免疫荧光定量小鼠脑突触蛋白的异种分布

摘要

在这里, 我们描述了一种定量的方法来确定突触蛋白相对于标记蛋白使用免疫荧光染色, 共聚焦显微镜, 和基于计算机的分析。

摘要

特定突触蛋白的存在、缺失或水平会严重影响突触的传播。除了阐明蛋白质的功能外, 还必须确定其分布。在这里, 我们描述了一个使用免疫荧光、共聚焦显微镜和基于计算机的分析来确定突触蛋白 mof (也称为 tprgl 或 synaptic) 的分布的协议。我们比较了切除物与突触泡蛋白突触素的分布, 从而定量地确定了运动物相对于突触囊泡丰度的分布。值得注意的是, 这种方法有可能被采用, 以便利用不同的抗体或显微镜或在不同的研究中比较蛋白质的分布。我们的方法通过产生比而不是绝对荧光水平来规避免疫荧光污渍的固有变异性。此外, 我们描述的方法使研究人员能够分析蛋白质在不同层次上的分布: 从整个大脑切片到大脑区域, 再到大脑区域的不同次区域, 如海马或感觉的不同层皮层。马剂是一种脊椎动物特有的蛋白质, 与突触囊泡有关。通过这种方法, 我们表明, 蒙特是异质分布在大脑的各个区域, 在腹侧苍白, 隔膜核, 杏仁核的高水平, 也在单个大脑区域, 如海马的不同层。

引言

神经元之间的通信发生在称为突触的特殊接触点。突触包含无数不同的蛋白质, 这些蛋白质协调着突触的传递。其中一些蛋白质在整个神经系统中表现出异质分布, 并不是在每个突触1中都存在。这种蛋白质的一个例子是 munc13, 它参与了突触囊泡的启动过程。munc13 有不同的等形, 它们在整个大脑^中分布不均, 而特定等形的存在或不存在会影响短期突触可塑性和突触囊动力学^{3,4 个,5}. 因此, 能够识别大脑各区域存在不同的突触蛋白至关重要。

突触蛋白的定量选择方法--到目前为止--是质谱和西方印迹, 而不是免疫组织^{化学 6,7},^8,9。在某些情况下, 有几种方法相互补充, 以评估特定蛋白质的数量和定位 (即wilhelm等人).¹⁰). 我们在这里描述的方法允许对感兴趣的蛋白质进行定位和定量, 而无需使用任何生化方法, 只需使用免疫荧光污渍。这里的另一个优点是, 量化可以在比其他方法实现的更小的区域上进行, 因此也可以更具体。然而, 人们必须考虑到, 需要一种可靠的参考蛋白质来评估感兴趣的蛋白质的分布。

免疫组织化学的荧光染色使我们能够例行识别蛋白质在大脑区域以及不同神经元隔间内的定位。若要标识不同的隔间, 请使用特定标记。通常情况下, 抗突触素和突触素¹¹的抗体可用于标记突触囊泡, 而针对巴松突的抗体标记突触前^{端子 12}的活动区。水泡转运体, 如水泡谷氨酸转运体 (vglot) 或水泡 gaba 转运体 (vgat), 分别用于标记^兴奋13 和抑制^{性 14}前突触前端子。在突触后, 针对荷马蛋白的抗体可用于标记突触后端子, 而针对突触后密度蛋白 95 (psd95)^15、16、17或 gephyrin¹⁸的抗体可用于标记突触后端子。^,19,20可分别标记兴奋或抑制突触后端子。通过对感兴趣的蛋白质和标记 (如上面描述的) 使用抗体, 可以确定这种蛋白质的定位。迄今为止, 许多研究都以定性的方式做到了这一点。然而, 要可靠地确定特定突触蛋白的差异分布, 不仅必须确定其存在或缺失, 还必须确定其相对浓度。突触的大小和密度的异质性使得建立突触标记和感兴趣的蛋白质之间的比例变得很重要。否则, 突触丰富的区域, 如海马的非锥体层和小脑的分子层, 将显示突触蛋白的高密度, 这只是由于突触的密度较高, 但不是由于该蛋白的强大存在每个突触 (例如, wallrafen 和 dresbach¹)。另一方面, 由于神经元细胞体浓度高, 神经元 soma 中的蛋白质 (例如tgn38 22) 通常会在海马锥体细胞层或海马或小脑颗粒层中显示出强烈的存在在这些地区。因此, 这种结构的非均匀分布, 在这种情况下是突触, 会导致对感兴趣的蛋白质本身的分布的错误估计。此外, 免疫组织化学污渍样品的染色强度存在内在差异。这里描述的协议考虑到了这一点, 避免了这种偏见, 以及免疫组织化学方法引起的其他警告。

在我们最近的研究中, 我们用这种方法来描述 mof (也称为 tprgl²³或 sap30²⁴) 在16个不同大脑区域¹的差异表达。m接管是一种脊椎动物特异性突触蛋白, 可与突触囊泡有关, 并影响神经递质释放^25,26,^27.我们有相关的运动表达突触囊的丰富, 通过染色突触素作为突触囊参考标记。我们发现了高水平的 mof, 特别是在隔膜核, 腹侧苍白, 和杏仁核。在海马区内, 我们发现了一个均匀分布的 mof, 与海马内计算相关的层数较高, 在输入和输出层的水平较低。

研究方案

该协议不涉及对活体动物的实验。当地动物保护当局 (Tierschutzkommission der university ätsmedizin göttingen) 根据 t 10/30 号批准了涉及动物安乐死以获得大脑样本的实验。

注: 该方案使用了3例成年雄性 c57bl6 小鼠。

1. 样品制备

1. 制备固定剂和 0.1 m 磷酸盐缓冲液 (pb; 见表 1)。
2. 修复动物通过经心灌注如 gage 等人所述.²⁸. 首先用0.9% 的 nacl 溶液冲洗血液, 然后用30% 的4% 甲醛 (pfa) 冲洗血液。
3. 用剪刀打开头骨, 用带有钝器边缘的勺子仔细隔离大脑, 以避免破坏组织。
4. 在4°c 的情况下, 用4% 的 pfa 在4°c 下隔夜填充一个50毫升的反应管, 并将其固定在4% 的 pfa 中。
5. 取出固定装置, 在振动台上用 0.1 m pb 的50毫升清洗大脑30分钟。
6. 洗涤后, 将大脑在 0.1m pb 中30% 蔗糖中的50毫升反应管中孵育 48小时, 或直到在4°c 的试管中沉入试管保护。
7. 用锋利的刀片修剪受低温保护的大脑, 将其放入低温, 并将其嵌入最佳切割温度 (oct) 化合物。避免气泡。将大脑定向, 并将冷冻器冷冻在-80°c 的冰柜中。
8. 安装冷冻组织进行切片。将组织平衡到低温温度至少15分钟后再切片。
9. 将大脑分成25微米厚的冠状切片。在不接触脑组织的情况下, 用玻璃钩仔细触摸 oct。在一个24井板中收集每口井3个相邻的切片, 并在4°c 下将其存储在 0.1 m pb 中, 直到染色。
   注: 协议可以在这里暂停长达两周。较长的储存时间会影响组织质量, 从而影响实验结果。

2. 免疫荧光

1. 准备解决方案, 包括阻滞缓冲液、抗体缓冲液、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液 2 (见表 1)。
2. 用 pb 冲洗切片一次, 以去除多余的 oct。
   1. 用塑料移液器取出溶液, 而不吸进大脑切片。加入250μl 新鲜 pb, 配上1000μl 移液器。
      注意: 切片不应干涸, 因此应去除并很好地添加液体。
3. 用塑料移液器取出 pb, 用1000μl 移液器为每口井添加250μl 的封堵缓冲液。在室温下 (rt) 在振动台上孵化3小时。
4. 在培养过程中, 稀释反应管中抗体缓冲液中的原代抗体。每口使用250μl 抗体缓冲液, 并使用2μl 移液器将其直接移液输送到溶液中, 以适当的抗体量 (见表 2) 添加。通过多次轻轻向上和向下移液混合溶液。涡旋后不久, 以确保适当的混合。
   注: 要确定背景荧光, 也应在不添加原代抗体的情况下进行染色。为此, 根据该协议在没有原发抗体的情况下, 在抗体溶液中孵育切片。
5. 孵育时间后, 用塑料移液器去除阻滞剂, 每口加入含有原代抗体的250μl 抗体溶液。在振动台上, 用原代抗体在4°c 下隔夜进行切片。
6. 第二天, 用洗涤器 1 3倍清洗切片 10分钟, 在振动筛上的 rt。
   1. 用塑料移液器取出介质, 每口加入300μl 洗涤缓冲液1。在 rt 下孵化 10分钟, 重复3次。
7. 在洗涤步骤中, 稀释反应管中抗体缓冲液中的氟耦合二级抗体。每口使用250μl 抗体缓冲液, 并使用2μl 移液器将其直接移液输送到溶液中, 以适当的抗体量 (见表 2) 添加。通过多次轻轻向上和向下移液混合溶液。涡旋后不久, 以确保适当的混合。
   注意: 由于抗体是感光性的, 因此从这一点开始的所有步骤都需要在黑暗中执行。
8. 清洗步骤完成后, 用塑料移液器去除洗涤缓冲液, 并添加250μl 抗体溶液, 每口井含有二级抗体。在黑暗中用二级抗体将切片在 rt 中培养90分钟。
9. 用洗涤缓冲液 2 3倍清洗切片10分钟。
10. 在洗涤步骤中, 在 0.1 m pb 中稀释 4 '、6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi), 浓度为1:2000。
11. 用塑料移液器取出洗涤缓冲液 2, 每口添加250μl 的 dapi 溶液。在振动筛上的 rt 上孵化5分钟。
12. 用塑料移液器取出 dapi 溶液, 用1000μl 移液器每口添加 500μl 0.1 m pb。
13. 将切片安装在显微镜幻灯片上。
    1. 将显微镜幻灯片放在立体显微镜下。使用精细画笔, 在幻灯片上添加三个 0.1 m pb 的单独滴。将每滴一片放在显微镜幻灯片上。
    2. 使用精细的画笔将显微镜幻灯片上的切片压平并定向。
    3. 当所有切片都正确定位时, 用纸巾取出多余的 pb, 并小心擦干幻灯片。
       注意: 避免完全干燥大脑切片。
    4. 在幻灯片上添加80μl 的嵌入介质。小心地将盖板放到幻灯片上, 从而嵌入大脑切片。
    5. 将幻灯片放在烟罩中干燥 1-2小时 (覆盖以避免光线照射), 并将其存放在4°c 的显微镜幻灯片盒中。
       注: 协议可以在此处暂停。

