JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Zusammenfassung

Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Ebenen der spezifischen synaptischen Proteine können synaptische Übertragung stark beeinflussen. Neben der Erläuterung der Funktion eines Proteins, ist es wichtig, auch die Verteilung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Computer-basierte Analyse zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein Mover (auch TPRGL oder SVAP30 genannt). Wir vergleichen die Verteilung der Mover mit derjenigen der synaptischen Vesikel Protein Synaptophysin, wodurch Bestimmung der Verteilung der Mover in einer quantitativen Weise im Verhältnis zu der Fülle der synaptischen Vesikel. Insbesondere könnte möglicherweise diese Methode implementiert werden, um Vergleich der Verteilung von Proteinen mit verschiedenen Antikörpern oder Mikroskope oder über verschiedene Studien zu ermöglichen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität der immunofluorescent Verfärbungen durch nachgeben ein Verhältnis eher als absolute Fluoreszenz Ebenen. Darüber hinaus ermöglicht die Methode, die wir beschreiben die Forscher die Verteilung eines Proteins auf verschiedenen Ebenen zu analysieren: aus ganzen Gehirnscheiben in Gehirnregionen zu verschiedenen Teilregionen in einem Hirnareal, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus oder sensorische Cortex. Mover ist ein Wirbeltier-spezifische Protein, das synaptischen Vesikel zugeordnet ist. Mit dieser Methode zeigen wir, dass Mover Hirnareale mit hohem in der ventralen Troponema, septal Kerne und die Amygdala, und auch innerhalb einzelner Hirnareale, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus heterogen verteilt ist.

Einleitung

Kommunikation zwischen den Nervenzellen geschieht an speziellen Kontaktstellen, die Synapsen genannt. Synapsen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen, die synaptische Übertragung zu orchestrieren. Einige dieser Proteine zeigen eine heterogene Verteilung im gesamten Nervensystem und sind nicht in jeder Synapse-1. Ein Beispiel für solche ein Protein ist Munc13, die Grundierung der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Es gibt verschiedene Isoformen von Munc13, die das Gehirn2heterogen verteilt sind, und das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Isoformen beeinflussen kann kurzfristige synaptische Plastizität und synaptischen Vesikel Dynamik3, 4 , 5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Vorhandensein von verschiedenen synaptischen Proteine in Hirnregionen identifizieren zu können.

Die Methoden der Wahl für die Quantifizierung der synaptischen Proteine - bis jetzt - sind Massenspektrometrie und Western Blot, anstatt Immunohistochemistry6,7,8,9. In einigen Fällen sind verschiedene Methoden zur Bewertung der Menge und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen (d.h., Wilhelm Et Al. ergänzen 10). die Methode wir hier beschreiben ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung von Proteinen ohne die Notwendigkeit der Verwendung biochemische Methode, einfach nur immunofluorescent Färbungen. Ein weiterer Vorteil hier ist, dass die Quantifizierung, über Flächen, die viel kleiner möglich ist und daher genauer als die durch andere Methoden erreicht. Man muss jedoch berücksichtigen, dass eine verlässliche Referenz-Protein benötigt wird, um die Verteilung des Proteins des Interesses zu beurteilen.

