Имплантация hiPSC производные патчей сердечной мышцы после миокардиального ушиба в модели морской свинки

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для индукции левого желудочка cryoinjury следуют имплантации патч сердечной мышцы, производные от кардиомиоцитов iPS клеток человека в морской свинки модели.

Аннотация

Благодаря способности ограничены регенерации сердца у взрослых млекопитающих инфаркт миокарда приводит к необратимой потере кардиомиоцитов. Эта потеря соответствующих сумм сердечной мышцы массы может привести к сердечной недостаточности. Помимо трансплантация сердца существует никакой вариант лечения для конечной стадии сердечной недостаточности. Во времена нехватки доноров орган орган самостоятельного лечения условия необходимы. Слева желудочковая assist устройств являются перспективный вариант терапии, однако, особенно в качестве назначения терапии, ограничена его побочные эффекты, как инсульт, инфекции и кровотечения. В последние годы были исследованы несколько сердечных ремонта стратегий, включая инъекции стволовых клеток, сердечной прародителями или миокарда тканевой инженерии. Недавние усовершенствования в клеточной биологии позволяют для дифференциации большого количества кардиомиоцитов, производный от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Одной из стратегий сердца ремонт в настоящее время предметом оценки является пересадка ткани искусственного сердца. Инженерии сердечной ткани (EHT) представляет собой трехмерный в пробирке создан cardiomyocyte сеть с функциональными свойствами ткани собственного сердца. Мы создали EHT-патчи от hiPSC производные кардиомиоцитов. Здесь мы представляем протокол для индукции левого желудочка миокарда cryoinjury в морской свинки, следуют имплантации hiPSC производных EHT на стенке левого желудочка.

Введение

Количество больных с сердечной недостаточностью увеличивается в нашей старения населения. Для конечной стадии сердечной недостаточности ортотопическая трансплантация сердца является параметр только курс лечения. Однако особенно в европейских странах, существует растущая нехватка доноров орган. Таким образом необходимы альтернативные варианты лечения. Последние достижения в механическую поддержку кровообращения являются многообещающими, но особенно в долгосрочной перспективе запустить, ограничивается ее побочные эффекты, как кровотечение, насос тромбоза и инфекционных осложнений¹.

Эндогенные регенеративная способность сердца взрослого человека является крайне ограниченным. Таким образом сердца регенерации терапии может стать альтернативное лечение вариант для конечной стадии сердечной недостаточности больных^2,3. Различные методы, включая инъекций на основе стволовых клеток клеток или тканей, инженерные подходы были описаны^3,4,5.

Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), а также человеческих эмбриональных стволовых клеток (Госкомсанэпиднадзором) может быть эффективно дифференцирована в спонтанно избиение человека кардиомиоцитов⁶, который был крупным достижением в области регенеративной сердечной терапии.

Чтобы заменить миокарда после инфаркта миокарда и улучшению функции сердца, выживание подходящее количество кардиомиоцитов и их механические и электрические соединения с родной сердца имеет важное значение. Исследовать потенциал сердечной регенеративной терапии с iPS человеческих клеток, полученных кардиомиоцитов, необходима модель подходящих исследований. Идеальная модель должны быть экономически эффективными и физиология человека как и электрофизиологии. Крупные животные модели как свиньи бы идеально с этой точки зрения, однако, эти эксперименты являются очень дорогими и большое количество кардиомиоцитов необходимо будет заменить соответствующие количество кардиомиоцитов, чтобы увидеть эффекты на левого желудочка функции в модели миокарда свиньи.

Например, чтобы ответить элементарных биологических вопросы к человека на основе клеток сердечной регенерации, выживание клетки, васкуляризации и электрические соединения, малые животные модели являются более подходящими. От имеющихся небольших животных моделей морская свинка является наиболее полезных видов, по сравнению с крыс и мышей, как их электрофизиологии больше напоминает ситуацию в людей⁷. В этой модели морской свинки мы индуцированной Трансмуральное cryoinjury левого желудочка. Через одну неделю после индукции инфаркт миокарда имплантации трехмерных, спонтанно избиение бедра клеток, полученных cardiomyocyte патч была выполнена. Выживание клетки cardiomyocyte был оценен гистологическом 28 дней после имплантации.

протокол

Животных получил гуманной помощи в соответствии с руководство по принципам лабораторных животных, подготовленный Институтом ресурсов лабораторных животных и публикуемых национальными институтами здравоохранения. Все животные протоколы были одобрены ответственным местным органом власти ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Гамбург '' / животных протокол # 109/16).

1. получить животных

1. Коммерчески получите женский морских свинок, массой 500-600 г.
2. Дом их в обычных условиях в животных клетках. Канал стандартных крыс Чоу и автоклавного воды объявление libidum.

2. Трансторакальная эхокардиография

1. Морская свинка в камеру всасывание и анестезировать животное с изофлюрановая (2-3%). Проверка глубины анестезии, отсутствие реакции на мыс пинча.
2. Место осознающие свинки на потепление платформе (40-42 ° C) в лежачем положении. Продолжать анестезии через носовой конус (изофлюрановая 1,5-2%)
3. Бритье и депилировать грудной клетки pig´s Гвинея, с помощью бритвы электрические волос животных.
4. Применение геля датчика УЗИ подогретую (~ 25 ° C). Используйте систему эхокардиографии, которая оборудована с преобразователем частоты выше 15 МГц.
5. Приобрести двумерных парастернальной длинной оси просмотров, поместив датчик на грудной клетки свиней guinea´s, сталкивается с правом шеи к левой ноге и записи длинной оси B-режим изображения на плоскости аортального клапана с параллельной визуализации LV Апекс. Исследуйте функцию предоперационное левого желудочка.
6. Поверните преобразователя на 90° градусов для получения короткой оси B-режим представления на уровне середины папиллярная.
   Примечание: Животное сразу переводятся или таблицу. Животное постоянно под наркозом с 3% изофлюрановая. чтобы избежать повышенной бронхиальной секреции при искусственной вентиляции легких вводят 0,05 мг/кг атропина (и.м.).

