Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada insan IPS-hücre cardiomyocytes eskiden şiling şimdi domuz modelinde türetilmiş bir kalp kası yama implantasyonu ve ardından sol ventrikül cryoinjury indüksiyon için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Yetişkin memeliler kalbinde sınırlı yenilenme kapasitesi nedeniyle, miyokard infarktüsü, cardiomyocytes geri dönüşü olmayan bir kaybına sonuçlanır. Bu kaybı kalp kası alakalı miktarda kütle kalp yetmezliği neden olabilir. Kalp transplantasyonu yanı sıra, son aşama kalp yetmezliği için iyileştirici tedavi seçeneği yoktur. Organ bağışı yetersizliği dönemlerinde, organ bağımsız tedavi şekilleri ihtiyaç vardır. Sol Ventriküler yardımcı umut verici bir tedavi seçeneği ancak, özellikle hedef tedavi yan etkileri inme, enfeksiyonlar ve kanamalar gibi sınırlı olarak aygıtlardır. Son yıllarda kök hücre enjeksiyon, kardiyak ataları veya miyokard doku Mühendisliği dahil olmak üzere çeşitli kardiyak onarım stratejiler araştırdık. Büyük miktarda İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC) elde edilen cardiomyocytes farklılaşma hücre biyolojisi son gelişmeler sağlar. Şu anda değerlendirme altında kalp onarım stratejileri yapay kalp doku nakli için biridir. Mühendislik kalp doku (EHT) bir yerli kalp doku fonksiyonel özellikleri ile üç boyutlu tüp bebek oluşturulan cardiomyocyte ağdır. HiPSC türetilen cardiomyocytes EHT-yamalar oluşturduk. Burada bir kobay hiPSC implantasyonu tarafından takip içinde sol ventrikül miyokard cryoinjury indüksiyon EHT sol Ventriküler duvarda türetilmiş için bir iletişim kuralı mevcut.

Giriş

Kalp yetmezliği olan hastalarda sayısı bizim yaşlanan nüfus artmaktadır. Son aşama kalp yetersizliği, orthotopic kalp nakli sadece iyileştirici tedavi seçeneğidir. Ancak, özellikle Avrupa ülkelerinde artan bir organ donör sıkıntısı var. Bu nedenle, alternatif tedavi seçenekleri gereklidir. Mekanik dolaşım destek son başarıları umut verici, ama özellikle uzun vadeli çalıştırmak, kanama, pompa trombozu ve bulaşıcı komplikasyonlar1gibi yan etkileri ile sınırlı.

Yetişkin insan kalbi endojen yenilenme kapasitesi son derece sınırlıdır. Bu nedenle, kardiyak rejenerasyon terapileri son aşama kalp yetmezliği hastaların2,3için bir alternatif tedavi seçeneği haline gelebilir. Hücre kök hücre tabanlı enjeksiyon veya doku Mühendisliği yaklaşımlar olmuştur dahil olmak üzere farklı teknikleri3,4,5nitelendirdi.

İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC), aynı zamanda insan embriyonik kök hücreleri (hESC) etkin bir şekilde kendiliğinden insan cardiomyocytes6, hangi kalp rejeneratif alanında büyük bir başarı olmuştur dayak için ayrıştırılan terapiler.

Cardiomyocytes ve mekanik ve elektrik ile yerel kalp kaplin uygun bir dizi yaşama Miyokardiyum akut miyokard infarktüsü sonrası değiştirmek için ve başarısız olan kalp fonksiyon geliştirmek için önemlidir. Kardiyak rejeneratif terapileri ile insan IP'leri türetilmiş hücre cardiomyocytes potansiyelini araştırmak için uygun araştırma modeli gereklidir. Ideal modeli düşük maliyetli olmalı ve bir insan benzeri fizyolojisi ve Elektrofizyoloji. Domuz gibi büyük hayvan modeller bu bakış açısından ideal olacaktır, ancak, bu deneylerin çok pahalıdır ve cardiomyocytes büyük miktarda sol ventrikül etkilerini görmek için cardiomyocytes uygun sayısını değiştirmek için gerekli olacak bir domuz infarktüsü modelindeki işlev.

Hücre tabanlı insan kalp rejenerasyon doğru temel biyolojik soruları cevaplamak için örneğin, hücre hayatta kalma, vaskülarizasyon ve elektrik kaplin, küçük hayvan modelleri daha uygundur. Onların Elektrofizyoloji daha çok insanlar7durumda benzeyen gibi kullanılabilir küçük hayvan modellerden, eskiden şiling şimdi domuz en yararlı, sıçanlar ve fareler, karşılaştırıldığında türüdür. Bu eskiden şiling şimdi domuz modelinde, sol ventrikül transmural cryoinjury indüklenen. Bir hafta sonra bir üç boyutlu, miyokard infarktüsü implantasyonu indüksiyon kendiliğinden kalça-hücre elde edilen cardiomyocyte yenerek yama gerçekleştirildi. Cardiomyocyte hücre survival implantasyonu sonrası 28 gün histolojik inceleme tarafından incelendi.