Fluoreszierende Färbung von Immunohistochemistry ermöglicht es uns, die routinemäßig die Lokalisierung der Proteine über Hirnareale sowie in verschiedenen neuronalen Kompartimenten identifizieren. Um die verschiedenen Fächer zu identifizieren, werden spezifische Marker verwendet. Antikörper gegen Wirbeltiere und Synaptophysin11 ist in der Regel lässt sich die synaptischen Vesikel zu kennzeichnen, während Antikörper gegen Fagott die aktive Zone einer präsynaptischen terminal12beschriften. Vesikuläre Transporter, z. B. die vesikuläre Glutamat-Transporter (vGluT) oder vesikuläre GABA-Transporter (vGAT), werden verwendet, um exzitatorischen13 und hemmenden14 präsynaptischen Klemmen bzw. beschriften. Auf der postsynaptischen Seite können Antikörper gegen das Protein Homer eingesetzt werden anlässlich der postsynaptischen Terminals und Antikörper gegen postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD95)15,16,17 oder Gephyrin18 , 19 , 20 können erregenden oder hemmenden postsynaptischen Terminals bzw. beschriften. Mithilfe von Antikörpern gegen ein Protein des Interesses und Markierungen wie oben beschrieben, kann man feststellen, die Lokalisierung von solchen Protein. Viele Studien bisher haben dies in einer qualitativen Weise21durchgeführt. Jedoch muss um die differenzierte Verteilung der ein bestimmtes synaptischen Protein zuverlässig zu bestimmen, nicht nur seine Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch die relative Konzentration festgestellt werden. Die Heterogenität der Größe und Dichte der Synapsen ist es wichtig, ein Verhältnis zwischen dem synaptischen Marker und das Protein des Interesses zu etablieren. Andernfalls werden Synapse-reiche Regionen wie die nicht-pyramidale Schichten des Hippocampus und der molekularen Schicht des Kleinhirns zeigen eine hohe Dichte an synaptischen Proteine, nur aufgrund der höheren Dichte der Synapsen aber nicht aufgrund einer starken Präsenz von diesem Protein in Jede Synapse (z.B. Wallrafen und Dresbach1). Auf der anderen Seite zeigen Proteine in die neuronale Soma (z.B., TGN3822) in der Regel starken Präsenz im Hippokampus pyramidale Zellschicht oder hippocampal oder zerebelläre Granulat Zellschicht aufgrund der hohen Konzentration von neuronalen Zellkörpern in diesen Bereichen. Daher diese nicht-homogene Verteilung der Strukturen, in diesem Fall Synapsen, kann auf eine falsche Einschätzung der Verteilung des Proteins des Interesses selbst führen. Darüber hinaus gibt es eine intrinsische Veränderlichkeit in der Färbung Intensitäten über Proben in immunhistochemischen Färbungen. Das hier beschriebene Protokoll berücksichtigt dies und vermeidet solche Vorurteile, wie auch andere Einschränkungen, die durch immunhistochemischen Methoden entstehen.

In unserer letzten studieren, haben wir diese Methode um zu beschreiben, die differentielle Expression der Mover (auch genannt TPRGL23 SVAP3024) über 16 verschiedene Gehirn Bereiche1verwendet. Mover ist ein Wirbeltier-spezifischen synaptischen Protein, finden Sie im Verein zu synaptischen Vesikel und beeinflusst die Neurotransmitter-Freisetzung25,26,27. Wir haben den Mover-Ausdruck auf die Fülle der synaptischen Vesikel verwandt, durch Färbung für Synaptophysin als synaptischen Vesikel Referenz Marker. Hohes Maß an Mover fanden wir vor allem in der septal Kerne, die ventrale Troponema und der Amygdala. Im Hippocampus fanden wir eine heterogene Verteilung der Mover, mit einem hohen in den Schichten Intra-hippocampal Berechnung und niedrigen Niveau in Eingang und Ausgang Schichten zugeordnet.

Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet keine Experimente an lebenden Tieren. Experimente mit von Tieren Gehirn Proben erhalten euthanizing stimmten mit den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zulassungsnummer T 10/30.

Hinweis: Für dieses Protokoll wurden 3 Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen verwendet.