3. 成像

1. 嵌入介质完全硬化后, 将显微镜滑块置于共聚焦显微镜下。
   注: 荧光显微镜与反卷积软件相结合, 应产生类似的图像质量。
2. 通过增加或减少每个通道的激光强度来调整激光设置, 以便少数像素过度曝光, 从而确保灰度值的最大分布。
3. 获取不同通道的整个脑片的虚拟组织。
   1. 在成像软件 (请参阅材料表) 中, 选择 "磁贴" 选项, 然后使用"平铺区域设置" 手动描述大脑切片。
   2. 在整个磁贴区域中分配支持点, 并通过按"验证磁贴区域" 调整不同支持点的焦点...
   3. 根据所需的分辨率和生成的图像的文件大小调整采集模式下的设置, 然后开始扫描。
4. 扫描完成后, 使用"缝合" 功能处理虚拟组织。将文件导出为具有 "图像导出" 功能的. tif。

4. 基于计算机的分析

1. 通过单击 "文件", 将一个图像的所有单个通道加载到 fiji 29 中打开, 打开
2. 使用"徒手选择" 工具, 在 dapi 通道中描绘一个半球。通过单击"编辑" 创建所选内容的遮罩选型创建遮罩。
3. 通过单击"分析" 确定单通道 (鼠标和突触素) 的平均荧光强度测量。
   注: 请确保选择不同的通道, 以确定每个通道的平均荧光强度值。
4. 将单个通道的平均荧光强度复制到电子表格中。
5. 通过使用徒手选择工具也划定该区域, 确定感兴趣区域内单个通道的平均荧光强度。使用鼠标大脑地图集作为参考。
6. 对所有半球和所有感兴趣的领域重复步骤 4.1-4.5。
   注: 分别确定每个半球的值, 以便以后将感兴趣区域中的值与半球区域的值进行比较 (见步骤 5.2)。

5. 数据处理

1. 如果背景荧光是高的 (参见讨论), 可能需要背景减法。为此, 确定在没有初级抗体的情况下对参考蛋白 (这里: 突触素) 加工的切片的平均荧光强度, 并从大脑区域和半球获得的所有值中减去该值。
2. 在确定了每个半球和每个感兴趣区域的单通道的平均荧光强度 (见表 3) 后, 通过将 more 值除以突触素值来计算 mor弗与突触素的比率 (见表 3) (表 3中的黄色)。对每个半球和感兴趣的领域分别执行此操作。
3. 将一个感兴趣区域获得的比率除以为相应半球获得的比率 (表 3中的橙色), 以确定感兴趣区域与半球的比率。
4. 要确定相对的 mover 丰度, 请通过确定其与1的偏差 (表 3中的红色), 将5.2 中获得的比率转换为百分比。因此, 1.25 的比率将使相对的马网丰度高于平均水平 25%, 而0.75 的比率将使相对的马网丰度低于平均水平25%。

结果

图 1显示了不同标记的代表性染色模式。模式因蛋白质的分布而异。五个星冠水平的例子在 (a)-(e) 列中显示。第一行显示了具有代表性的 dapi 染色: dapi 粘附于细胞的 dna 上, 因此细胞核被染色。这将导致点状图案。具有高细胞密度的区域比细胞密度较低的区域更明亮。在第二行可以看到异质分布蛋白的一个例子。马弗染色显?...

讨论

这里提出的方法是量化感兴趣的蛋白质相对于已知分布的标记蛋白的丰度的分布。免疫荧光染色可显示不同切片之间染色强度的高变异性。这里描述的量化方法通过确定整个半球感兴趣的蛋白质与平均值的比率来规避这个问题。因此, 不同切片的染色强度被取消, 并允许定量描述。

与每一个免疫荧光协议一样, 定性或定量, 有几个因素会影响成功, 从而混淆分析。因此, 应特别?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft