השרשת נגזר hiPSC תיקונים שריר הלב לאחר פציעה שריר הלב במודל שפן

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה אינדוקציה של שמאל cryoinjury חדרית ואחריו ההשתלה של תיקון שריר הלב, נגזר iPS-התא האנושי cardiomyocytes במודל של שפן.

Abstract

בשל יכולת התחדשות מוגבלת של הלב ביונקים למבוגרים, אוטם שריר הלב גורמת לאובדן בלתי הפיך cardiomyocytes. אובדן זה של כמויות רלוונטיים של שריר הלב מסה יכול להוביל לאי-ספיקה. מלבד השתלת לב, אין אפשרות טיפול מרפא עבור לאי-ספיקה סופנית. בתקופות של מחסור תורם איברים, איבר עצמאי לטיפול לאופנים נחוצים. שמאל-חדרית לסייע התקנים הם אפשרות טיפול מבטיח, אולם, במיוחד כמו טיפול היעד, מוגבל על ידי שלה תופעות הלוואי כמו שבץ, זיהומים, לפרקים. בשנים האחרונות נחקרו מספר אסטרטגיות תיקון הלב כולל הזרקת תאי גזע, לב אבות או הנדסת רקמות שריר הלב. השיפורים האחרונים ב ביולוגיה של התא מאפשרים הבידול של כמויות גדולות של cardiomyocytes שמקורם בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSC). אחת האסטרטגיות תיקון הלב כעת תחת הערכה היא להשתיל רקמה לב מלאכותי. רקמת הלב מהונדסים (בובה) היא רשת תלת מימדי cardiomyocyte שנוצר במבחנה, עם מאפיינים פונקציונליים של רקמת הלב מקורית. יצרנו בובה-תיקוני מ cardiomyocytes hiPSC נגזר. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור אינדוקציה של שמאל cryoinjury חדרית שריר הלב בשפן, ואחריו השרשת hiPSC נגזר בובה על הקיר השמאלי חדרית.

Introduction

מספר החולים עם אי ספיקת לב הולכת וגוברת שלנו הזדקנות האוכלוסייה. לאי ספיקת לב בשלב הסופי, השתלת לב orthotopic היא האפשרות הטיפול המרפא בלבד. עם זאת, במיוחד במדינות אירופה, יש מחסור התורם הגוברת איברים. לכן, אפשרויות טיפול אלטרנטיבי נחוצים. ההישגים האחרונים בתמיכה הדם מכני מבטיחים, אבל במיוחד לטווח הארוך לרוץ, מוגבל על ידי שלה תופעות לוואי כמו דימום, משאבת פקקת, סיבוכים זיהומיות¹.

יכולת התחדשות אנדוגני של הלב האנושי למבוגרים מוגבלת מאד. לכן, טיפולים התחדשות לב עלול להפוך אפשרות טיפול אלטרנטיבי עבור^2,חולי אי ספיקת לב בשלב הסופי³. טכניקות שונות כולל הזרקת מבוססי תאי גזע תאים או רקמות גישות הנדסה כבר תיאר^3,4,5.

תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC), כמו גם תאי גזע עובריים (hESC) ניתן ביעילות להבחין להכות ספונטני cardiomyocytes האנושי⁶, אשר כבר הישג גדול בשטח של הלב רגנרטיבית טיפולים.

כדי להחליף את שריר הלב לאחר אוטם שריר הלב וכדי לשפר את התפקוד של הלב כושל, הישרדות של מספר מתאים של cardiomyocytes ו שלהם מכניים וחשמליים צימוד עם הלב המקורי הוא חיוני. כדי לחקור את הפוטנציאל של הלב משובי טיפולים עם cardiomyocytes תא נגזר iPS אנושי, דרושה מודל מחקר מתאימים. המודל האידיאלי צריך להיות חסכונית ויש להם פיזיולוגיה אנושית אלקטרופיזיולוגיה. מודלים גדולים בעלי חיים כמו חזירים יהיה אידיאלי מנקודת המבט הזו, אולם, הניסויים האלה יקרים מאוד ולא כמויות גדולות של cardiomyocytes יהיה צורך להחליף מספר cardiomyocytes הרלוונטיים על מנת לראות תופעות מצד שמאל חדרית פונקציית במודל אוטם חזיר.

לענות על שאלות ביולוגיות יסודי לקראת התחדשות לב מבוססת תא אנושי, למשל, הישרדות cell, vascularization וצימוד חשמלי, מודלים בעלי חיים קטנים מתאימים יותר. מן הדגמים בעלי חיים קטנים זמינים, שפן הוא המין השימושי ביותר, בהשוואה לעכברים, אלקטרופיזיולוגיה שלהם דומה יותר מקרוב המצב בני⁷. במודל זה שפן, אנחנו המושרה על cryoinjury transmural של החדר השמאלי. שבוע לאחר הגיוס של אוטם שריר הלב השרשה של תלת ממדי, להכות ספונטני הירכיים-תא נגזר cardiomyocyte תיקון בוצעה. הישרדות cell Cardiomyocyte הוערך 28 ימים לאחר ההשתלה בבדיקה היסטולוגית.

Protocol

בעלי חיים קיבל טיפול אנושי בדרישות המדריך העקרונות של חיות מעבדה, שהוכנו על ידי המכון של מעבדה חיה המשאבים, שפורסם על ידי מכוני הבריאות הלאומיים. כל הפרוטוקולים בעלי חיים אושרו על-ידי הרשות המקומית אחראית (' Amt לדנציג Gesundheit und Verbraucherschutz, המבורג Hansestadt"/ בעל חיים פרוטוקול # 109/16).

1. לקבל חיות

1. מסחרית להשיג נקבה שרקנים במשקל של 500-600 גרם.
2. בית אותם בתנאים רגילים בעלי חיים בכלובים. להאכיל עכבר סטנדרטי האוכל ואת המים בלוק לספירה libidum.

2. אקו אקו

1. למקם את שפן תא אינדוקציה, עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין (2-3%). בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה הבוהן-בלחץ.
2. הצב שפן anesthetized על פלטפורמה התחממות כדור הארץ (40-42 ° C) במצב פרקדן. המשך הרדמה באמצעות קונוס האף (איזופלוריין-1.5-2%)
3. לגלח, depilate בית החזה pig´s גינאה באמצעות של גילוח שיער בעלי חיים חשמלי.
4. החל ג'ל מתמר אולטרסאונד prewarmed (~ 25 ° C). השתמש מערכת אקוקרדיוגרפיה הינו מצויד עם ממירי תדר גבוה יותר מאשר 15 מגה-הרץ.
5. רוכשים מימדי מתחת ציר זמן תצוגות על-ידי הצבת המתמר על בית החזה חזיר guinea´s מול מהצוואר ימינה לכיוון רגלו השמאלית ואת ציר זמן שיא B-מצב תמונות במישור שסתום אבי העורקים עם ויזואליזציה בו-זמניות של LV השיא. חיקרו בפונקציה שמאל-חדרית שטרם-נותחו.
6. הפעל המתמר ב- 90° מעלות כדי לקבל מבט קצר ציר B-מצב רמת אמצע-papillary.
   הערה: החיה ואז מועבר מיד או הטבלה. החיה הוא מורדם ברציפות עם 3% איזופלוריין. אטרופין 0.05 מ"ג/ק"ג (i.m.) מוזרק כדי למנוע הפרשת מוגברת במהלך אוורור מכני.

3. ניתוח

1. אינדוקציה של אוטם שריר הלב
   1. להזריק carprofen 4-5 מ"ג/ק"ג ו- 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין על שיכוך כאבים subcutaneously עם מחט 21 G ומזרק 10 מ"ל. 0.5 מ ג/ק ג אטרופין מוזרק subcutaneously עם מחט 21 G ומזרק 10 מ"ל.
   2. במקום שפן על גבו ולשמור הרדמה עם facemask כיסוי הפה והאף. בדוק את עומק הרדמה על ידי צובט את הרגליים האחוריות (חוסר רפלקס פדלים).
   3. ופשקו את הרגליים של חזירים גינאה ולתקן את המיקום באמצעות הקלטת.
   4. מגלח את החזה, אזור הנשימה של החיה anesthetized עם מכונת גילוח חשמלית. לחטא את האזור נרחב באמצעות פילינג המבוסס על יוד, ואחריו 80% אתנול. חזור על שלבים חיטוי פעמיים.
   5. לבצע חתך אנכי של 1.5 ס מ באזור והכו אותי ומנתחים שמותחת את השרירים מכסה קנה הנשימה עד שתראו. את קנה הנשימה. ניקוב קנה הנשימה עם 18 גרם הזרקה והכנס את חלק גמיש הצינורית כמו צינור הנשימה.
   6. לחבר את הצינור בקנה הנשימה בעלי חיים מסכת סינון אוויר לנשום באופן רציף שפן במהלך ההליך.
      הערה: עכשיו ההרדמה נשמר עם איזופלוריין % 3 דרך הצינור בקנה הנשימה (השראה בסיוע אוורור עם השראה המרבי לחץ, קצב הנשימה: 100-120/דקה, שיא הלחץ השראה: 18-22 ס מ כספית באמצעות ציוץ-איוורור כאשר החזה פתוח ).
   7. לזהות לחלל הבין-צלעי^th 5 על ידי ספירת החללים צלעות מתחיל ברווח הבין-צלעי הראשון. לבצע חתך אופקי של 2 ס מ על המרחב הבין-צלעי החמישי בצד שמאל של שפן באמצעות פינצטה ומספריים. הכנס מפסק בעלי חיים קטנים. לנתח את שרירי עם electrocautery עד השרירים הבין-צלעי נגישים, אשר ניתן לראות לאחר הסרת הרקמה התת עורית, נגישים.
   8. לנתח בעדינות את השרירים הבין-צלעי עם פינצטה, עד השטח pleural נגיש, אפשר לראות את הריאה השמאלית מקדימה. הוסף את המדחק בין הצלעות ופתח אותו בזהירות עד תצפית טובה על הלב, מתקבל.
   9. פתח את קרום הלב כ 1 ס"מ באזור של הקיר חדרית השמאלי הקדמי עם מספריים. הניחו קומפרסים על הריאה השמאלית כדי להגן עליו מפני נזק בעת גרימת את cryoinjury של החדר השמאלי.
   10. המקום הקצה בחותמת מתכת השחוקים (אלומיניום) בקוטר חתך הרוחב של 0.5 ס מ לתוך חנקן נוזלי למשך 3 דקות.
   11. הקש החנקן מקורר רגש על גבי הקיר הקדמי השמאלי של הלב 30 s. ואז להפריד את זה מכל הלב באמצעות של חשמלי מלחם (250 מעלות צלזיוס) אשר ממוקם בתוך הבול כדי לחמם את זה. חזור על הליך זה 3 פעמים כדי להשיג פגיעה שריר הלב transmural. להתבונן על בישול לבן של שריר הלב.
   12. מנפח הריאות עם מרב הלחץ (על-ידי מחבר חובק למעקה הצינור יצוא של ההנשמה 2 s), כדי למנוע תמט הריאות של הריאה. הסר את המדחק מן המרחב הבין-צלעי.
   13. סגור את הצלעות עם שני תפרים 3-0. סגור השרירים מעל הצלעות עם 4-0 פועל תפר. לשימוש הסגר של העור 5-0 בתפר אחד התפרים.
   14. להפחית את איזופלוריין ל- 1%. כאשר החיה נושם באופן ספונטני, להסיר את הצינור בקנה הנשימה, ולהמשיך הרדמה עם facemask (איזופלוריין 2-3%).
   15. מבטיח העדר רפלקסים מאת צובט את האיבר הינד לעקוב אחר עומק מספיק של הרדמה. לאחר מכן השתמש יחיד 8-0 תפרים כדי לסגור את האתר ניקוב על קנה הנשימה. לסגור את הפצע עם שלושה תפרים stich יחידה 4-0.
   16. השתמש הבופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג לכל 12 שעות) carprofen (5 מ"ג/ק"ג לכל 24 שעות ביממה) לתרופות כאב עבור 5 הימים הבאים.
2. השרשה של בובה (7 ימים לאחר cryoinjury)
   1. למקם את שפן תא אינדוקציה, עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין הסימון העומק של הרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-בלחץ.
   2. להזריק carprofen 4-5 מ"ג/ק"ג ו- 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously עם מחט 21 G ומזרק 10 מ"ל לאחר אינדוקציה של הרדמה. במקום שפן על גבו ולשמור הרדמה עם facemask כיסוי הפה והאף.
      הערה: תנאי הכרחי של הרדמה צריך להיבדק על ידי צובט הרגליים האחוריות.
   3. ופשקו את הרגליים של שפן ולתקן את המיקום באמצעות הקלטת.
   4. לבצע את ההכנות טרום הניתוח כפי שמתואר בשלב 3.1.4–3.1.6. לבצע חתך אופקי העור 2 ס מ באזור הצלקת של הצד הלטראלי השמאלי באמצעות פינצטה ומספריים.
   5. בעדינות לנתח את ההדבקויות extrapleural שימוש electrocautery. בזהירות לפתוח את השטח pleural עם מספריים. הכנס מפסק צלעות לחשוף את הלב.
   6. זיהוי חזותי של האזור של שריר הלב על-ידי צבעה חיוור בהשוואה לשריר שמסביב בריא. הצב את תיקון רקמת הלב מהונדסים מעל האזור אוטם.
   7. לאבטח אותו עם שני 8-0 התפרים על שני הצדדים. הקפד לאבטח את התיקון באזור הלא-infarcted של הלב (איור 1). מנפח הריאות עם לחץ, כדי למנוע תמט הריאות של הריאה. הסר את המדחק מן המרחב הבין-צלעי.
   8. סגור את הצלעות עם שני תפרים 3-0. סגור השרירים מעל הצלעות עם 4-0 פועל תפר. לשימוש הסגר של העור 5-0 בתפר אחד התפרים.
   9. להפחית את איזופלוריין ל- 1%. כאשר החיה נושם באופן ספונטני, להסיר את הצינור בקנה הנשימה, ולהמשיך הרדמה עם facemask (איזופלוריין 2-3%).
   10. מבטיח העדר רפלקסים מאת צובט את האיבר הינד לעקוב אחר עומק מספיק של הרדמה. לאחר מכן השתמש יחיד 8-0 תפרים כדי לסגור את האתר ניקוב על קנה הנשימה. סגור הפצע עם שלושה יחיד, תפר התפרים 4-0
   11. השתמש הבופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג לכל 12 שעות) carprofen (5 מ"ג/ק"ג לכל 24 שעות ביממה) לתרופות כאב עבור 5 הימים הבאים.
   12. ארבעה שבועות לאחר ההשתלה בובה לבצע אקו אקו (כפי שמתואר בשלב 2) כדי לעקוב אחר תפקוד LV לאורך זמן.
       הערה: הפונקציה LV מנוטר לפני ההשתלה בובה ו- 4 שבועות לאחר ההשתלה כדי לפקח על שיפור בתפקוד הלב על ידי בובה השרשה
   13. להרדימו הפרוטוקול IACUC אושרה, בניתוח explant הלב לצורך ניתוח נוסף.

תוצאות

מודל זה שפן הוא מודל מתאים לחקור התחדשות לב לאחר ההשתלה של hiPSC נגזר בובה-תיקונים. זה מוביל reproducibly פציעות שריר הלב transmural גדולים. גודל הצלקת מוערך על-ידי היסטולוגיה ארבעה שבועות לאחר cryoinjury. צביעת trichrome מייסון מגלה צלקות גדולות transmural (איור 2). גודל הצלקת היה דומה על פני מספר רב של...

Discussion

מגוון דגמים בעלי חיים קטנים זמינים לחקור את ההשפעה השתלת תא מפעילה לבבות הפצועים^9,10,11. בחרנו מודל שפן בגלל חיים קטן כל הדגמים שלה (האלקטרו) פיזיולוגיה דומה ביותר לזו של בני אדם. היתרונות של מודלים בעלי חיים קטנים הם דיור פשוטה לניהול עלויות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055