Protokol

Hayvan insana ilişkin Bakım Kılavuzu laboratuvar hayvanlarının ilkeleri için uygun olarak alınan, Enstitüsü ile laboratuvar hayvan kaynakları tarafından hazırlanan ve ulusal sağlık Enstitüleri tarafından yayınlandı. Tüm hayvan iletişim kuralları sorumlu yerel otorite tarafından kabul edildi ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt Hamburg'' / hayvan iletişim kuralı # 109/16).

1. hayvan alın

  1. Ticari olarak 500-600 g ağırlığındaki kadın eskiden şiling şimdi pigs elde edilir.
  2. Onları hayvan kafeslerde geleneksel koşullarda ev. Standart fare chow ve autoclaved su reklam libidum beslemek.

2. Transtorasik Ekokardiyografi

  1. Eskiden şiling şimdi domuz bir indüksiyon odasında yerleştirin ve hayvan isoflurane (2-%3) ile anestezi. Anestezi derinliği yanıt-e doğru ayak parmağı-tutam eksikliği ile kontrol edin.
  2. Isınma bir platformda (40-42 ° C) imzalat eskiden şiling şimdi domuz sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anestezi burun konisi (isoflurane % 1.5-2) ile devam
  3. Tıraş ve bir elektrik hayvan kılı tıraş makinesi kullanarak Gine pig´s göğüs depilate.
  4. Prewarmed (~ 25 ° C) ultrason dönüştürücü jel uygulayın. 15 MHz yüksek bir dönüştürücü frekans ile donatılmış bir Ekokardiyografi sistemi kullanın.
  5. İki boyutlu parasternal uzun eksen Gösterim elde etmek sol bacak ve kayıt uzun ekseni doğru doğru boynundan B-modundaki görüntüler, aort kapak uçak LV apex bir eş zamanlı görselleştirme ile karşı karşıya guinea´s domuz göğüs üzerinde dönüştürücü yerleştirerek. Pre-operative sol ventrikül fonksiyonları araştırmak.
  6. Dönüştürücü Papiller düzeyde kısa eksen B-mod görünümü elde etmek için 90 ° derece kapatın.
    Not: Hayvan hemen OR tabloya aktarılır. Hayvan sürekli olarak % 3 isoflurane ile anestezi. 0,05 mg/kg atropin (sohbet) mekanik havalandırma sırasında artan bronş salgı önlemek için enjekte edilir.