1. die Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie Fixiermittel und 0,1 M Phosphatpuffer (PB; siehe Tabelle 1).
  2. Befestigen Sie das Tier durch Transcardial Perfusion, wie Gage Et Al. beschrieben 28. Waschen Sie zuerst das Blut mit 0,9 % NaCl-Lösung, dann mit 30 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) durchspülen.
  3. Den Schädel mit einer Schere öffnen und das Gehirn mit einem Löffel mit stumpfen Kanten zu beschädigen das Gewebe vorsichtig zu isolieren.
  4. Füllen Sie eine 50 mL Reaktionsgefäß mit Fixativ und postfix das Gehirn bei 4 % PFA bei 4 ° C über Nacht.
  5. Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie das Gehirn in 50 mL 0,1 M PB auf einem Boston-Shaker für 30 min.
  6. Nach dem Waschen inkubieren Sie das Gehirn in ein 50 mL Reaktionsgefäß in 30 % Saccharose in 0,1 M PB für 48 h oder bis es in der Röhre bei 4 ° C für Cryoprotection sinkt.
  7. Das Cryoprotected Gehirn mit einer scharfen Klinge trimmen, legen Sie sie in ein Cryomold und Binde sie mit optimalen Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung. Vermeiden Sie Luftblasen. Richten Sie das Gehirn und frieren Sie die Cryomold in den-80 ° C Gefrierschrank ein.
  8. Montieren Sie das gefrorene Gewebe für schneiden. Equilibrate das Gewebe auf die Cryomicrotome Temperatur für mindestens 15 Minuten vor dem Schneiden.
  9. Abschnitt des Gehirns in 25 µm Dicke koronalen Scheiben. Berühren Sie das Office-Anpassungstool sorgfältig mit einem Glas Haken ohne das Hirngewebe zu berühren. 3 angrenzende Scheiben pro Bohrloch in einer 24-well-Platte zu sammeln und aufbewahren in 0,1 M PB bei 4 ° C bis Färbung.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu zwei Wochen lang angehalten werden. Längere Lagerzeiten können die Gewebe-Qualität beeinträchtigen und somit Einfluss auf den Ausgang des Experiments.

(2) Immunfluoreszenz

  1. Bereiten Sie Lösungen einschließlich der blockierenden Puffer, Antikörper Puffer, Wasch-Puffer 1 und waschen Puffer 2 (siehe Tabelle 1).
  2. Spülen Sie Scheiben einmal mit PB, überschüssige OCT zu entfernen.
    1. Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff, ohne in den Gehirnscheiben saugen. Fügen Sie 250 µL frische PB mit einer 1000 µL Pipette.
      Achtung: Scheiben sollte nicht austrocknen, also entfernen und Hinzufügen von Flüssigkeiten gut durch Brunnen.
  3. Entfernen Sie den PB mit einer Kunststoff-Pipette und 250 µL blocking-Puffer pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette. 3 h bei Raumtemperatur (RT) auf den Shaker inkubieren.
  4. Während der Inkubationszeit verdünnen Sie die primären Antikörper Antikörper Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten.
    Hinweis: Um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, sollten Verfärbungen auch durchgeführt werden ohne Zugabe von den primären Antikörper. Dafür inkubieren Sie die Scheibe in Antikörperlösung ohne primäre Antikörper nach dem Protokoll.
  5. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit den blockierenden Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit primären Antikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie Scheiben mit primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C in einen Shaker geben.
  6. Am nächsten Tag waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 1 3 X für 10 min bei RT in einen Shaker geben.
    1. Entfernen Sie das Medium mit einer Kunststoff-Pipette und fügen Sie 300 µL Waschpuffer 1 pro Bohrloch. 10 min. Wiederholen Sie 3-Mal bei RT inkubieren.
  7. Während die Waschschritte Verdünnen der Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörper in Antikörper-Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten.
    Achtung: Da die Antikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte von diesem Zeitpunkt an im Dunkeln durchgeführt werden.
  8. Nach der Waschschritte, entfernen Sie das Waschen Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit Sekundärantikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörper für 90 min bei RT in der Dunkelheit.
  9. Waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 2 3 X für 10 min bei RT
  10. Während die Waschschritte verdünnen Sie 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in einer Konzentration von 1: 2000.
  11. Entfernen Sie waschen-Puffer 2 mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL DAPI-Lösung pro Bohrloch. 5 min bei RT auf den Shaker inkubieren.
  12. Entfernen Sie die DAPI-Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 500 µL 0.1 M PB pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette.
  13. Montieren Sie Scheiben auf Objektträger.
    1. Legen Sie einen Objektträger unter das Stereoskop. Tropfen Sie mit einem feinen Pinsel drei separate 0,1 M PB auf der Folie. Legen Sie eine Scheibe pro Tropfen auf dem Objektträger.
    2. Verwenden Sie die feinen Pinsel zu glätten und die Scheiben auf den Objektträger zu orientieren.
    3. Wenn alle Scheiben richtig positioniert sind, überschüssige PB mit einem Tuch entfernen und die Folie vorsichtig abtrocknen.
      Achtung: Vermeiden Sie die Gehirnscheiben vollständig trocknen.
    4. Fügen Sie 80 µL Medium auf der Folie einbetten. Setzen Sie vorsichtig das Deckglas auf der Folie, dadurch die Gehirnscheiben einbetten.
    5. Die Folien in der Dunstabzugshaube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

