Implantation des dérivés hiPSC myocarde patchs après lésion myocardique dans un modèle de cochon d’Inde

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’induction de cryoinjury ventriculaire gauche, suivie de l’implantation d’un patch du muscle cardiaque, dérivée de cellules iPS humaines cardiomyocytes dans un modèle de cobaye.

Résumé

En raison de la capacité de régénération limitée du cœur chez les mammifères adultes, infarctus du myocarde se traduit par une perte irréversible des cardiomyocytes. Cette perte de montants correspondants du muscle cardiaque masse peut conduire à l’insuffisance cardiaque. En plus de la transplantation cardiaque, il n’y a aucune option de traitement curatif pour l’insuffisance cardiaque terminale. En période de pénurie de donneurs d’organes, les modalités de traitement indépendant d’orgue sont nécessaires. Dispositifs d’assistance ventriculaire gauche sont une option thérapeutique prometteuse, mais surtout comme thérapie de destination, limitée par ses effets secondaires comme les accidents vasculaires cérébraux, les infections et les hémorragies. Ces dernières années, plusieurs stratégies de réparation cardiaque, y compris l’injection de cellules souches, cellules souches cardiaques ou ingénierie tissulaire myocardique ont été étudiées. Les améliorations récentes en biologie cellulaire permettent la différenciation de grandes quantités de cardiomyocytes provenant des cellules souches humaines pluripotentes induites (iPSC). Une des stratégies de réparation cardiaque actuellement en cours d’évaluation est de transplanter des tissus cardiaques artificielles. Coeur ingénierie tissulaire (ISE) est un réseau tridimensionnel cardiomyocyte créé in vitro, ayant des propriétés fonctionnelles du tissu cardiaque native. Nous avons créé ISE-patches de cardiomyocytes dérivé de hiPSC. Nous présentons ici un protocole pour l’induction de la cryoinjury de myocardique ventriculaire gauche chez un cobaye, suivi par l’implantation de hiPSC dérivés ise sur la paroi ventriculaire gauche.

Introduction

Le nombre de patients atteints d’insuffisance cardiaque augmente dans notre population vieillissante. Pour l’insuffisance cardiaque terminale, orthotopic transplantation de coeur est l’option de traitement uniquement curatif. Cependant, en particulier dans les pays européens, il y a une pénurie de donneur d’organes croissante. Par conséquent, les autres traitements possibles sont nécessaires. Réalisations récentes en assistance circulatoire mécanique sont prometteurs, mais surtout à long terme exécutent, limitée par ses effets secondaires tels que saignements, thrombose de la pompe et des complications infectieuses¹.

La capacité de régénération endogène du cœur humain adulte est extrêmement limitée. Par conséquent, des thérapies de régénération cardiaque pourraient devenir une option thérapeutique alternative pour terminale insuffisance cardiaque patients^2,3. Différentes techniques y compris l’injection de cellules à base de cellules souches ou d’un tissu approches techniques ont été décrites^3,4,5.

Les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC), ainsi que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent être efficacement différenciés à battant spontanément des cardiomyocytes humaine⁶, qui a été un succès majeur dans le domaine de la régénération cardiaque thérapies.

Pour remplacer le myocarde après un infarctus du myocarde et d’améliorer le fonctionnement d’un cœur défaillant, la survie d’un nombre adéquat de cardiomyocytes et leurs mécaniques et électriques de couplage avec le cœur natif est essentielle. Afin d’étudier le potentiel des thérapies régénératives cardiaques avec cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines, un modèle de recherche approprié est nécessaire. Le modèle idéal devrait être rentable et avoir un humain-comme la physiologie et l’électrophysiologie. Grands modèles animaux comme des cochons serait idéales de ce point de vue, toutefois, ces expériences sont très coûteux et grandes quantités de cardiomyocytes serait nécessaires pour remplacer un nombre pertinent de cardiomyocytes afin de pouvoir constater les effets sur la ventricule gauche fonction dans un modèle d’infarctus du myocarde de porc.

Pour répondre à des questions biologiques élémentaires vers la régénération cardiaque humaine axée sur la cellule, par exemple, la survie des cellules, vascularisation et couplage électrique, petits modèles animaux sont plus adaptées. De petits modèles animaux disponibles, le cobaye est l’espèce plus utiles, comparativement à des rats et des souris, car leur électrophysiologie ressemble plus étroitement à la situation dans les humains⁷. Dans ce modèle de cochon d’Inde, nous avons induit une cryoinjury transmurale du ventricule gauche. Une semaine après l’induction de l’implantation de l’infarctus du myocarde d’un three-dimensional, battant spontanément des hanches-cellulaire cardiomyocyte patch a été réalisée. La survie des cellules cardiomyocytes a été évaluée à 28 jours après l’implantation par l’examen histologique.

Protocole

Animaux a reçu tous les soins en conformité avec le Guide pour les principes des animaux de laboratoire, préparé par l’Institut des ressources animales de laboratoire et publié par le National Institutes of Health. Tous les protocoles d’animaux ont été approuvés par l’autorité locale responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Hamburg'' / Animal protocole # 109/16).

1. obtenir des animaux

1. Commercialement, obtenir des cochons d’Inde femelles pesant 500 à 600 g.
2. Les loger dans des conditions classiques dans les cages d’animaux. Flux des chow rat standard et autoclavé eau ad libitum.

2. transthoracique échocardiographie

1. Placer le cobaye dans une chambre à induction et anesthésier l’animal à l’isoflurane (2 – 3 %). Vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pied-presseur.
2. Placez le cobaye anesthésié sur une plate-forme de réchauffement de la planète (40 à 42 ° C) en position couchée. Continuer l’anesthésie par un cône de nez (isoflurane 1,5-2 %)
3. Raser et épiler le thorax de pig´s de Guinée à l’aide d’un rasoir électrique de poils.
4. Appliquer le gel de transducteur ultrasonique préchauffée (~ 25 ° C). Utiliser un système d’échocardiographie qui est équipé avec une fréquence de transducteur supérieure à 15 MHz.
5. Acquérir des vues long axe parasternale bidimensionnelle en plaçant la sonde sur le thorax de cochon guinea´s face à partir du cou droit vers la jambe gauche et l’axe le plus long enregistrement images mode B sur le plan de la valve aortique avec une visualisation simultanée de l’apex LV. Enquêter sur la fonction ventriculaire gauche préopératoire.
6. Tourner le transducteur de 90° degrés pour obtenir une vue d’axe court mode B au niveau du milieu de l’année-papillaire.
   Remarque : L’animal est alors immédiatement transféré à la table d’OR. L’animal est continuellement anesthésié à l’isoflurane 3 %. 0,05 mg/kg l’atropine (i.m.) est injecté pour éviter l’augmentation de la sécrétion bronchique au cours de la ventilation mécanique.