3. хирургия

1. Индукция инфаркта миокарда
   1. Придать carprofen 4 – 5 мг/кг и бупренорфина 0,05 мг/кг для обезболивания подкожно с иглой 21 G и шприц 10 мл. Атропин 0,5 мг/кг вводят подкожно с иглой 21 G и шприц 10 мл.
   2. Место свинки на спине и держать анестезии с маску, охватывающий рот и нос. Проверка глубины анестезии, щипать лапы (отсутствие педали рефлекс).
   3. Распространение морских свинок ноги и исправить положение с помощью липкой ленты.
   4. Бритье груди и трахеи региона наркотизированных животного с электробритвы. Лечить области, широко используя на основе йода скраб, а затем 80% этанола. Повторите этот дезинфекции дважды.
   5. Выполните 1,5 см вертикальный разрез в области трахеи и тупо рассечь мышцы, охватывающих трахеи до тех пор, пока вы видите трахеи. Прокол трахеи с 18 G Внутривенный катетер и вставьте гибкий часть канюля как трахеи трубку.
   6. Подключите трахеи трубку к животных респиратор постоянно проветривать морскую свинку во время процедуры.
      Примечание: Теперь с 3% изофлюрановая через трахеи трубку поддерживается анестезии (вдохновение помощь вентиляции с максимальной вдохновение давление, частота дыхания: 100 – 120/мин, пик вдохновения давление: 18-22 см Hg с помощью Пип вентиляция при открытом груди ).
   7. Определите 5^й межреберное пространство путем подсчета запрещено ребра, начиная с первого межреберное пространство. Выполняйте горизонтальный разрез 2 см на 5 межреберное пространство на левой стороне морской свинки, используя ножницы, пинцет. Вставьте маленький животное втягивающего устройства. Рассечь мышцы с electrocautery пока не достигнуто межреберные мышцы, которые могут рассматриваться после удаления подкожной клетчатки, достигаются.
   8. Аккуратно вскрыть межреберные мышцы с помощью пинцета, вплоть до плевральную полость можно увидеть левого легкого в передней. Вставьте втягивающего устройства между ребрами и открыть его тщательно, пока не получается хороший вид сердца.
   9. Откройте перикарда примерно 1 см в регионе передней стенки левого желудочка с помощью ножниц. Место компресс на левое легкое, чтобы защитить его от повреждений при вызывая cryoinjury левого желудочка.
   10. Место кончике эродированных металлическим штампом (алюминий) с поперечного сечения диаметром 0,5 см в жидкий азот за 3 мин.
   11. Пресс азот охлажденный зонд на левой передней стенки сердца для 30 s. Затем отделяют его от всего сердца с помощью электропаяльника (250 ° C) который помещается внутри отметку, чтобы согреть. Повторите эту процедуру 3 раза для получения Трансмуральное миокардиального ушиба. Наблюдать, бланширования миокарда.
   12. Надуть легких с максимальное давление (путем зажима отток трубу вентилятора 2 s), чтобы избежать ателектаз легких. Удалите из межреберное пространство втягивающего устройства.
   13. Закройте ребер с двумя швами 3-0. Закрыть шов мышц над ребер с управлением 4-0. Для закрытия кожи используйте 5-0 шва одной строчки.
   14. Уменьшите изофлюрановая до 1%. Когда животное дышит спонтанно, удалите трахеи трубку и продолжить анестезии с маску (изофлюрановая 2-3%).
   15. Обеспечить отсутствие рефлексов, щипать задние конечности, чтобы следить за достаточной глубины анестезии. Затем используйте один 8-0 Шовный материал для закрытия места проколов на трахею. Закройте рану швы трех один стежок 4-0.
   16. Для боль лекарства на следующие 5 дней использовать бупренорфин (0,05 мг/кг в сут) и carprofen (5 мг/кг в сутки).
2. Имплантация EHT (7 дней после cryoinjury)
   1. Морская свинка в камеру всасывание и анестезировать животное с изофлюрановая проверки глубины анестезии, отсутствие реакции на мыс пинча.
   2. Придать carprofen 4 – 5 мг/кг и бупренорфина 0,05 мг/кг подкожно с иглой 21 G и 10 мл шприц после индукции анестезии. Место свинки на спине и держать анестезии с маску, охватывающий рот и нос.
      Примечание: Достаточность анестезии должны проверяться путем сжимать лапы.
   3. Распространение ноги морской свинки и исправить положение с помощью липкой ленты.
   4. Выполните дооперационного препараты, как описано в шаге 3.1.4–3.1.6. Выполните 2 см горизонтальный разрез в области рубца левой боковой стороны, используя ножницы и щипчики.
   5. Аккуратно вскрыть extrapleural спайки с помощью электрокаутер. Осторожно откройте плевральной полости с ножницами. Вставьте ребро разбрасыватель подвергать сердце.
   6. Визуально Определите области миокарда по его бледный цвет по сравнению со здоровыми окружающие миокарда. Поместите патч инженерии сердца ткани миокарда региона.
   7. Закрепите его с двух 8-0 швы с обеих сторон. Убедитесь в том обеспечить патч в не infarcted области сердца (рис. 1). Надуйте легких с давлением, чтобы избежать ателектаз легких. Удалите из межреберное пространство втягивающего устройства.
   8. Закройте ребер с двумя швами 3-0. Закрыть шов мышц над ребер с управлением 4-0. Для закрытия кожи используйте 5-0 шва одной строчки.
   9. Уменьшите изофлюрановая до 1%. Когда животное дышит спонтанно, удалите трахеи трубку и продолжить анестезии с маску (изофлюрановая 2-3%).
   10. Обеспечить отсутствие рефлексов, щипать задние конечности, чтобы следить за достаточной глубины анестезии. Затем используйте один 8-0 Шовный материал для закрытия места проколов на трахею. Закрыть рану с тремя сингл сшить швы 4-0.
   11. Для боль лекарства на следующие 5 дней использовать бупренорфин (0,05 мг/кг в сут) и carprofen (5 мг/кг в сутки).
   12. Через четыре недели после вживления EHT выполняют Трансторакальная эхокардиография (как описано в шаге 2) для контроля функции LV с течением времени.
       Примечание: LV функция контролируется до имплантации EHT и 4 недель после имплантации для мониторинга для улучшения сердечной функции путем вживления EHT
   13. Усыпить животных протокол IACUC утверждения и хирургическим explant сердца для дальнейшего анализа.

Результаты

Эта модель морских свинок является подходящей модели для изучения сердца регенерации после имплантации hiPSC производные EHT-патчи. Можно воспроизвести это приводит к большой Трансмуральное миокарда травм. Шрам размер оценивается по гистологии через четыре недели после cryoinjury. Мейсон trichr...

Обсуждение

Целый ряд мелких животных моделей доступны для изучения эффекта, что трансплантация клеток оказывает раненых сердец^9,10,11. Мы выбрали модель свинки из-за всех мелких животных моделей его (электро) физиологии напоминает наиболее тесно лю...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055