(3) Bildgebung

  1. Nachdem das einbettende Medium vollständig ausgehärtet ist, legen Sie Objektträger unter confocal Mikroskop.
    Hinweis: Epifluoreszenz Mikroskopie in Kombination mit Dekonvolution Software sollten ähnliche Bildqualität liefern.
  2. Einstellungen Sie die Laser-durch erhöhen oder verringern die Laserstärke für jeden Kanal, so dass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten.
  3. Virtuelle Gewebe des gesamten Gehirns Slice für die verschiedenen Kanäle zu erwerben.
    1. In der imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie die Fliesen und die Gehirn-Scheibe mit der Fliese Region Setupmanuell abzugrenzen.
    2. Verteilen Sie Stützpunkte in der gesamten Region Fliese und stellen Sie den Fokus für die verschiedenen Stützpunkte durch drücken Bestätigen Fliese Regionen/Positionen...
    3. Passen Sie die Einstellungen im Akquisitionsmodus entsprechend die gewünschte Auflösung und Größe des resultierenden Bildes und starten Sie den Scanvorgang.
  4. Wenn der Scan abgeschlossen ist, verwenden Sie die Stitching -Funktion um das virtuelle Gewebe verarbeiten. Exportieren Sie die Datei als TIF mit der Funktion Bild exportieren.

(4) Computer-basierte Analyse

  1. Laden Sie alle einzelne Kanäle für ein Bild in Fidschi29 , indem Datei | Offene.
  2. Beschreiben Sie mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug eine Hemisphäre im DAPI-Kanal. Erstellen Sie eine Maske der Auswahl durch Klicken auf Bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen.
  3. Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle (Mover und Synaptophysin) indem Sie auf analysieren | Maßnahme.
    Hinweis: Sollten Sie die verschiedenen Kanäle zur Bestimmung der mittleren Fluoreszenz Intensitätswerte für jeden Kanal auswählen.
  4. Kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in ein Arbeitsblatt.
  5. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle auf einer Fläche von Interesse durch Abgrenzung der Gegend auch mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug. Verwenden Sie einen Maus-Gehirn-Atlas als Referenz.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 für alle Hemisphären und alle Bereiche von Interesse.
    Hinweis: Bestimmen die Werte für jede Hemisphäre separat, um später die Werte in einem Bereich von Interesse, dass in der Hemisphäre vergleichen (siehe Punkt 5.2).

5. Datenverarbeitung

  1. Für den Fall, dass die Hintergrundfluoreszenz hoch ist (siehe Diskussion), ein Hintergrundabzug kann erforderlich sein. Für das Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für den Slice verarbeitet ohne primären Antikörper gegen des Referenzproteins (hier: Synaptophysin) und subtrahieren Sie diesen Wert aus allen Werten für die Gehirnregionen und Hemisphären.
  2. Wenn die mittlere Fluoreszenz-Intensitäten für die einzelnen Kanäle für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet bestimmt wurden (siehe Tabelle 3), das Verhältnis von Mover zu Synaptophysin durch Dividieren den Wert für Mover durch den Wert für Synaptophysin (berechnen gelb in Tabelle 3). Führen Sie diese Aktion für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet getrennt.
  3. Teilen Sie das Verhältnis für ein Interessengebiet erhalten durch das Verhältnis für die entsprechenden Hemisphäre (Orange in Tabelle 3) erreicht wird, um das Verhältnis des Bereichs des Interesses an der Hemisphäre zu bestimmen.
  4. Um festzustellen, die relative Häufigkeit der Mover, übersetzen Sie das Verhältnis erwarb 5.2 in einen Prozentsatz durch die Bestimmung der Abweichung von 1 (rot in Tabelle 3). Ein Verhältnis von 1,25 würde daher eine relative Mover Fülle von 25 % über dem Durchschnitt, und ein Verhältnis von 0,75 würde ergeben eine relative Mover Fülle von 25 % unter dem Durchschnitt.

Ergebnisse

Vertreter, die Muster der verschiedenen Markern Färbung ist in Abbildung 1ersichtlich. Das Muster ist abhängig von der Verteilung des Proteins. Beispiele für fünf Rostro-caudale Ebenen sind in Spalten (A)-(E). Eine repräsentative DAPI-Färbung zeigt sich in der ersten Reihe: DAPI hält sich an die DNA einer Zelle und somit Kerne gefärbt sind. Daraus resultiert eine punktförmige Muster. Regionen mit einer hohen Zelldich...

Diskussion

Hier präsentiert die Methode zielt darauf ab die Verteilung eines Proteins des Interesses im Verhältnis zu der Fülle von einem Marker Protein mit einer bekannten Verteilung zu quantifizieren. Immunfluoreszenz-Färbung zeigen eine hohe Variabilität der Färbung Intensitäten zwischen verschiedenen Scheiben. Die Quantifizierung der hier beschriebene Ansatz umgeht dieses Problem durch das Verhältnis des Proteins des Interesses an den Durchschnitt in der Hemisphäre zu bestimmen. Daher verschiedenen befleckenden Intensi...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Irmgard Weiss für ausgezeichnete technische Unterstützung. Die Autoren erkennen Unterstützung durch Hermes Pofantis und Andoniya Petkova. Die Autoren danken auch das European Neuroscience Institute für die Nutzung der LSM800 und technische Hilfe, vor allem von Dr. Nils Halbsgut. Diese Arbeit wurde von der University Medical Center Göttingen finanziert. JSV erkennt Unterstützung durch die Mitte für Nanoscale Mikroskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL reaction tubesEppendorf30120094
50 mL reaction tubesGreiner Bio-One227261
multiwell 24 wellFisher Scientific                                                                                                087721H
plastic pipette (disposable)Sarstedt861,176
1000 mL pipetteRainin 17014382
2 ml pipetteEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel microscope slidesFisher Scientific                                                                                          10144633CF
StereoscopeLeica
LSM800ZeissConfocal microscope
freezing microtomeLeica
PBS (10X)Roche                                                                                       11666789001
PFASigma                                                                                            P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
sucroseneoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
normal goat serumMerck MilliporeS26-100ML
normal donkey serumMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
rabbit anti-MoverSynaptic SystemsRRID: AB_10804285
guinea pig anti-SynaptophysinSynaptic SystemsRRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                   475904
ZEN2 blue softwareZeissMicroscopy software
FIJIImageJAnalysis software
Microsoft ExcelMicrosoft

Referenzen

  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Ausgabe 143Immunfluoreszenzkonfokale MikroskopieQuantifizierungNeurowissenschaftensynaptischen ProteineMausMoverVertrieb

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten