Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Resumo

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Resumo

A presença, ausência ou níveis de proteínas específicas sinápticas severamente podem influenciar a transmissão sináptica. Além de elucidar a função de uma proteína, é vital para determinar também sua distribuição. Aqui, descrevemos um protocolo empregando imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseados em computador para determinar a distribuição da proteína sináptica Mover (também chamado TPRGL ou SVAP30). Comparamos a distribuição de motor para que a vesícula sináptica proteína Sinaptofisina, desse modo, determinar a distribuição de Mover de forma quantitativa em relação a abundância das vesículas sinápticas. Notavelmente, esse método poderia potencialmente ser implementado para permitir a comparação da distribuição de proteínas usando anticorpos diferentes ou microscópios ou em diferentes estudos. Nosso método contorna a variabilidade inerente de imunofluorescência citológicas por rendendo uma relação, ao invés de níveis absolutos de fluorescência. Além disso, descrevemos o método permite que o pesquisador analisar a distribuição de uma proteína em diferentes níveis: de fatias de cérebro inteiro para regiões do cérebro para diferentes sub-regiões na área do cérebro, como as diferentes camadas do hipocampo ou sensorial córtices. Motor é uma proteína de vertebrado específico que está associada com vesículas sinápticas. Com esse método, nós mostramos que o motor é heterogénea em todas as áreas do cérebro, com níveis elevados no pallidum ventral, os núcleos septais e a amígdala e também dentro de áreas do cérebro único, tais como as diferentes camadas do hipocampo.

Introdução

Comunicação entre os neurônios acontece em sites especializados de contato chamados sinapses. Sinapses contêm uma miríade de diferentes proteínas que orquestrar a transmissão sináptica. Algumas dessas proteínas mostram uma distribuição heterogênea em todo o sistema nervoso e não estão presentes em cada sinapse¹. Um exemplo de tal uma proteína é Munc13, que está envolvida no processo de preparação das vesículas sinápticas. Existem diferentes isoformas de Munc13, que são distribuídas de forma heterogénea ao longo do cérebro², e a presença ou ausência de isoformas específicas pode influenciar a curto prazo plasticidade sináptica e vesícula sináptica dinâmica^{3, 4 , 5}. portanto, é de vital importância para ser capaz de identificar a presença de diferentes proteínas sinápticas em todas as áreas do cérebro.

Os métodos de escolha para quantificação de proteínas sinápticas - até agora - são espectrometria de massa e mancha ocidental, ao invés de immunohistochemistry^6,7,8,9. Em alguns casos, vários métodos são usados para se complementam para avaliar tanto a quantidade e a localização de proteínas específicas (ou seja, Wilhelm et al . ¹⁰). o método descrevemos aqui permite a localização e quantificação de proteínas de interesse sem a necessidade de usar qualquer método bioquímico, simplesmente empregando colorações de imunofluorescência. Outra vantagem aqui é que a quantificação pode ser feita sobre áreas muito menores e, portanto, mais específicos, do que aqueles obtidos por outros métodos. No entanto, é preciso levar em consideração que uma proteína de referência confiável é necessária para avaliar a distribuição da proteína de interesse.