3. cerrahi

  1. Miyokard İnfarktüsü indüksiyon
    1. 4-5 mg/kg carprofen ve analjezi için 0,05 mg/kg buprenorfin subkutan 21 G iğne ve 10 mL şırınga ile enjekte et. 0.5 mg/kg atropin subkutan 21 G iğne ve 10 mL şırınga ile enjekte edilir.
    2. Eskiden şiling şimdi domuz sırtında yerleştirin ve anestezi ağız ve burun kapsayan bir sağlamlılık ile tutun. Anestezi derinliği arka ayakları (pedal refleks eksikliği) pinching tarafından kontrol edin.
    3. Eskiden şiling şimdi pigs Bacaklarını ayır ve bant kullanarak pozisyonu düzeltmek.
    4. Göğüs ve imzalat hayvan trakeal bölgesinin bir Elektrikli tıraş makinesi ile tıraş. Yaygın olarak % 80 etanol tarafından takip, iyot tabanlı scrub kullanarak alan dezenfekte. Bu dezenfeksiyon adımları iki kez tekrarlayın.
    5. 1,5 cm dikey kesi trakeal alanında gerçekleştirmek ve açık açık Trakea görene Trakea kapsayan kas incelemek. 18 G IV kanül ile Trakea ponksiyon ve trakeal tüp olarak kanül esnek parçası ekleyin.
    6. Trakeal tüp sürekli işlem sırasında eskiden şiling şimdi domuz havalandırmak için hayvan bir gaz maskesi takın.
      Not: Şimdi anestezi isoflurane %3 trakeal tüp yoluyla korunur (ilham yoluyla en fazla ilham basıncı, solunum hızı ile havalandırma: 100-120/dk, tepe ilham basınç: 18-22 cm Hg göğüs açıkken PEEP-havalandırma kullanarak ).
    7. 5th interkostal alan birinci interkostal boşluk başlayan kaburga alanlarda sayarak tanımlayın. 2 cm yatay kesi 5 interkostal yer eskiden şiling şimdi domuz makas ve bir cımbız kullanarak sol tarafında gerçekleştirmek. Küçük bir hayvan Retraktörü yerleştirin. Kas incelemek bir elektrokoter ile interkostal kaslara ulaşana kadar hangi-ebilmek var olmak seen subkutan doku çıkardıktan sonra ulaştı.
    8. Yavaşça interkostal kaslara kadar plevral boşluk ulaştı ve bir ön sol akciğer görebilirsiniz cımbızla incelemek. Retraktörü kaburgalar arasında yerleştirin ve kalbin iyi bir görünüm elde edilir kadar dikkatlice açın.
    9. Kalp zarını yaklaşık 1 cm ön sol ventrikül duvar bölgede makasla açın. Bir sıkıştırma ne zaman sol ventrikül cryoinjury inducing zararlardan korumak için sol akciğer yerleştirin.
    10. Bir erozyona uğramış metal damgası (alüminyum) ucuyla bir kesit çapı 0.5 cm 3 min için sıvı azot yerleştirin.
    11. Basın azot soğutmalı kalbin sol ön duvar üzerine soruşturma için 30 s. Sonra bir elektrik bu ısınmak için belgili tanımlık damgalamak içinde yerleştirilir havya (250 ° C) kullanarak kalp ayırmak. Bu yordamı bir transmural miyokard hasarı elde etmek için 3 kez tekrarlayın. Miyokardiyum sarararak gözlemlemek.
    12. Maksimum basınç ile akciğerleri şişirmek (2 için havalandırma çıkım tüp sıkma tarafından s), akciğerin atelectasis önlemek için. Retraktörü interkostal uzaydan kaldırın.
    13. Kaburga iki 3-0 dikişler ile kapatın. Yakın üzerinden 4-0 çalışan ile kaburga kasları dikiş. 5-0 sütür tek dikiş cilt kapatılması için kullanın.
    14. İsoflurane %1 azaltır. Ne zaman hayvan kendiliğinden nefes alıyor, trakeal tüp kaldırmak ve anestezi sağlamlılık (isoflurane 2-%3) ile devam.
    15. Reflekslerin yokluğu yeterli anestezi derinliği izlemek için arka bacak pinching tarafından temin ederim. Sonra tek bir 8-0 kullanın Trakea ponksiyon sitesinde kapatmak için dikiş. Üç tek dikiş 4-0 dikiş yarayla kapatın.
    16. Buprenorfin (12 h başına 0,05 mg/kg) ve carprofen (5 mg/kg / 24 h) ağrı kesici aşağıdaki 5 gün için kullanın.
  2. EHT (7 gün cryoinjury sonra) implantasyonu
    1. Eskiden şiling şimdi domuz bir indüksiyon odasında yerleştirin ve yanıt-e doğru ayak parmağı-tutam eksikliği ile isoflurane onay anestezi derinliği hayvanla anestezi.
    2. 4-5 mg/kg carprofen ve 0,05 mg/kg buprenorfin subkutan 21 G iğne ve 10 mL şırınga ile anestezi indüksiyon sonra enjekte edin. Eskiden şiling şimdi domuz sırtında yerleştirin ve anestezi ağız ve burun kapsayan bir sağlamlılık ile tutun.
      Not: Anestezi yeterliliği arka ayakları pinching tarafından kontrol edilmelidir.
    3. Eskiden şiling şimdi domuz Bacaklarını ayır ve bant kullanarak pozisyonu düzeltmek.
    4. Önceden cerrahi hazırlıklar adım 3.1.4–3.1.6 içinde açıklandığı gibi gerçekleştirin. 2 cm yatay cilt kesi makas ve cımbız kullanarak sol yan yan yara alanında gerçekleştirmek.
    5. Yavaşça bir elektrokoter kullanarak extrapleural yapışıklıklar incelemek. Dikkatle plevral boşluk makasla açın. Kalp ortaya çıkarmak için bir kaburga ayırıcı ekleyin.
    6. Görsel olarak sağlıklı çevre Miyokardiyum ile karşılaştırıldığında soluk rengini tarafından infarktüsü bölgesi tanımlayın. Mühendislik kalp doku yama infarktüsü bölge üzerinde bir yer.
    7. İki 8-0 ile güvenli Her iki taraf, dikiş. Yama (şekil 1) gönül hazır olmayan alanda güvenli olduğundan emin olun. Akciğerin atelectasis önlemek için baskı, akciğerlere şişirmek. Retraktörü interkostal uzaydan kaldırın.
    8. Kaburga iki 3-0 dikişler ile kapatın. Yakın üzerinden 4-0 çalışan ile kaburga kasları dikiş. 5-0 sütür tek dikiş cilt kapatılması için kullanın.
    9. İsoflurane %1 azaltır. Ne zaman hayvan kendiliğinden nefes alıyor, trakeal tüp kaldırmak ve anestezi sağlamlılık (isoflurane 2-%3) ile devam.
    10. Reflekslerin yokluğu yeterli anestezi derinliği izlemek için arka bacak pinching tarafından temin ederim. Sonra tek bir 8-0 kullanın Trakea ponksiyon sitesinde kapatmak için dikiş. Yakın üç tek yarayla 4-0 Dikiş dikiş.
    11. Buprenorfin (12 h başına 0,05 mg/kg) ve carprofen (5 mg/kg / 24 h) ağrı kesici aşağıdaki 5 gün için kullanın.
    12. EHT implantasyonu sonrası dört hafta Transtorasik Ekokardiyografi LV fonksiyonu zamanla izlemek için (2. adımda açıklandığı gibi) gerçekleştirin.
      Not: LV fonksiyonu EHT implantasyon ve kardiyak fonksiyon iyileştirilmesi için izlemek için EHT implantasyon tarafından implantasyonu sonrası 3 hafta önce izlenir
    13. Hayvan hangi onaylanmış IACUC Protokolü ötenazi ve cerrahi olarak daha ayrıntılı bir çözümleme için kalbi explant.

