Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la inducción de la criocauterización ventricular izquierdo seguido de la implantación de un parche de músculo cardiaco, derivado de los cardiomiocitos células iPS humanas en un modelo del conejillo de Indias.

Resumen

Debido a la capacidad limitada de regeneración del corazón en mamíferos adultos, infarto de miocardio resulta en una pérdida irreversible de cardiomiocitos. Esta pérdida de cantidades importantes de músculo cardíaco masa puede llevar a la insuficiencia cardíaca. Además de trasplante de corazón, no hay ninguna opción de tratamiento curativo para la insuficiencia de la fase final. En tiempos de escasez de donantes de órganos, modalidades de tratamiento independiente del órgano son necesarios. Dispositivos de asistencia ventricular izquierda son una opción promisoria de tratamiento, sin embargo, especialmente como terapia de destino, limitada por sus efectos secundarios, como accidentes cerebrovasculares, infecciones y bleedings. En los últimos años se han investigado varias estrategias de reparación cardíaca, incluyendo la inyección de células madre, progenitoras cardiacas o ingeniería tisular del miocardio. Las mejoras recientes en biología celular permiten la diferenciación de grandes cantidades de cardiomiocitos derivados de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSC). Una de las estrategias de reparación cardíaca actualmente bajo evaluación es trasplantar tejido cardíaco artificial. Tejido del corazón Ingeniería (EHT) es una red tridimensional cardiomiocitos creado in vitro, con propiedades funcionales de los tejidos del corazón nativo. Hemos creado EHT-parches de cardiomiocitos hiPSC derivado. Aquí presentamos un protocolo para la inducción de la criocauterización miocardio ventricular izquierdo en un conejillo de Indias, seguida por la implantación de hiPSC derivados EHT en la pared ventricular izquierda.

Introducción

El número de pacientes con insuficiencia cardíaca está aumentando en nuestra población que envejece. Final-insuficiencia cardíaca, trasplante cardíaco ortotópico es la opción de tratamiento curativo sólo. Sin embargo, especialmente en países europeos, existe una creciente escasez de donantes de órganos. Por lo tanto, son necesarios tratamientos alternativos. Los logros recientes en soporte circulatorio mecánico son prometedores, pero sobre todo a largo plazo funcionan, limitado por sus efectos secundarios como sangrado, trombosis de la bomba y las complicaciones infecciosas¹.

La capacidad de regeneración endógena del corazón humano adulto es extremadamente limitada. Por lo tanto, terapias de regeneración cardiaca podrían convertirse en una opción alternativa del tratamiento para la fase final insuficiencia cardíaca los pacientes^2,3. Diferentes técnicas incluyendo inyección celular basada en células o tejidos enfoques de ingeniería han sido describen^3,4,5.

Las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC), así como células de vástago embrionarias humanas (hESCs) se pueden distinguir eficazmente a espontáneamente superando a cardiomiocitos humanos⁶, que ha sido un logro importante en el campo de regeneración cardiaca terapias.

Para reemplazar el miocardio después de un infarto de miocardio y mejorar la función del corazón falla, la supervivencia de un número adecuado de cardiomiocitos y sus mecánicos y eléctricos de acoplamiento con el corazón nativo es esencial. Para investigar el potencial de las terapias regenerativas cardiacas con cardiomiocitos de celular basada en células iPS humanas, se necesita un modelo de investigación adecuado. El modelo ideal debe ser rentable y tiene una apariencia humana fisiología y electrofisiología. Modelos animales grandes como cerdos sería lo ideales desde este punto de vista, sin embargo, estos experimentos son muy costosos y grandes cantidades de cardiomiocitos sería necesarios reemplazar un relevante número de cardiomiocitos para ver efectos en el ventrículo izquierdo función en un modelo de infarto de cerdo.

Para responder a preguntas biológicas elementales hacia la regeneración cardiaca basadas en células humana, por ejemplo, supervivencia celular, vascularización y acoplamientos eléctricos, modelos animales pequeños son más convenientes. De los modelos disponibles de animales pequeños, el conejillo de Indias es la especie más útil, en comparación con las ratas y ratones, como su electrofisiología asemeja más de cerca la situación en los seres humanos⁷. En este modelo de conejillo de Indias, indujo una criocauterización transmural del ventrículo izquierdo. Una semana después de la inducción de infarto de miocardio la implantación de un tridimensional, espontáneamente a cardiomiocitos derivados de células caderas parche fue realizado. Supervivencia celular de cardiomiocitos se evaluó 28 días después de la implantación por la examinación histológica.

Protocolo

Animales recibieron atención humanitaria conforme a la guía de principios de los animales de laboratorio, prepararon por el Instituto de recursos de animales laboratorio y publicaron por los institutos nacionales de salud. Animales todos los protocolos fueron aprobados por la autoridad local responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Hamburgo '' / Animal protocolo # 109/16).

