JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает процесс иммуноокрашивания ректального всасывания биопсии для calretinin, белок S100, и гена белка продукта 9,5. Этот роман адъювантной диагностический метод для болезни Гиршпрунга имеет предпочтительнее чувствительность и специфичность ставок.

Аннотация

Гиршпрунга болезнь (HD) является врожденным кишечным заболеванием, которое клинически проявляется как неспособность пройти мекония у младенцев или как долгосрочный Запор у детей. Ректальное всасывание биопсии (RSB), чтобы определить отсутствие ганглиозных клеток и нейронная гипертрофия является наиболее точным испытанием для диагностики HD в настоящее время. Традиционный гематоксифлин-ээин окрашивание не имеет чувствительности и специфичности. Окрашивание ацетилхолинэстеразы не может быть широко использовано из-за его сложного процесса. Наш Роман протокол иммуноокрашивания для calretinin, белок S100, и белок гена продукта 9,5 (PGP 9,5), который мы провели на РСБС, экспонаты высокой чувствительности и специфичности ставки 96,49% (95% доверительный интервал, 0.88-0.99) и 100% (95% доверия интервал, 0.97-в), соответственно. В HD-пострадавших сегментов часто присутствуют как отсутствие экспрессии calretinin, белок S100, и PGP 9,5, которые являются маркерами нейронной гипертрофии в субслизистой ткани. Этот протокол описывает подробный операционный процесс этого нового диагностического метода.

Введение

Гиршпрунга болезнь (HD) является распространенным врожденным кишечным расстройством кишечника характеризуется отсутствием ганглиозных клеток в различных сегментах дистальной желудочно-кишечного тракта1. Нервной системы человека кишечной формируется, когда вторжение в эмбриональных нервных клеток завершена. Если есть нарушение процесса и вторжение не удается завершить, дистальной кишечник новорожденного становится аангликаноническим2. Это потенциально смертельное состояние называется болезнью Гиршпрунга. Пролиферация, подвижность, и рост кишки три основных компонента успешной колонизации.

Традиционный гематоксифлин и ээин (H & E) окрашивание ограниченной субмукосной биопсии не может достигать удовлетворительного результата, так как окрашивание H & E полной толщины ткани, полученной от хирургии. Дополнительно, ацетилхолинэстеразы (боль) окрашивание ткани ректальной всасывающей является теоретически сложной задачей из-за его недостаточной чувствительности, которая составляет 91%, а сложная обработка замороженных разделов3,4. Несколько других иммуногинохимических маркеров ганглиозных клеток и нервных волокон, которые могут быть окрашены в формалин-фиксированной и парафин-встроенные образцы постепенно становится основной HD диагностики. Кальретиноин-это витамин D-зависимый кальций-связывающий белок, который не выражается в миокишечной и субслизистой сплетении HD-пораженные сегменты5. Белок S100 выражается в клетках, полученных от нейронных гребня, таких как нервные волокна и глиальных клеток, которые часто присутствуют нейронная гипертрофия в submucosal ткани HD-пострадавших сегментов6. Белок ген продукт 9,5 (PGP 9,5) надежно окрашивает нервные волокна и ганглиозных клеток; PGP 9,5 окрашивание выступает в качестве дополнения к кальретиноин окрашивание, особенно в случаях изолированных гипогантоз. Двойное окрашивание с S100 и PGP 9,5 может уменьшить ложноотрицательные скорости и увеличить чувствительность. В качестве предварительного условия, текущее исследование направлено на обеспечение адекватной специфичности и высокой чувствительностью этого романа диагностического метода. Наш Роман протокол использовал все три маркеры для дискриминации аглионинического кишечника и гипертрофических нервных волокон. Проспективное исследование 318 детей было выполнено нашей лабораторией и ранее Опубликовано без подробного протокола7. Подробный протокол и меры предосторожности обсуждаются в этой статье. Любые новорожденные, которые страдали от тяжелой дефекации с момента рождения или дети с хроническими запорами, исключая другие распространенные заболевания, являются потенциальными кандидатами для биопсии ректальной кишки (RSB). Наш Роман протокол подходит для окрашивания не только RSBs, но и полной толщины биопсии или хирургических образцов, чтобы сделать окончательный диагноз.

протокол

Этот протокол был одобрен Советом по этике исследований в больнице союза Huazhong университета науки и техники.

1. ректальная всасывающая биопсия

  1. Выполните ректальное всасывание биопсии хорошо обученный детский хирург и помощник с помощью Rbi2 всасывания ректальной биопсии системы после получения информированного согласия опекуна.
    1. Выполните RSB на пациентах, которые имеют следующие указания: неспособность пройти мекония у младенцев или долгосрочный вздутие живота с или без запоров у детей; детям с долгосрочными запорами, которым необходимо парафиновое масло для полной дефекации; кишечная непроходимость или перфорация кишечника с неизвестными причинами у детей, проходящих энтеростомию.
      Примечание: противоприведенные для RSB: дети, которые имеют серьезные симптомы, которые находятся в плохом физическом состоянии, или которые не могут терпимыми RSB; у детей с острым энтероколита; у детей проходит кишечный анастомоз без полного заживления.
  2. Выполните нормальный клизмы удержания соли, как подготовка кишечника 36 h перед процедурой, чтобы избежать сыпучих стула и чрезмерного отека слизистой оболочки. Добавьте раствор сульфата магния, если у ребенка сильный запор. Вводить витамин к (1 мг/кг) новорожденным.
    Примечание: не выполняйте предоперационные анализы крови и не администрировать антибиотики, так как они не требуются.
  3. Положите пациента в положение литотомии. Смазать поверхность трубки парафинным маслом. Вставьте тупую трубку 4-7 cm в прямую кишку с боковым отверстием перед задней или боковой стенки.
  4. Нанесите мягкое давление на трубку, чтобы облегчить адекватное сцепление бокового отверстия к стенке прямой кишки. Нажмите на курок и немедленно вывести инструмент.
  5. Используйте прибор для биопсии, чтобы получить 4 ассасные биопсии диаметром 2 мм на 3 см и 6 см выше зубоврачебной линии, спереди и сзади. Используйте иглу, чтобы поместить образец на марлю, смоченную физиологическим раствором.
  6. Соблюдайте пациента до 2 ч после процедуры, чтобы исключить ректальное кровотечение. Избегайте дальнейших ректальных и анальных манипуляций в первые 24 ч после RSB.

2. Подготовка секций РСБ

  1. Поместите биопсию ректального всасывания в 4% параформальдегида на 6 ч, чтобы зафиксировать ткань. Используйте фиксативный объем в 5 раз больше, чем объем ткани.
  2. Обезвоживает ткани с помощью патологического осушителя ткани на 11 ч. Весь запрограммированный процесс состоит из следующих 5 шагов:
    1. Поместите ткань в формальдегид и закрепите на 1 ч.
    2. Поместите ткань в 75% этанола на 4 ч.
    3. Поместите ткань в абсолютный этанол (два изменения, по 1 ч каждый).
    4. Поместите ткань в абсолютный этанол (два изменения, 30 мин каждый).
    5. Поместите ткань в ксилол (три изменения, по 1 ч каждая).
  3. Поместите ткань в парафин (58-60 ° c) (три изменения, по 1 ч каждая). Встраивать ткани RSB в парафиновые блоки.
  4. Обрезать парафиновые блоки с помощью микротома, пока ткань не будет полностью разоблачена полным разделом плоскости.
  5. Cut блоков в 0,4 мкм разделы с микротомом.
  6. Поместите разделы в 45-50 °C воды в течение нескольких секунд каждый, чтобы позволить разделы распространяться в плоскую тарелку.
  7. Перенесите секции парафина на слайды.
  8. Выпекать слайды в духовке 60 ° c для 3-5 h. Избегайте выпечки слишком долго, что может привести к потере антигенов.
  9. Поместите деотъеззинизированные слайды в ксилол (2 изменения, по 15 мин каждый).
  10. Гидрат слайдов в абсолютном этанола, 95%, 80%, и 75% этанола в течение 5 мин каждый. Затем промойте их в обратном осмосе (RO)-очищенной воды еще на 5 мин.

3. антиген извлечение

  1. Сделать рабочие разведения для calretinin извлечения путем смешивания 4 мл буфера ЭДТА извлечения антигена с 200 мл RO-очищенной воды. Сделать рабочие разведения для S100 и PGP 9,5 поиска путем смешивания 1 мл лимонной кислоты буфера цитрата натрия (100X) с 99 мл RO-очищенной воды.
    Примечание: Кальретиноин может быть извлечен преимущественно по поиску решения ЭДТА. Однако, лимонная кислота буфер цитрата натрия больше подходит для извлечения S100 и PGP 9,5.
  2. Поместите слайды в coplin окрашивания банку. Заполните банку раствором для извлечения и поместите его в разогретую ванну с кипящей водой. После кипячения в течение 20 мин снимите банку с водяной ванны и дайте ему остыть до комнатной температуры. Процесс охлаждения занимает около 10 мин. удалите слайды и аккуратно промойте их один раз с фосфат-буферизованные физиологический раствор (PBS).
  3. Нарисуйте круг с маркер перо вокруг ткани и подготовить мокрый ящик для следующих процедур.

4. Блокирование

  1. Сделать рабочие разведения путем смешивания 3 мл 30% H2O2 с 27 мл ro-очищенной воды.
  2. Добавьте две или три капли 3% H2O2 раствор дропают на ткань, чтобы блокировать пероксидаты. Быстро добавьте раствор H2O2 , чтобы гарантировать, что решение не будет переполнено из круга. Выполните блокирование пероксидатов в инкубаторе 37 °C в течение 20 мин.
  3. Промойте слайды мягко с PBS (три моет, 5 мин каждый).
  4. Блокировать слайды для 20 мин при температуре 37 ° c с 5% бычьей сыворотки альбумина (БСА, подготовленный путем смешивания 1,5 г порошка БСА с 30 мл RO-очищенной воды).
    Примечание: блокировка с 3% H2O2 может предотвратить 95% неспецифического окрашивания и блокировки с 5% БСА может предотвратить другие 5% неспецифического окрашивания. Объедините два метода для получения надежного результата.

5. антиген-антитело реакция

  1. Удалите 5% БСА и добавьте 50 мкл первичного антитела (S100, или PGP 9,5) на слайд. Инкубировать ночь при температуре 4 °C.
  2. Промойте слайд с PBS (три раза, 3 мин каждый).
  3. Добавьте 50 мкл полимерного усилителя (реагента а; см. таблицу материалов) к разделу и Инкубируйте его в течение 20 минут в инкубаторе 37 °c. Затем промойте слайд с PBS (три раза, 3 мин каждый).
  4. Добавить 50 мкл вторичного антитела B (коза анти-кролик/мышь IgG среднее антитело) к разделу и инкубировать в течение 30 минут в инкубаторе 37 °C. Вымойте раздел с PBS (три раза, 5 мин каждый).

6.3, 3-Диаминобензидин и окрашивание гематоксилин

  1. Добавьте 850 мкл очищенной воды в трубку 1,5 мл и добавьте окрашивание реагентов (см. таблицу материалов) в заказе a, B и C. Добавьте 50 мкл каждого реагента, чтобы получить в общей сложности 1 мл рабочего раствора 3, 3-диаминобензидина (мазок). Если есть осадки, используйте раствор после фильтрации.
  2. Добавить каплю рабочего решения МАЗОК в раздел ткани и пятно на 3-10 мин. инкубировать слайды в МАЗОК при комнатной температуре, пока коричневый окрашивание не обнаружено. Монитор тщательно с помощью брайто-полевой Микроскоп. Держите рабочее решение МАЗа вдали от света. Затем промойте слайд с PBS в течение 5 минут.
  3. Добавьте каплю гематоксилина, чтобы не испачкать ядра примерно на 1 мин. После этого, держите банку coplin и вымойте его под струйкой воды для приблизительно 30-40 s до тех пор пока излишняя краска не извлечься. Будьте осторожны, чтобы не повредить секции ткани.
  4. Погрузите слайды RSB в банку coplin, содержащий PBS для 25-30 s. Затем дифференцировать в 1% соляной кислоты-этанол для 10 с. Вымойте слайды с PBS в течение 1 мин.
  5. Обезвоживает слайды в обратном порядке гидратации: 75%, 80%, 95%, и абсолютный этанол (5 мин каждый).
  6. Подвергать слайды ксилола (2 изменения, 5 мин каждый).
  7. Крепление покрытоскольжения с использованием ультрабережливого монтажа. Разрешить слайды высохнуть перед визуализацией с помощью микроскопа.

Результаты

Всего в нашем исследовании было зачислено 318 пациентов. Все пациенты прошли RSB, и ткани были окрашены для calretinin, S100, и PGP 9,5. Диагноз основан на нашем романе протокол HD в 97 случаях, не HD в 213 случаях, и подозреваемых в HD 8 случаев. Среди 132 хирургических пациентов, 99 пациентов б...

Обсуждение

Здесь мы описали процедуру с использованием трех различных иммуногинахимических антител, чтобы испачкать секции РБС для диагностики БГ. Чувствительность нашего диагностического протокола составила 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), а специфика составила 100% (95% ДИ, 0.97-в).

Самыми критически...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Вэйбинг Танг за его большую помощь в обеспечении лаборатории съемок. Эта статья поддержана исследованием общественного благосостояния, и специальные фонды были получены от национального запланирования здоровья и семьи Кита (Грант No. 201402007).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
calretinin antibodyMXB BiotechnologiesMAB-0716 170416405cantibody: primary antibody
S-100 antibodyMXB BiotechnologiesKit-0007antibody: primary antibody
PGP9.5 antibodyShanghai long island antibody Co. LtdR-0457-03antibody: primary antibody
enhancer reagentMXB BiotechnologiesKIT-9902-A 170416405aantibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary AntibodyMXB BiotechnologiesKIT-9902-Bantibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C)MXB BiotechnologiesDAB-0031staining kit
Heat incubatorShanghai yiheng instrument Co. LtdDHP-9082instrument
Rbi2 suction rectal biopsy systemAus Systems Pty Ltd, South Australia, AustraliaCP1200 HP1000 SS1000instrument
microtomeLeicaleica RM2016instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X)MXB BiotechnologiesMVS-0101antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydratorwuhan junjie electronic Co. LtdJT-12Finstrument

Ссылки

  1. Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
  2. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
  3. Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
  4. Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
  5. Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
  6. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  7. Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
  8. Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
  9. Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
  10. Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
  11. Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
  12. Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
  13. Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
  14. Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
  15. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  16. Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
  17. Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146S10095

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены