Impianto di hiPSC-derivato del muscolo cardiaco patch dopo lesione del miocardio in un modello della cavia

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per l'induzione di cryoinjury ventricolare sinistra seguita dall'impianto di una patch di muscolo cardiaco, derivata da cardiomiociti iPS-cellula umana in un modello della cavia.

Abstract

A causa della capacità limitata rigenerazione del cuore nei mammiferi adulti, infarto del miocardio provoca una perdita irreversibile dei cardiomiociti. Questa perdita di rilevanti quantità di muscolo cardiaco massa può condurre a guasto di cuore. Oltre a trapianto del cuore, non esiste alcuna opzione di trattamento curativo per l'infarto di stadio finale. In tempi di carenza di donatori di organi, le modalità di trattamento indipendente di organo sono necessari. Dispositivi di assistenza ventricolare sinistra sono un'opzione di terapia promettente, tuttavia, soprattutto come terapia di destinazione, limitata dai suoi effetti collaterali come colpo, infezioni ed emorragie. Negli ultimi anni, sono state studiate diverse strategie di riparazione cardiaca tra cui iniezione di cellule staminali, progenitori cardiaci o ingegneria del tessuto del miocardio. Recenti miglioramenti nella biologia cellulare consentono la differenziazione di grandi quantità di cardiomiociti derivati da cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC). Una delle strategie di riparazione cardiaca attualmente in corso di valutazione è quello del trapianto di tessuto cardiaco artificiale. Tessuto cardiaco ingegnerizzato (EHT) è una rete tridimensionale del cardiomyocyte creato in vitro, con proprietà funzionali del tessuto cardiaco nativo. Abbiamo creato EHT-patches da cardiomiociti hiPSC derivato. Qui presentiamo un protocollo per l'induzione di cryoinjury del miocardio ventricolare sinistro in una cavia, seguita da impianto di hiPSC derivati EHT sulla parete ventricolare sinistra.

Introduzione

Il numero di pazienti con insufficienza cardiaca è in aumento nella nostra popolazione di invecchiamento. Per l'infarto di stadio finale, trapianto orthotopic del cuore è l'opzione di solo trattamento curativo. Tuttavia, specialmente nei paesi europei, c'è una crescente carenza di donatori di organi. Di conseguenza, le opzioni alternative di trattamento sono necessari. Recenti risultati in supporto circolatorio meccanico sono promettenti, ma soprattutto a lungo termine eseguire, limitato dai suoi effetti collaterali come emorragie, trombosi pompa e le complicazioni contagiose¹.

La capacità di rigenerazione endogena del cuore umano adulto è estremamente limitata. Di conseguenza, terapie di rigenerazione cardiaca potrebbero diventare un'opzione terapeutica alternativa per stadio finale insufficienza cardiaca i pazienti^2,3. Diverse tecniche tra cui iniezione basata su cellule staminali delle cellule o tessuti ingegneria approcci sono stati descritti^3,4,5.

Cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC), come pure le cellule staminali embrionali umane (hESC) possono essere differenziati in modo efficace a spontaneamente battendo cardiomyocytes umano⁶, che è stato un risultato importante nel campo di cardiaco rigenerativa terapie.

Per sostituire il miocardio dopo un infarto miocardico e migliorare la funzione di un cuore di venire a mancare, la sopravvivenza di un numero adeguato di cardiomiociti e loro accoppiamento meccanico ed elettrico con cuore Natale è essenziale. Per studiare il potenziale delle terapie rigenerative cardiache con cardiomiociti su cellule umane iPS, è necessario un modello di ricerca adatto. Il modello ideale dovrebbe essere conveniente e hanno una fisiologia umana-come ed elettrofisiologia. Grandi modelli animali come maiali sarebbe l'ideale da questo punto di vista, tuttavia, tali esperimenti sono molto costosi e grandi quantità di cardiomiociti sarebbe necessario sostituire un numero rilevante di cardiomiociti per vedere gli effetti sulla sinistra ventricolare funzione in un modello di infarto di maiale.

Per rispondere a domande elementari biologiche verso rigenerazione cardiaca basati su cellule umane, ad esempio, la sopravvivenza delle cellule, vascolarizzazione e accoppiamento elettrico, modelli animali piccoli sono più adatti. Da disponibili modelli animali piccoli, la cavia è la specie più utile, rispetto ai ratti e topi, come loro elettrofisiologia assomiglia più da vicino la situazione in esseri umani⁷. In questo modello di cavia, abbiamo indotto un cryoinjury transmurale del ventricolo sinistro. Una settimana dopo l'induzione dell'infarto miocardico l'impianto di un tridimensionale, spontaneamente battendo fianchi-cellule derivate del cardiomyocyte zona è stata effettuata. Sopravvivenza delle cellule del cardiomyocyte è stata valutata 28 giorni dopo l'impianto da esame istologico.

Protocollo

Animali ha ricevuto un'assistenza umana in conformità con la guida per i principi di animali da laboratorio, preparato da Istituto di laboratorio animale risorse e pubblicato da National Institutes of Health. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dall'autorità locale responsabile (' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Hamburg ' / animali protocollo n. 109/16).

1. ottenere animali

1. Commercialmente ottenere cavie femmina pesa 500 – 600 g.
2. Casa loro condizioni convenzionali in gabbie per animali. Alimentazione cibo standard del ratto e sterilizzato nell'autoclave acqua ad libidum.

2. ecocardiogramma transtoracico

1. Posizionare la cavia in un aula di induzione e anestetizzare l'animale con isoflurano (2 – 3%). Controllare la profondità dell'anestesia da mancanza di risposta per il punta-pizzico.
2. Posizionare la cavia anestetizzati su una piattaforma di riscaldamento (40 – 42 ° C) in posizione supina. Continuare l'anestesia tramite un cono di naso (isoflurane 1.5-2%)
3. Depilare il torace pig´s guinea utilizzando un rasoio elettrico animale capelli e la barba.
4. Applicare gel di trasduttore di ultrasuoni preriscaldata (~ 25 ° C). Utilizzare un sistema di ecocardiografia che è attrezzato con una frequenza di trasduttore superiore a 15 MHz.
5. Acquisire viste di bidimensionale parasternale asse lungo posizionando il trasduttore sul torace di maiale guinea´s fronte dal collo destro verso la gamba sinistra e record lungo asse B-mode immagini sul piano della valvola aortica con una visualizzazione simultanea dell'apex LV. Studiare la funzione ventricolare sinistra pre-operative.
6. Girare il trasduttore di 90° gradi per ottenere una breve asse B-modalità a livello di metà-papillare.
   Nota: L'animale viene poi immediatamente trasferito alla tabella OR. L'animale è continuamente anestetizzato con 3% isoflurane. L'atropina 0,05 mg/kg (i.m.) viene iniettato per evitare l'aumento della secrezione bronchiale durante la ventilazione meccanica.