Sonuçlar

Bu eskiden şiling şimdi domuz modeli hiPSC implantasyonu EHT-yamalar türetilmiş sonra kalp rejenerasyon araştırmak için uygun bir modeldir. O tekrarlanarak büyük transmural miyokard yaralanmalara yol açar. Yara izi boyutu dört hafta sonra cryoinjury Histoloji tarafından değerlendirilir. Mason trichrome boyama büyük transmural izleri (Şekil 2) ortaya koymaktadır. Yara izi boyutu çok sayıda yaralı hayvanları tekrarlanabilirlik8yüksek derecede yans?...

Tartışmalar

Küçük hayvan modelleriyle hücre transplantasyonu yaralı kalpler9,10,11' giderek artan etkisi eğitim kullanılabilir. Eskiden şiling şimdi domuz manken tüm küçük hayvan yüzünden onun (Elektro) modelleri seçtik fizyolojisi bu insanların en çok benzer. Küçük hayvan modelleri basit konaklama, yönetilebilir maliyeti ve birkaç işgücünün avantajları. Fare ve sıçanlar ile karşılaştırıldığında, Gine p...

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirmek için yok.

Teşekkürler

Hiçbir fon bu çalışma için kabul edildi

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ventilator (VetFlo Dual Mode)Kent Scientific
Foreneabbvie1000009819
CarprofenZoetis256692
AtropinBraunPZN 00648037
BuprenorphinSigma
Metal stamp
Electric soldering ironClaytools
3-0 prolene sutureEthicon
4-0 prolene sutureEthicon662SLH
5-0 prolene sutureEthicon8710H
8-0 prolene sutureEthicon8841H
Tungsten Carbide Scissor FSTNo. 14568-12
Stainless sterilization ContainerFSTNo. 20890-51
Graefe ForcepsFSTNo.11652-10
Extra fine Graefe ForcepsFSTNo.11150-10
ForcepsFSTNo. 11022-15
Halsted- MosquitoFSTNo. 13009-12
ForcepsFSTNo.13003-10
Baby MixterFSTNo. 13013-14
Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws) FSTNo. 12565-14
Needle Holder (Halsey)FSTNo. 12501-13
Alm Retractor with Blumt TeethFSTNo. 17008-07
Spring ScissorFSTNo. 15000-00
Compress 5x5Fink + WalterPZN 08821417
Venflon Pro SafetyBecton DickinsonPZN11123964
Cautery High Temp 2"Bovie Medical Corporation0100607151011055

Referanslar

  1. Kirklin, J. K., et al. Seventh INTERMACS annual report: 15,000 patients and counting. The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 34, 1495-1504 (2015).
  2. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis. Circulation research. 83, 15-26 (1998).
  3. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Current pharmaceutical design. 15, 2791-2806 (2009).
  4. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  5. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Watanabe, T., Rautaharju, P. M., McDonald, T. F. Ventricular action potentials, ventricular extracellular potentials, and the ECG of guinea pig. Circulation research. 57, 362-373 (1985).
  8. Weinberger, F., et al. Cardiac repair in guinea pigs with human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 8, 363ra148 (2016).
  9. Shiba, Y., et al. Electrical Integration of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in a Guinea Pig Chronic Infarct Model. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapy. 19, 368-381 (2014).
  10. van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem cell research. 1, 9-24 (2007).
  11. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature medicine. 12, 452-458 (2006).
  12. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of surgery. 140, 675-682 (1954).
  13. van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Heart and circulatory physiology. , H1291-H1300 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 145Engineered kalp dokucardiomyocytescryoinjuryeskiden iling imdi domuzkalp kas yamaIPS h creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır