几内亚猪模型心肌损伤后 hiPSC-derived 衍生心肌贴片的植入

摘要

在这里, 我们提出了一个方案, 诱导左心室内皮损伤, 然后植入心肌贴片, 从人类 ips 细胞心肌细胞在豚鼠模型中获得。

摘要

由于成人哺乳动物心脏再生能力有限, 心肌梗死导致心肌细胞不可逆转的丢失。这种心脏肌肉质量的损失会导致心力衰竭。除了心脏移植, 没有治疗终末期心力衰竭的治疗方案。在器官捐献者短缺的情况下, 需要器官独立的治疗方式。左心室辅助设备是一个很有前途的治疗选择, 然而, 特别是作为目的地治疗, 其副作用, 如中风, 感染和出血的限制。近年来, 研究了几种心脏修复策略, 包括干细胞注射、心脏祖细胞或心肌组织工程。最近在细胞生物学方面的改进使来自人类诱导的多能干细胞 (iPSC) 的大量心肌细胞分化。目前正在评估的心脏修复策略之一是移植人工心脏组织。工程心脏组织 (EHT) 是一个三维体外生成的心肌细胞网络, 具有本地心脏组织的功能特性。我们已经创造了由 hiPSC 衍生的心肌细胞的 eht 斑块。本文提出了一种诱导豚鼠左心室心肌损伤的方案, 然后在左心室壁植入 hiPSC 衍生 EHT。

引言

在我们老龄化的人口中, 心力衰竭患者的数量正在增加。对于终末期心力衰竭, 原位心脏移植是唯一的治疗选择。然而, 特别是在欧洲国家, 器官捐献者日益短缺。因此, 替代治疗方案是必要的。最近在机械循环支持方面取得的成就很有希望, 但特别是在长期运行中, 受到出血、泵血栓形成和感染并发症等副作用的限制¹。

成人心脏的内源性再生能力极其有限。因此, 心脏再生疗法可能成为终末期心力衰竭患者^{2,3 的}替代治疗方案。不同的技术, 包括干细胞注射或组织工程的方法已经描述^{了 3,4,5}。

人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 以及人类胚胎干细胞 (hESC) 可以有效地分化为自发跳动的人^{心肌细胞 6,}这是心脏再生领域的一项重大成就。疗法。

为了在心肌梗死后更换心肌和改善心脏衰竭的功能, 存活适量的心肌细胞及其与原生心脏的机械和电耦合是必不可少的。为了研究人 iPS 细胞源性心肌细胞心脏再生疗法的潜力, 需要一个合适的研究模型。理想的模型应该具有成本效益, 并具有类似人类的生理和电生理。从这个角度来看, 像猪这样的大型动物模型是理想的, 然而, 这些实验非常昂贵, 为了看到对左心室的影响, 需要大量的心肌细胞来取代相关数量的心肌细胞在猪梗塞模型中的功能。

为了回答人类细胞心脏再生的基本生物学问题, 例如细胞存活、血管化和电耦合, 小动物模型更为合适。从现有的小动物模型来看, 与老鼠和老鼠相比, 豚鼠是最有用的物种, 因为它们的电生理更类似于人类^的情况.在这个豚鼠模型中, 我们诱发了左心室的经膜冷冻损伤。诱导心肌梗死一周后进行三维、自发跳动的 hips 细胞源性心肌细胞贴片。通过组织学检查, 对植入术后28天的心肌细胞存活率进行评估。

研究方案

动物得到了符合实验动物资源研究所编写并由国立卫生研究院出版的《实验动物原理指南》的人道护理。所有动物议定书都得到了负责的地方当局的批准 (' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt hamburg ' ' '/动物议定书 # 109/16)。

1. 获取动物

1. 商业获得的豚鼠体重500–600克。
2. 将它们放在常规条件下的动物笼子里。饲料标准大鼠和蒸压水的。

2. 经胸超声心动图

1. 将豚鼠放入诱导室, 用异氟醚麻醉动物 (2-3%)。检查麻醉的深度, 缺乏对脚趾夹紧的反应。
2. 将麻醉后的豚鼠放置在温暖的平台 (40–42°c) 上的仰视位置。通过鼻锥继续麻醉 (异氟醚 1.5-2%)
3. 用电动动物剃须刀对豚鼠进行剃须和脱毛。
4. 应用预热 (~ 25°c) 超声换能器凝胶。使用配备高于 15 MHz 的传感器频率的超声心动图系统。
5. 通过将换能器放置在几内亚的情况下, 获得二维的准轴长轴视图, 从右颈朝左腿的猪胸, 并记录长轴 b 模式图像在主动脉瓣的平面与 LV 先端的并发可视化。探讨术前左心室功能。
6. 将传感器旋转90°度 , 以获得在状中的短轴 b 模式视图。
   请注意:然后立即将动物转移到 OR 表中。该动物被连续麻醉与3% 异氟烷。注射 0.05 mg/kg 阿托品 (i.m.), 以避免机械通气时支气管分泌物增加。

3. 手术

1. 心肌梗死的诱导
   1. 用 21 G 针和10毫升注射器注射 4-5 mg/kg carpropen 和 0.05 mg/kg 丁丙诺非术, 用于皮下镇痛。0.5 mg/kg 阿托品在皮下注射 21 G 针和10毫升注射器。
   2. 将豚鼠放在背上, 用面罩覆盖口腔和鼻子进行麻醉。通过捏后脚 (缺乏踏板反射) 检查麻醉的深度。
   3. 把豚鼠的腿摊开, 用胶带固定位置。
   4. 用电动剃须刀刮掉麻醉动物的胸部和气管区域。广泛使用碘基擦洗对该地区进行消毒, 然后是80% 的乙醇。重复此消毒步骤两次。
   5. 在气管区域进行1.5 厘米的垂直切口, 并平直地解剖覆盖气管的肌肉, 直到你看到气管。用 18 G i. v. 插管刺穿气管, 并将插管的柔性部分作为气管管插入。
   6. 将气管管连接到动物呼吸器, 以便在手术过程中不断给豚鼠通气。
      请注意:现在, 通过气管管使用异氟醚3% 保持麻醉 (灵感辅助通气, 最大吸气压力, 呼吸速率: 100–120/min, 峰值灵感压力: 18-22 厘米的汞使用 peec 通风, 而胸部是开放的).
   7. 通过计算从第一个肋间空间开始的肋骨空间来确定第5个肋间空间。用剪刀和推子在豚鼠左侧的第5个肋间空间上进行2厘米的水平切口。插入小型动物牵引器。用电烧来解剖肌肉, 直到达到肋间肌肉, 切除皮下组织后可以看到。
   8. 用推子轻轻解剖肋间肌肉, 直到达到胸膜空间, 可以看到前面的左肺。将牵引器插入肋骨之间, 并小心地打开, 直到获得心脏的良好视图。
   9. 用剪刀打开左前心室壁区域约1厘米的心包。在诱导左心室滑块损伤时, 将压缩放在左肺上, 以保护其免受损伤。
   10. 将横截面直径为0.5 厘米的腐蚀金属邮票 (铝) 的尖端放入液氮中3分钟。
   11. 将氮气冷却探头按在心脏左前壁上30秒。然后使用电焊铁 (250°c) 将其与心脏分离, 该电焊铁被放置在邮票内, 以使其升温。重复此过程 3次, 以获得经膜外心肌损伤。观察心肌的漂白。
   12. 用最大压力充气肺部 (通过夹紧呼吸机的流出管 2次), 以避免肺肺肺肺肺不张。从肋间空间取下牵引器。
   13. 用两个3-0 的缝合线缝合肋骨。用4-0 的跑步缝合线缝合肋骨上的肌肉。对于关闭皮肤使用5-0 缝合单针。
   14. 将异氟醚降低到1%。当动物自发呼吸时, 取出气管管, 并继续使用面罩 (异氟醚 2%-3%) 进行麻醉。
   15. 通过捏后肢以监测足够深度的麻醉来确保没有反射。然后使用单个8-0缝合关闭气管的穿刺部位。用三个单粘4-0 缝合伤口。
   16. 在接下来的5天内, 使用丁丙诺非 (每 12小时 0.05 mg/kg) 和 carprofen (每 24小时 5 mg/kg) 进行止痛药。
2. EHT 植入术 (冷冻损伤后 7天)
   1. 将豚鼠放入诱导室, 用异氟烷麻醉动物, 检查麻醉深度, 以缺乏对脚趾夹紧的反应。
   2. 在麻醉诱导后, 用 21 g 针和10毫升注射器, 在皮下注射 4-5 mg/kg carpropen 和 0.05 Mg/kg 丁丙诺非。将豚鼠放在背上, 用面罩覆盖口腔和鼻子进行麻醉。
      请注意:麻醉的充分性应通过捏后脚来检查。
   3. 铺开豚鼠的腿, 用胶带固定位置。
   4. 按照步骤3.1.4 中的描述-3.1.6 进行手术前的准备。使用剪刀和推子在左侧侧的疤痕区域进行2厘米的水平皮肤切口。
   5. 用电烧轻轻解剖胸膜外粘连。用剪刀小心地打开胸膜空间。插入肋骨摊铺机以露出心脏。
   6. 与周围健康的心肌相比, 用苍白的颜色直观地识别梗死的区域。将工程心脏组织贴膜置于梗死区。
   7. 用两个8-0 保护它缝合在两侧。确保在心脏的非梗塞区域固定补丁 (图 1)。用压力充气肺部, 以避免肺肺不张。从肋间空间取下牵引器。
   8. 用两个3-0 的缝合线缝合肋骨。用4-0 的跑步缝合线缝合肋骨上的肌肉。对于关闭皮肤使用5-0 缝合单针。
   9. 将异氟醚降低到1%。当动物自发呼吸时, 取出气管管, 并继续使用面罩 (异氟醚 2%-3%) 进行麻醉。
   10. 通过捏后肢以监测足够深度的麻醉来确保没有反射。然后使用单个8-0缝合关闭气管的穿刺部位。用三针4-0 缝合伤口。
   11. 在接下来的5天内, 使用丁丙诺非 (每 12小时 0.05 mg/kg) 和 carprofen (每 24小时 5 mg/kg) 进行止痛药。
   12. EHT 植入术四周后进行经胸超声心动图 (如步骤2所述), 以监测 LV 功能随着时间的推移。
       请注意:在 EHT 植入术前和植入术后4周内监测 LV 功能, 以改善 EHT 植入术改善心功能
   13. 对 IACUC 批准的动物进行安乐死, 并手术外植心脏进行进一步分析。

结果

该豚鼠模型是研究 Hepsc 衍生的 eht 斑块植入后心脏再生的合适模型。它可重复地导致大的经膜外心肌损伤。疤痕大小在冷冻损伤后四周由组织学评估。梅森三色染色显示大的横突疤痕 (图 2)。疤痕大小在大量受伤的动物身上是相似的, 反映了高度的重现性⁸。平均25% 的左心室心肌被瘢痕组织所取代。肌营养不良染色显示大的心肌移植部分重新移植疤痕 (

讨论

有多种小动物模型可用于研究细胞移植对^{受伤心脏的}影响 9^{,10, 11.}我们选择了豚鼠模型, 因为所有小动物模型, 它的 (电子) 生理最接近于人类。小动物模型的优点是住房简单、成本可控、劳动力少。与小鼠和大鼠相比, 豚鼠心脏 (电) 生理更类似于人类。特别是心脏频率较低 (~ 250/min), 心室动作电位呈高原期, 钾电流 i_kr对?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055