3. chirurgia

1. Induzione dell'infarto miocardico
   1. Iniettare per via sottocutanea carprofen 4 – 5 mg/kg e buprenorfina 0,05 mg/kg per analgesia con un ago 21 G e una siringa da 10 mL. 0,5 mg/kg dell'atropina è iniettato per via sottocutanea con un ago 21 G e una siringa da 10 mL.
   2. Posizionare la cavia sul dorso e mantenere l'anestesia con una facciale che ricopre il naso e bocca. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le zampe posteriori (mancanza di riflesso pedale).
   3. Diffondere le gambe dei porcellini d'India e fissare la posizione con del nastro.
   4. Radere il torace e la regione trachea dell'animale anestetizzato con un rasoio elettrico. Disinfettare la zona ampiamente utilizzando scrub iodato, seguita da 80% di etanolo. Ripetere due volte questa procedura di disinfezione.
   5. Eseguire un'incisione verticale di 1,5 cm in zona trachea e senza mezzi termini sezionare i muscoli che coprono la trachea fino a quando vedrete la trachea. Puntura della trachea con cannula di 18 G i.v. e inserire la parte flessibile della cannula come un tubo tracheale.
   6. Collegare il tubo trachea per un animale respiratore per ventilare continuamente la cavia durante la procedura.
      Nota: Ora l'anestesia è mantenuta con isoflurano 3% attraverso il tubo trachea (ventilazione con pressione massima di ispirazione, tasso di respirazione assistita ispirazione: 100 – 120/min, pressione di picco di ispirazione: 18-22 cm Hg utilizzando PEEP-ventilazione, mentre il petto è aperto ).
   7. Identificare lo spazio intercostale di^th 5 contando gli spazi di costola inizio al primo spazio intercostale. Eseguire un'incisione orizzontale di 2 cm sul 5 ° spazio intercostale sul lato sinistro della cavia con delle forbici, una pinzetta. Inserire un retrattore piccolo animale. Sezionare i muscoli con un elettrocauterio fino a raggiungono i muscoli intercostali, che può essere visto dopo aver rimosso il tessuto sottocutaneo, sono raggiunti.
   8. Sezionare delicatamente i muscoli intercostali con pinzette finché non viene raggiunto lo spazio pleurico e si può vedere il polmone di sinistra nella parte anteriore. Inserire il divaricatore tra le costole e aprirlo con cura fino ad ottenuta una buona vista del cuore.
   9. Le forbici per aprire il pericardio circa 1 cm nella regione della parete ventricolare sinistra anteriore. Posizionare un impacco sul polmone di sinistra per proteggerlo da eventuali danni quando inducendo la cryoinjury del ventricolo sinistro.
   10. Posizionare la punta del timbro eroso di metallo (alluminio) con 0,5 cm di diametro a sezione trasversale nell'azoto liquido per 3 min.
   11. Premere l'azoto raffreddato sonda sulla parete anteriore di sinistra del cuore per 30 s. Quindi di separarla dal cuore utilizzando un saldatore elettrico (250 ° C) che viene inserito all'interno il timbro per riscaldarlo. Ripetere questa procedura 3 volte per ottenere una lesione del miocardio transmurale. Osservare l'imbiancamento del miocardio.
   12. Gonfiare i polmoni con pressione massima (fissando il tubo di efflusso del ventilatore per 2 s), per evitare di atelectasia del polmone. Rimuovere il retrattore dallo spazio intercostale.
   13. Chiudere le costole con due punti di sutura 3-0. Nelle vicinanze i muscoli sopra le costole con un 4-0 in esecuzione suturare. Per la chiusura della pelle utilizzare punti singoli di sutura 5-0.
   14. Ridurre l'isoflurano all'1%. Quando l'animale respira spontaneamente, rimuovere il tubo trachea e continuare l'anestesia con una maschera facciale (isoflurano 2 – 3%).
   15. Assicurano l'assenza di riflessi pizzicando dell'arto per monitorare sufficiente profondità dell'anestesia. Quindi utilizzare un unico 8-0 sutura per chiudere il sito di puntura alla trachea. Chiudere la ferita con tre punti di sutura singola stich 4-0.
   16. Utilizzare buprenorfina (0,05 mg/kg / 12 h) e il carprofen (5 mg/kg / 24 h) per il farmaco di dolore per i 5 giorni seguenti.
2. Impianto di EHT (7 giorni dopo cryoinjury)
   1. Posizionare la cavia in un aula di induzione e anestetizzare l'animale con isoflurano Check la profondità dell'anestesia dalla mancanza di risposta a punta-pizzico.
   2. Iniettare il carprofen 4 – 5 mg/kg e buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea con un ago 21 G e una siringa da 10 mL dopo induzione dell'anestesia. Posizionare la cavia sul dorso e mantenere l'anestesia con una facciale che ricopre il naso e bocca.
      Nota: Sufficienza dell'anestesia dovrebbe essere controllato da pizzicare le zampe posteriori.
   3. Diffondere gambe della cavia e fissare la posizione con del nastro.
   4. Eseguire la preparazione pre-operatoria come descritto nel passo 3.1.4–3.1.6. Eseguire un'incisione orizzontale della pelle di 2 cm nella zona della cicatrice del fianco laterale sinistro con delle forbici, pinzette.
   5. Delicatamente e sezionare le aderenze extrapleural utilizzando un elettrocauterio. Aprire con cautela lo spazio pleurico con le forbici. Inserire un divaricatore per esporre il cuore.
   6. Identificare visivamente la regione dell'infarto per il suo colore pallido in confronto il miocardio sano circostante. Collocare il cerotto di tessuto cardiaco ingegnerizzato sopra la regione di infarto.
   7. Fissarlo con due 8-0 suture su entrambi i lati. Assicurarsi di proteggere la patch nell'area infartuata-non del cuore (Figura 1). Gonfiare i polmoni con pressione, per evitare di atelectasia del polmone. Rimuovere il retrattore dallo spazio intercostale.
   8. Chiudere le costole con due punti di sutura 3-0. Nelle vicinanze i muscoli sopra le costole con un 4-0 in esecuzione suturare. Per la chiusura della pelle utilizzare punti singoli di sutura 5-0.
   9. Ridurre l'isoflurano all'1%. Quando l'animale respira spontaneamente, rimuovere il tubo trachea e continuare l'anestesia con una maschera facciale (isoflurano 2 – 3%).
   10. Assicurano l'assenza di riflessi pizzicando dell'arto per monitorare sufficiente profondità dell'anestesia. Quindi utilizzare un unico 8-0 sutura per chiudere il sito di puntura alla trachea. Nelle vicinanze la ferita con solo tre punti 4-0 suturare.
   11. Utilizzare buprenorfina (0,05 mg/kg / 12 h) e il carprofen (5 mg/kg / 24 h) per il farmaco di dolore per i 5 giorni seguenti.
   12. Quattro settimane dopo l'impianto EHT eseguire un ecocardiogramma transtoracico (come descritto nel passaggio 2) per monitorare la funzione di LV nel tempo.
       Nota: La funzione di LV è monitorata prima l'impianto EHT e 4 settimane dopo l'impianto da monitorare per il miglioramento della funzione cardiaca tramite impianto di EHT
   13. Eutanasia animale quale protocollo IACUC approvato e chirurgicamente explant cuore per ulteriori analisi.

Risultati

Questo modello della cavia è un modello adatto per indagare la rigenerazione cardiaca dopo impianto di hiPSC derivato EHT-patches. Riproducibile conduce alle lesioni del miocardio transmurale grande. Dimensione della cicatrice viene valutata dall'istologia a quattro settimane dopo cryoinjury. Colorazione tricromica Mason rivela grande transmurale cicatrici (Figura 2). Dimensione della cicatrice era simile nel corso di un gran numero di animali feriti, che riflettono un alto grado di riprodu...

Discussione

Una varietà di modelli animali di piccole dimensioni sono disponibili per studiare l'effetto che esercita il trapianto di cellule cuori feriti^9,10,11. Abbiamo scelto un modello della cavia a causa di tutti gli animali piccoli modelli sua (electro) fisiologia assomiglia più molto attentamente a quello degli esseri umani. I vantaggi di piccoli modelli animali sono semplice alloggio, costi gestibili e pochi dipendenti. Confronto ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055