1. obtener animales

1. Comercialmente obtener cuyes hembra 500-600 g de peso.
2. Alojarlos bajo condiciones convencionales en jaulas animales. Alimentación estándar rata chow y agua esterilizada ad libidum.

2. transtorácica

1. El conejillo de Indias en una cámara de inducción y anestesiar el animal con isoflurano (2 – 3%). Verificar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca del dedo del pie.
2. Coloque el conejillo de Indias anestesiados en una plataforma de calentamiento (40 – 42 ° C) en una posición supina. Continuar la anestesia mediante un cono de nariz (isoflurane 1.5-2%)
3. Afeitarse y depilarse el tórax de pig´s de guinea con una afeitadora de pelo eléctrico.
4. Aplicar el gel del transductor de ultrasonido precalentado (~ 25 ° C). Utilizar un sistema de ecocardiografía que está equipado con una frecuencia de transductor de 15 MHz.
5. Adquirir puntos de vista de eje largo paraesternal bidimensional colocando el transductor sobre el tórax de cerdo guinea´s hacia al cuello derecho hacia la pierna izquierda y eje largo grabar imágenes de modo B en el plano de la válvula aórtica con una visualización simultánea del ápice del LV. Investigar la función ventricular izquierda preoperatoria.
6. Girar el transductor 90° grados para obtener una vista de eje corto modo B en el nivel medio-papilar.
   Nota: El animal es trasladado inmediatamente a la tabla OR. El animal es continuamente anestesiado con isoflurano de 3%. se inyecta atropina de 0,05 mg/kg (i.m.) para evitar la secreción bronquial aumentada durante la ventilación mecánica.

3. cirugía

1. Inducción de infarto de miocardio
   1. Inyectar 4 – 5 mg/kg de carprofeno y 0,05 mg/kg de buprenorfina para la analgesia por vía subcutánea con una aguja de 21 G y jeringa de 10 mL. 0.5 mg/kg atropina se inyecta por vía subcutánea con una aguja de 21 G y jeringa de 10 mL.
   2. Coloque el conejillo de Indias en su espalda y mantener la anestesia con una mascarilla cubriendo boca y nariz. Verificar la profundidad de la anestesia pellizcando los pies traseros (falta del reflejo pedal).
   3. Separó las piernas de los conejillos de Indias y fijar la posición con cinta.
   4. Afeitarse el pecho y la región traqueal del animal anestesiado con una afeitadora eléctrica. Desinfectar la zona ampliamente con scrub base de yodo, seguido de etanol al 80%. Repetir dos veces esta pasos de desinfección.
   5. Realizar una incisión vertical de 1,5 cm en la zona traqueal y sin rodeos, disecar los músculos que cubre la tráquea hasta la tráquea. Punción de la tráquea con cánula i.v. de 18 G e inserte la parte flexible de la cánula como un tubo traqueal.
   6. Conectar el tubo endotraqueal a un animal respirador para ventilar continuamente el conejillo de indias durante el procedimiento.
      Nota: Ahora se mantiene la anestesia con isoflurano 3% a través del tubo traqueal (inspiración asistida ventilación con presión de inspiración máxima, tasa de respiración: 100 – 120/min, presión de inspiración máxima: 18-22 cm Hg usando PEEP-ventilación, mientras que el pecho está abierto ).
   7. Identificar el 5 espacio intercostal^th contando los espacios costilla empezando por el primer espacio intercostal. Realizar una incisión horizontal de 2 cm en el 5 º Espacio intercostal en el lado izquierdo del conejillo de Indias con tijera y una pinza. Inserte un retractor de animales pequeños. Diseccionar los músculos con un electrocauterio hasta alcanzaron los músculos intercostales, que pueden verse después de retirar el tejido subcutáneo, se puede llegar.
   8. Disecan suavemente los músculos intercostales con pinzas hasta que se alcanza el espacio pleural y se puede ver el pulmón izquierdo en frente. Inserte el separador entre las costillas y abrir cuidadosamente hasta obtener una buena vista del corazón.
   9. Abrir el pericardio aproximadamente 1 cm en la región de la pared ventricular izquierda anterior con las tijeras. Coloque una compresa en el pulmón izquierdo para proteger de daños al inducir la criocauterización del ventrículo izquierdo.
   10. Coloque la punta de un sello metal erosionado (aluminio) con un diámetro transversal de 0,5 cm en nitrógeno líquido durante 3 minutos.
   11. Prensa el nitrógeno enfriado por sonda en la pared anterior izquierda del corazón durante 30 s. Luego separar del corazón usando un eléctrico cautín (250 ° C) que se coloca dentro de la estampilla para calentarla. Repita este procedimiento 3 veces para obtener un daño miocárdico transmural. Observar la palidez del miocardio.
   12. Inflar los pulmones con la máxima presión (de sujeción del tubo de salida del ventilador de 2 s), para evitar la atelectasia del pulmón. Retire el separador el espacio intercostal.
   13. Cerca de las costillas con dos suturas 3-0. Cerca de la sutura los músculos sobre las costillas con una corriente de 4-0. Para el cierre de la piel usar puntadas solo de la sutura 5-0.
   14. Reducir el isoflurano al 1%. Cuando el animal está respirando espontáneamente, retire el tubo traqueal y continuar la anestesia con un facemask (isoflurano 2 – 3%).
   15. Asegurar la ausencia de reflejos pellizcando las extremidades para monitorear suficiente profundidad de la anestesia. Luego utilizar una única 8-0 sutura para cerrar el sitio de punción en la tráquea. Cerrar la herida con tres suturas de stich solo 4-0.
   16. Uso de buprenorfina (0,05 mg/kg / 12 h) y carprofeno (5 mg/kg / 24 h) de analgésicos para los siguientes 5 días.
2. Implantación de EHT (7 días después de la criocauterización)
   1. El conejillo de Indias en una cámara de inducción y anestesiar el animal con isoflurano comprobar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca del dedo del pie.
   2. Inyectar 4 – 5 mg/kg de carprofeno y 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea con una aguja de 21 G y jeringa de 10 mL después de la inducción de la anestesia. Coloque el conejillo de Indias en su espalda y mantener la anestesia con una mascarilla cubriendo boca y nariz.
      Nota: Suficiencia de la anestesia debe medirse pellizcando los pies traseros.
   3. Piernas de cerdo de guinea de propagación y fijar la posición con cinta.
   4. Realizar la preparación pre quirúrgica como se describe en el paso 3.1.4–3.1.6. Realizar una incisión de piel horizontal de 2 cm en el área de la cicatriz del lado lateral izquierdo usando tijeras y pinzas.
   5. Suavemente disecar las adherencias extrapleural con un electrocauterio. Abra cuidadosamente el espacio pleural con tijeras. Insertar un separador costilla para exponer el corazón.
   6. Visualmente identificar la región del infarto por su color pálido en comparación con el miocardio circundante saneado. Coloque el parche de tejido de corazón de ingeniería sobre la región del infarto.
   7. Asegúrelo con dos 8-0 suturas en ambos lados. Asegúrese de fijar el parche en la zona no infartada del corazón (figura 1). Inflar los pulmones con la presión, para evitar la atelectasia del pulmón. Retire el separador el espacio intercostal.
   8. Cerca de las costillas con dos suturas 3-0. Cerca de la sutura los músculos sobre las costillas con una corriente de 4-0. Para el cierre de la piel usar puntadas solo de la sutura 5-0.
   9. Reducir el isoflurano al 1%. Cuando el animal está respirando espontáneamente, retire el tubo traqueal y continuar la anestesia con un facemask (isoflurano 2 – 3%).
   10. Asegurar la ausencia de reflejos pellizcando las extremidades para monitorear suficiente profundidad de la anestesia. Luego utilizar una única 8-0 sutura para cerrar el sitio de punción en la tráquea. Cierre de la herida con solo tres puntada suturas de 4-0.
   11. Uso de buprenorfina (0,05 mg/kg / 12 h) y carprofeno (5 mg/kg / 24 h) de analgésicos para los siguientes 5 días.
   12. Cuatro semanas después de la implantación de la EHT realizar una ecocardiografía transtorácica (como se describe en el paso 2) para controlar la función del VI en tiempo.
       Nota: La función del LV se controla antes de la implantación de EHT y 4 semanas después de la implantación para controlar para la mejora de la función cardiaca por implantación de EHT
   13. Eutanasia animal que el protocolo aprobado del IACUC y explante quirúrgicamente el corazón para su posterior análisis.

Resultados

Este modelo de conejillo de Indias es un modelo conveniente para investigar la regeneración cardiaca después de implantación de hiPSC había derivada parches de EHT. Reproducible conduce a lesiones miocardio transmural grande. Tamaño de la cicatriz es evaluado por histología cuatro semanas después de la criocauterización. Tinción tricrómica de Mason revela cicatrices grandes transmural (figura 2). Tamaño de la cicatriz fue similar sobre un gran número de animales heridos, lo que r...

Discusión

Una gran variedad de modelos animales pequeños están disponibles para estudiar el efecto que ejerce el trasplante de células en corazones heridos^9,10,11. Elegimos un modelo del conejillo de Indias por todo animal pequeño modelos su (electro) fisiología asemeja más de cerca posible de los seres humanos. Las ventajas de los modelos animales pequeños son vivienda simple, costos manejables y algunas plantillas. En comparació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055