3. chirurgie

1. Induction de l’infarctus du myocarde
   1. Injecter par voie sous-cutanée carprofène 4 à 5 mg/kg et la buprénorphine de 0,05 mg/kg pour l’analgésie avec une aiguille de 21 G et une seringue de 10 mL. 0,5 mg/kg l’Atropine est injecté par voie sous-cutanée avec une aiguille de 21 G et une seringue de 10 mL.
   2. Placez le cochon d’Inde sur le dos et garder l’anesthésie avec un masque couvrant le nez et la bouche. Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant les pattes (absence de réflexe de pédale).
   3. Jambes des cobayes écartées et fixer la position à l’aide de ruban adhésif.
   4. Raser la poitrine et dans la région de trachée de l’animal anesthésié avec un rasoir électrique. Désinfecter la zone largement à l’aide de gommage à base d’iode, suivie de l’éthanol à 80 %. Répétez ces étapes de désinfection deux fois.
   5. Effectuer une incision verticale de 1,5 cm dans la zone trachéale et carrément disséquer les muscles couvrant la trachée jusqu'à ce que vous voyiez la trachée. Ponction de la trachée avec canule de 18 G i.v. et insérer la partie souple de la canule comme un tube trachéal.
   6. Raccordez le tube trachéal à un respirateur animal de ventiler en permanence le cochon d’Inde au cours de la procédure.
      Remarque : Maintenant, l’anesthésie est maintenu avec l’isoflurane 3 % via le tube trachéal (inspiration assistée par ventilation avec une pression maximale d’inspiration, fréquence respiratoire : 100 – 120/min, pression de crête inspiration : 18-22 cm de Hg à l’aide de PEEP-ventilation, tandis que le coffre est ouvert ).
   7. Identifier l’espace intercostal^th 5 en comptant les espaces côtes dès le premier espace intercostal. Effectuer une incision horizontale de 2 cm sur le 5ème espace intercostal du côté gauche du cobaye à l’aide de ciseaux et une pince. Insérer un petit enrouleur animal. Disséquer les muscles avec un bistouri électrique jusqu'à ce que les muscles intercostaux sont atteints, qui peut être vu après avoir enlevé le tissu sous-cutané, sont atteints.
   8. Doucement de disséquer les muscles intercostaux avec des pincettes jusqu'à ce que la cavité pleurale est atteinte et on peut voir le poumon gauche à l’avant. Insérer le rétracteur entre les nervures et ouvrez-le avec précaution jusqu'à l’obtention d’une bonne vue du cœur.
   9. Ouvrez le péricarde environ 1 cm de la paroi ventriculaire gauche antérieure dans la région avec des ciseaux. Placez une compresse sur le poumon gauche pour le protéger contre les dommages causés lors de l’induction de la cryoinjury du ventricule gauche.
   10. Placez la pointe d’un cachet érodé en métal (aluminium) avec un diamètre transversal de 0,5 cm dans l’azote liquide pendant 3 min.
   11. Presse l’azote refroidi par la sonde sur la paroi antérieure gauche du cœur pendant 30 s. Puis il se séparent du fond du cœur à l’aide d’un fer à souder électrique (250 ° C) qui est placé à l’intérieur du timbre à réchauffer. Répétez l’opération 3 fois afin d’obtenir une lésion myocardique transmural. Observer la blancheur du myocarde.
   12. Gonfler les poumons avec une pression maximale (en pinçant le tube de sortie du ventilateur pendant 2 s), afin d’éviter une atélectasie du poumon. Retirez le rétracteur de l’espace intercostal.
   13. Fermer les côtes avec deux sutures 3-0. Près de suture des muscles au niveau des côtes avec un 4-0 en cours d’exécution. Fermeture de la peau utiliser unique points de suture 5-0.
   14. Réduire l’isoflurane à 1 %. L’animal respire spontanément, retirez le tube trachéal et continuer d’anesthésie avec un masque facial (isoflurane 2 – 3 %).
   15. S’assurer de l’absence de réflexes en pinçant le membre postérieur pour surveiller une profondeur suffisante de l’anesthésie. Puis utilisez un seul 8-0 suture de fermer le site de ponction à la trachée. Refermer la plaie avec trois sutures simples stich 4-0.
   16. Utilisez buprénorphine (0,05 mg/kg / 12 h) et le carprofène (5 mg/kg / 24h) pour les médicaments contre la douleur pour les 5 jours suivants.
2. Implantation de l’ISE (7 jours après cryoinjury)
   1. Placer le cobaye dans une chambre à induction et anesthésier l’animal à l’isoflurane vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse pour le pied-presseur.
   2. Injecter le carprofène 4 à 5 mg/kg et la buprénorphine de 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée avec une aiguille de 21 G et une seringue de 10 mL après l’induction de l’anesthésie. Placez le cochon d’Inde sur le dos et garder l’anesthésie avec un masque couvrant le nez et la bouche.
      Remarque : Suffisance de l’anesthésie doit être vérifiée en pinçant les pattes postérieures.
   3. Jambes du cochon d’Inde écartées et fixer la position à l’aide de ruban adhésif.
   4. Effectuer la préparation pré-opératoire comme décrit à l’étape 3.1.4–3.1.6. Effectuer une incision horizontale de la peau de 2 cm dans la zone de la cicatrice du côté latéral gauche à l’aide de ciseaux et pince à épiler.
   5. Doucement, disséquer les adhérences extrapleural à l’aide d’un bistouri électrique. Ouvrir soigneusement la cavité pleurale avec des ciseaux. Insérer un épandeur de côtes pour exposer le cœur.
   6. Visuellement identifier la zone de l’infarctus du myocarde par sa couleur pâle en comparaison avec le myocarde sain environnant. Placez le patch de tissu machiné coeur au-dessus de la région de l’infarctus du myocarde.
   7. Fixer avec deux 8-0 sutures sur les deux côtés. Veillez à sécuriser le patch dans la zone non-infarcie du cœur (Figure 1). Gonfler les poumons avec la pression, afin d’éviter une atélectasie du poumon. Retirez le rétracteur de l’espace intercostal.
   8. Fermer les côtes avec deux sutures 3-0. Près de suture des muscles au niveau des côtes avec un 4-0 en cours d’exécution. Fermeture de la peau utiliser unique points de suture 5-0.
   9. Réduire l’isoflurane à 1 %. L’animal respire spontanément, retirez le tube trachéal et continuer d’anesthésie avec un masque facial (isoflurane 2 – 3 %).
   10. S’assurer de l’absence de réflexes en pinçant le membre postérieur pour surveiller une profondeur suffisante de l’anesthésie. Puis utilisez un seul 8-0 suture de fermer le site de ponction à la trachée. Fermer la plaie avec trois single piquer les sutures de 4-0.
   11. Utilisez buprénorphine (0,05 mg/kg / 12 h) et le carprofène (5 mg/kg / 24h) pour les médicaments contre la douleur pour les 5 jours suivants.
   12. Quatre semaines après l’implantation de l’ISE effectuer une échocardiographie transthoracique (tel que décrit à l’étape 2) pour évaluer la fonction Ventriculaire dans le temps.
       Remarque : La fonction Ventriculaire est contrôlée avant l’implantation de l’ISE et 4 semaines après l’implantation à surveiller pour l’amélioration de la fonction cardiaque par implantation d’ISE
   13. Euthanasier l’animal quel protocole IACUC approuvé et explantation chirurgicalement le cœur pour une analyse ultérieure.

Résultats

Ce modèle de cochon d’Inde est un modèle approprié pour étudier la régénération cardiaque après que implantation de hiPSC dérivé d’ISE-patches. Elle conduit façon reproductible à transmurale grandes lésions myocardiques. Taille de la cicatrice est évaluée par histologie quatre semaines après le cryoinjury. Coloration trichrome de Mason révèle transmurale grandes cicatrices (Figure 2). Taille de la cicatrice était similaire entre un grand nombre d’animaux blessés, ce...

Discussion

Il existe une variété de petits modèles animaux étudier l’effet que la transplantation de cellules exerce le cœur blessé^9,10,11. Nous avons choisi un modèle de cobaye à cause de tous les petits animaux modèles sa (électro) physiologie ressemble plus étroitement à celui de l’homme. Les avantages des petits modèles animaux sont logement simple, coûts contrôlables et quelques groupes de travailleurs. En comparais...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)	Kent Scientific
Forene	abbvie	1000009819
Carprofen	Zoetis	256692
Atropin	Braun	PZN 00648037
Buprenorphin	Sigma
Metal stamp
Electric soldering iron	Claytools
3-0 prolene suture	Ethicon
4-0 prolene suture	Ethicon	662SLH
5-0 prolene suture	Ethicon	8710H
8-0 prolene suture	Ethicon	8841H
Tungsten Carbide Scissor	FST	No. 14568-12
Stainless sterilization Container	FST	No. 20890-51
Graefe Forceps	FST	No.11652-10
Extra fine Graefe Forceps	FST	No.11150-10
Forceps	FST	No. 11022-15
Halsted- Mosquito	FST	No. 13009-12
Forceps	FST	No.13003-10
Baby Mixter	FST	No. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws)	FST	No. 12565-14
Needle Holder (Halsey)	FST	No. 12501-13
Alm Retractor with Blumt Teeth	FST	No. 17008-07
Spring Scissor	FST	No. 15000-00
Compress 5x5	Fink + Walter	PZN 08821417
Venflon Pro Safety	Becton Dickinson	PZN11123964
Cautery High Temp 2"	Bovie Medical Corporation	0100607151011055