Coloração fluorescente por imuno-histoquímica permite identificar rotineiramente a localização de proteínas em todas as áreas do cérebro, bem como no âmbito de diferentes compartimentos neuronais. Para identificar os diferentes compartimentos, marcadores específicos são utilizados. Normalmente, os anticorpos contra synapsin e Sinaptofisina¹¹ podem ser usados para rotular vesículas sinápticas, enquanto anticorpos contra Fagote rotular a zona ativa de um terminal pré-sináptica¹². Os transportadores vesiculares, tais como os transportadores de glutamato vesicular (vGluT) ou transportador vesicular de GABA (vGAT), são usados para rotular excitatórios¹³ e inibitórios¹⁴ terminais pré-sináptica, respectivamente. No lado pós-sináptica, anticorpos contra a proteína de Homer podem ser empregados para marcar terminais pós-sinápticos e anticorpos contra a densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95)^15,16,17 ou gephyrin^{18 , 19 , 20} pode rotular terminais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios, respectivamente. Usando anticorpos contra uma proteína de interesse e marcadores tais como as descritas acima, pode-se determinar a localização de tais proteínas. Muitos estudos até à data este feito em uma maneira qualitativa²¹. No entanto, para determinar a distribuição diferencial de uma proteína sináptica específica de forma fiável, um deve não somente determinar sua presença ou ausência, mas também sua concentração relativa. A heterogeneidade de tamanhos e densidade de sinapses tornam importante estabelecer uma relação entre o marcador sináptico e a proteína de interesse. Caso contrário, regiões de sinapse-ricos tais como as camadas não-piramidais do hipocampo e a camada molecular do cerebelo mostrará uma alta densidade de proteínas sinápticas, apenas devido à maior densidade de sinapses, mas não devido a uma forte presença de proteínas na cada sinapse (por exemplo, Wallrafen e Dresbach¹). Por outro lado, as proteínas no soma neuronal (por exemplo, TGN38²²) mostrará geralmente forte presença na célula piramidal hippocampal camada ou camada de célula grânulo hippocampal ou cerebelar devido a alta concentração de corpos de células nessas áreas. Portanto, esta distribuição não homogênea de estruturas, neste caso as sinapses, pode levar a uma falsa estimativa da distribuição da proteína de interesse em si. Além disso, há uma variabilidade intrínseca as intensidades de coloração através de amostras em colorações imuno-histoquímica. O protocolo descrito aqui leva isso em consideração e evita tais preconceitos, bem como outras limitações que surgem a partir de métodos de imuno-histoquímica.

Em nosso recente estudo, nós usamos este método para descrever a expressão diferencial de motor (também chamado de TPRGL²³ ou SVAP30²⁴) através de de áreas cerebrais diferentes 16¹. Motor é uma proteína sináptica vertebrado-específicos que pode ser encontrada em associação com vesículas sinápticas e influencia a liberação de neurotransmissor^25,26,27. Podemos ter relacionado a expressão de Mover para a abundância das vesículas sinápticas, manchando para Sinaptofisina como um marcador de referência de vesícula sináptica. Encontramos altos níveis de motor particularmente em núcleos septais, o pallidum ventral e a amígdala. Dentro do hipocampo, encontramos uma distribuição heterogênea de motor, com altos níveis nas camadas associadas a computação intra-hipocampo e níveis baixos em camadas de entrada e saída.

Protocolo

Este protocolo não envolve experimentos em animais vivos. Experimentos envolvendo a eutanásia de animais para obter amostras de cérebro foram aprovados pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob o número de aprovação T 10/30.

Nota: Para este protocolo, foram utilizados 3 camundongos C57BL/6 adultos do sexo masculino.

1. preparação da amostra

1. Prepare o fixador e tampão de fosfato 0,1 M (PB; ver tabela 1).
2. Corrigir o animal por perfusão transcardial, conforme descrito em Gage et al ²⁸. primeiro lavar o sangue com 0,9% NaCl-solução, então perfundir com 30 mL de paraformaldeído 4% (PFA).
3. Abrir o crânio com uma tesoura e isolar com cuidado usando uma colher com bordas sem corte, para não danificar o tecido do cérebro.
4. Encher um tubo de reação de 50 mL com fixador e o cérebro em 4% o postfix PFA a 4 ° C durante a noite.
5. Retire o fixador e lavar o cérebro em 50 mL de 0.1 M PB num agitador por 30 min.
6. Após a lavagem, incube o cérebro em um tubo de reação de 50 mL em 30% de sacarose em PB de 0,1 M por 48 h ou até afunda no tubo a 4 ° C para cryoprotection.
7. Apare o cérebro cryoprotected com uma lâmina afiada, colocá-lo em um cryomold e incorporá-lo com temperatura de corte ideal (OCT) composta. Evite bolhas. Orientar o cérebro e congelar o cryomold no freezer-80 ° C.
8. Monte o tecido congelado para corte. Equilibrar o tecido para a temperatura de cryomicrotome durante pelo menos 15 minutos antes de cortar.
9. Seção do cérebro em 25 µm coronal de espessura. Toque a OCT cuidadosamente com um gancho de vidro sem tocar no tecido cerebral. Coletar 3 fatias adjacentes por bem em um prato bem 24 e armazená-los em PB de 0,1 M a 4 ° C até a coloração.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por até duas semanas. Tempos de armazenamento mais podem interferir na qualidade do tecido e assim influenciar o resultado do experimento.

2. imunofluorescência

1. Prepare soluções, incluindo o tampão de bloqueio, amortecedor de anticorpo, lavagem buffer 1 e o tampão de lavagem 2 (ver tabela 1).
2. Lave as fatias uma vez com PB para remover o excesso OCT.
   1. Remova a solução com uma pipeta plástica sem chupar em fatias do cérebro. Adicione 250 µ l de PB fresco com pipeta 1000 µ l.
      Atenção: As fatias não devem secar, então remova e adicione fluidos bem pelo bem.
3. Remover o PB com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l de tampão de bloqueio por alvéolo com uma pipeta de 1000 µ l. Incube durante 3 h à temperatura ambiente (RT) no agitador.
4. Durante o tempo de incubação, dilua os anticorpos primários em buffer de anticorpo em um tubo de reação. Usar o buffer de anticorpo 250 µ l por bem e adicionar a quantidade apropriada de anticorpo (ver quadro 2) pipetando-lo diretamente para a solução com uma pipeta 2 µ l. Misture a solução suavemente pipetando subindo e descendo várias vezes. Vórtice logo depois para garantir a mistura adequada.
   Nota: Para determinar a fluorescência de fundo, colorações também devem ser realizadas sem adicionar o anticorpo primário. Por isso, incube a fatia na solução de anticorpo sem anticorpos primários de acordo com o protocolo.
5. Após o tempo de incubação, remova o tampão de bloqueio com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l de solução de anticorpos contendo anticorpos primários por bem. Incube as fatias com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, um agitador.
6. No dia seguinte, lave as fatias com lavagem tampão 1 3 x por 10 min a RT em uma coqueteleira.
   1. Remover o meio de uma pipeta de plástico e adicione 300 µ l de tampão 1 de lavagem por bem. Incube a RT por 10 min. repetir 3 vezes.
7. Durante as etapas de lavagem, dilua os anticorpos secundários fluoróforo acoplados em buffer de anticorpo em um tubo de reação. Usar o buffer de anticorpo 250 µ l por bem e adicionar a quantidade apropriada de anticorpo (ver quadro 2) pipetando-lo diretamente para a solução com uma pipeta 2 µ l. Misture a solução suavemente pipetando subindo e descendo várias vezes. Vórtice logo depois para garantir a mistura adequada.
   Cuidado: Porque os anticorpos são sensíveis à luz, todos os passos a partir de agora precisam ser executada no escuro.
8. Após as etapas de lavagem, remover a lavagem com uma pipeta plástica de buffer e adicionar 250 µ l de solução de anticorpos contendo anticorpos secundários por bem. Incube as fatias com anticorpo secundário para 90 min no RT no escuro.
9. Lave as fatias com lavagem tampão 2 3 x por 10 min a RT
10. Durante as etapas de lavagem, dilua ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em 0,1 M PB em uma concentração de 1: 2000.
11. Retire o tampão de lavagem 2 com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l da solução DAPI por bem. Incube durante 5 min à RT no agitador.
12. Remover a solução DAPI com uma pipeta plástica e adicione 500 µ l de PB de 0,1 M por poço com uma pipeta de 1000 µ l.
13. Monte as fatias em corrediças do microscópio.
    1. Coloque uma lâmina de microscópio sob o estereoscópio. Com um pincel fino, adicione três gotas separadas de 0,1 M PB para o slide. Coloque uma fatia por cair sobre a lâmina de microscópio.
    2. Use o pincel fino para achatar e orientar as fatias do slide de microscópio.
    3. Quando todas as fatias são posicionadas corretamente, remova PB em excesso com um lenço de papel e seque cuidadosamente o slide.
       Atenção: Evite secar as fatias de cérebro completamente.
    4. Adicione 80 µ l de incorporação médio para o slide. Desça cuidadosamente a lamela para o slide, assim, incorporando as fatias do cérebro.
    5. Deixe os slides para secar a coifa para 1-2 h (cobri-los para evitar a exposição à luz) e armazená-los em uma caixa de slide de microscópio a 4 ° C.
       Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. imagem latente

1. Depois que o meio de encastre é completamente endurecido, coloque a lâmina de microscópio sob o microscópio confocal.
   Nota: A microscopia de epifluorescência, combinada com o software de deconvolução deve produzir qualidade de imagem similar.
2. Ajuste os parâmetros do laser aumentando ou diminuindo a intensidade do laser para cada canal, para que alguns pixels são superexpostas para garantir o máximo da distribuição dos valores de cinza.
3. Adquira tecidos virtuais da fatia inteira do cérebro para os diferentes canais.
   1. No software da imagem latente (ver Tabela de materiais), selecione a opção de telhas e manualmente delinear a fatia do cérebro com a Configuração de região da telha.
   2. Distribuir pontos de apoio em toda a região de telha e ajustar o foco para os pontos de apoio diferentes pressionando Verificar telha regiões/posições...
   3. Ajustar as configurações no Modo de aquisição de acordo com o tamanho desejado do arquivo e resolução da imagem resultante e iniciar a varredura.
4. Quando a digitalização estiver concluída, use a função de costura para processar o tecido virtual. Exporte o arquivo como um. tif, com a função de Exportação de imagem.

4. baseada em computador

1. Carregar todos os canais único para uma imagem em FIJI²⁹ clicando arquivo | Aberto.
2. Com a ferramenta de seleção à mão livre , delinear um hemisfério no DAPI-canal. Crie uma máscara da seleção clicando Editar | Seleção | Criar máscara de.
3. Determinar a intensidade de fluorescência média para os canais único (Mover e Sinaptofisina) clicando Analyze | Medida.
   Nota: Certifique-se de selecionar os canais diferentes para determinar os valores de intensidade de fluorescência média para cada canal.
4. Copie a intensidade média de fluorescência para os canais único em uma planilha.
5. Determine a intensidade de fluorescência média para os canais única em uma área de interesse, delineando a área também com a ferramenta de seleção à mão livre . Use um atlas de cérebro de rato como referência.
6. Repita as etapas 4.1-4.5 para todos os hemisférios e todas as áreas de interesse.
   Nota: Determinar os valores para cada hemisfério, separadamente, para depois comparar os valores em uma área de interesse para que no hemisfério (ver passo 5.2).

5. manipulação de dados

1. No caso da fluorescência de fundo é elevada (ver discussão), pode ser necessária uma subtração de fundo. Por isso, determinar a intensidade média de fluorescência para a fatia processada sem anticorpo primário contra a proteína de referência (aqui: Sinaptofisina) e subtraia o valor de todos os valores obtidos para as regiões cerebrais e hemisférios.
2. Quando as intensidades de fluorescência média para os canais único para cada hemisfério e todas as áreas de interesse foram determinadas (ver quadro 3), calcular a relação de motor para Sinaptofisina, dividindo o valor para Mover pelo valor para Sinaptofisina ( amarelo na tabela 3). Execute esta ação para cada área de interesse e cada hemisfério separadamente.
3. Divida a relação obtida para uma área de interesse, pelo quociente obtido para o hemisfério correspondente (laranja na tabela 3) para determinar a relação entre a área de interesse para o hemisfério.
4. Para determinar a abundância relativa de Mover, traduza o rácio Obtido em 5.2, em percentagem, determinando seu desvio de 1 (vermelho na tabela 3). Uma relação de 1,25, portanto, daria uma abundância relativa de Mover de 25% acima da média, e uma proporção de 0,75 renderia uma abundância relativa de Mover de 25% abaixo da média.

Resultados

Representante, manchando os padrões dos diferentes marcadores pode ser visto na Figura 1. O padrão varia de acordo com a distribuição da proteína. Exemplos de cinco níveis de rostro-caudal são mostrados nas colunas (A)-(E). Uma coloração de DAPI representativa é mostrada na primeira linha: DAPI adere ao DNA de uma célula e, portanto, os núcleos estão manchados. Isso resulta em um padrão punctate. Regiões com um...

Discussão

O método aqui apresentado tem como objetivo quantificar a distribuição de uma proteína de interesse em relação à abundância de uma proteína do marcador, com uma distribuição conhecida. Mancha da imunofluorescência pode mostrar uma grande variabilidade de coloração intensidades entre diferentes fatias. A abordagem de quantificação descrita aqui contorna este problema, determinando a proporção da proteína de interesse para a média em todo o hemisfério. Portanto, diferentes intensidades de coloração e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft