS pendant 1 min.
5. Déshydrater les lames dans l’ordre inverse de l’hydratation: 75%, 80%, 95% et l’éthanol absolu (5 min chacun).
6. Exposer les lames au xylène (2 changements, 5 min chacun).
7. Montez la lamelle en utilisant un montage ultraclean. Laissez les lames sécher avant la visualisation à l’aide d’un microscope.

Résultats

Au total, 318 patients ont été inscrits à notre étude. Tous les patients ont subi une RSB, et les tissus ont été colorés pour la calrétinine, le c-9 et le PGP 9.5. Le diagnostic basé sur notre protocole de roman a été HD dans 97 cas, non-HD dans 213 cas, et soupçonné de la MH dans 8 cas. Parmi les 132 patients chirurgicaux, 99 patients ont été diagnostiqués avec la MH en immunostant des spécimens de pleine épaisseur après la chirurgie. La coloration de la protéine et d...

Discussion

Nous avons décrit ici une procédure utilisant trois anticorps immunohistochimiques différents pour colorer les sections RBS pour le diagnostic de la MH. La sensibilité de notre protocole diagnostique était de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), et la spécificité était de 100% (95% IC, 0,97-1,00).

Les étapes les plus critiques du protocole sont le RSB et la réaction antigène-anticorps. La taille de la biopsie détermine la précision de la coloration. Une petite biopsie ne fournira pas assez...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
calretinin antibody	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	antibody: primary antibody
S-100 antibody	MXB Biotechnologies	Kit-0007	antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	antibody: primary antibody
enhancer reagent	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	staining kit
Heat incubator	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000	instrument
microtome	Leica	leica RM2016	instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	instrument