면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

요약

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

초록

존재, 결핍, 또는 특정 시 냅 스 단백질의 수준을 심각 하 게 시 냅 스 전송을 좌우할 수 있다. Elucidating 단백질의 기능, 뿐만 아니라 또한 그것의 배급을 결정에 필수적입니다. 여기, 우리는 면역 형광 검사, confocal 현미경 검사 법, 및 시 냅 스 단백질 발동기 (TPRGL 또는 SVAP30 라고도 함)의 분포를 확인 하기 위해 컴퓨터 기반 분석 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 따라서 발동기의 분포 synaptic vesicles의 풍부에 상대적인 양적 방식 결정 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin의 발동기의 분포를 비교 합니다. 특히,이 방법은 잠재적으로 다른 연구를 통해 또는 다른 항 체 또는 현미경을 사용 하 여 단백질의 분포의 비교 있도록 구현 수 있습니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준 보다는 오히려 비율을 양보 하 여 immunofluorescent stainings의 고유의 가변성 circumvents. 또한, 우리가 설명 하는 방법 다른 수준에 단백질의 분포를 분석 하는 연구원을 가능: 전체 뇌 조각 한 두뇌 지역, 다른 레이어는 해 마의 또는 감각에서 오는 다른 아구에 뇌 영역에서 외피가입니다. 움직이는 시 냅 스 소포와 연결 되는 척추 관련 단백질 이다. 이 방법으로 우리는 발동기입니다 heterogeneously 뇌 영역, 상부 복 부 마, septal 핵에는 편도 해 마의 다른 레이어 같은 단일 뇌 영역 내에서 분산을 보여줍니다.

서문

뉴런 간의 통신 시 냅 스 라는 전문된 연락처 사이트에서 발생 합니다. 시 냅 스 통합 하는 시 냅 스 전송 하는 다른 단백질의 무수를 포함 합니다. 그 단백질의 일부는 신경 시스템을 통해 다른 유형의 분포를 표시 하 고 모든 시 냅 스¹에 존재 하지 않습니다. 이러한 단백질에 대 한 한 예로 시 냅 스 소포 프라이 밍 과정에 포함 되는 Munc13 이다. heterogeneously 뇌²전체 분포, Munc13의 다른 isoforms 그리고 존재 또는 부재 특정 isoforms의 영향을 미칠 수 단기 시 냅 스가 소성 및 시 냅 스 소포 역학^{3, 4 , 5}. 따라서 뇌 분야에 걸쳐 다른 시 냅 스 단백질의 존재를 식별할 수에 중요 한 중요성의 이다.

-지금까지-시 냅 스 단백질의 정량화에 대 한 선택의 메서드는 질량 분석 및 서 부 럽, 보다는 오히려 immunohistochemistry^6,7,,89. 경우에 따라 여러 가지 방법은 모두 수량과 특정 단백질 (즉, 빌헬름 외 의 지역화를 평가 하기 위해 서로 보완 하 되 ¹⁰). 여기 설명 하는 방법 지역화 하 고 정량화 없이 단순히 채용 immunofluorescent stainings 어떤 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질의 수 있습니다. 또 다른 장점은 여기은 훨씬 작은 지역에는 정량화를 할 수 있습니다, 따라서, 그 보다 더 구체적인 다른 방법으로 달성. 그러나, 하나의 신뢰할 수 있는 레퍼런스 단백질 관심사의 단백질의 분포를 평가 하는 데 필요한은 고려 하고있다.

Immunohistochemistry 여 형광 얼룩 다른 신경 구획 내에서 뿐만 아니라 뇌 영역에 걸쳐 정기적으로 단백질의 지역화를 식별할 수 있습니다. 다른 구획을 식별 하기 위해 특정 마커 사용 됩니다. 일반적으로, synapsin 및 synaptophysin¹¹ 에 대하여 항 체 바 순에 대 한 항 체는 연 접 터미널¹²의 활성 영역 레이블을 동안 시 냅 스 소포 라벨을 사용할 수 있습니다. 기공을 전송기, 기공을 조미료 전송기 (vGluT) 또는 기공을 GABA 운송업 자 (vGAT), 같은 라벨을 흥분 성의¹³ 및 금지¹⁴ 연 접 맨끝 각각 사용 됩니다. Postsynaptic 측면에서 호머 단백질에 대 한 항 체 postsynaptic 터미널과 postsynaptic 밀도 단백질 95 (PSD95)^15,,1617 또는 gephyrin¹⁸ 에 대 한 항 체를 채택 될 수 있다 ^{, 19 , 20} 흥분 성의 또는 금지 postsynaptic 단말기를 각각 레이블을 수 있습니다. 관심 및 위에서 설명한 것과 같은 표시자의 단백질에 대하여 항 체를 사용 하 여 하나 이러한 단백질의 지 방화를 결정할 수 있습니다. 날짜에 많은 연구 질적 방법²¹에이 일을. 그러나, 특정 시 냅 스 단백질의 차등 분배를 안정적으로 결정 하려면 하나 결정 해야 합니다 하지만 그것의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 그것의 상대 농도. 시 냅 스의 밀도 크기의이 시 냅 스 마커 및 관심사의 단백질 간의 비율을 설정 하는 것이 중요 합니다. 그렇지 않으면, 해 마의 비 피라미드 층 및 소 뇌의 분자 층 등 냅 풍부한 지역 시 냅 스 단백질, 시 냅 스의 높은 밀도 인해만 하지만 그 단백질의 강한 존재 때문에의 높은 밀도 표시 됩니다. (예를 들어, Wallrafen 및 Dresbach¹) 각 시 냅 스. 신경 소마 (예를 들어, TGN38²²)에 단백질이 hippocampal 피라미드 셀 레이어 또는 hippocampal 또는 소 뇌과 립 세포 층 신경 셀 시체의 높은 농도 때문에 강한 존재를 보여줄 것 이다 일반적으로 다른 한편으로, 에 그 지역. 따라서,이 비 균질 유통 구조,이 경우 synapses, 자체는 관심사의 단백질의 분포의 잘못 된 추정으로 이어질 수 있습니다. 또한, 샘플 immunohistochemical stainings에 걸쳐 휘도 얼룩에 본질적인 변화가입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 고려이 고 immunohistochemical 방법에서 발생 하는 다른 주의 사항으로 그런 편견을 피 한다.

우리 16 서로 다른 뇌 영역¹에 걸쳐 발동기 (TPRGL²³ 또는 SVAP30²⁴라고도 함)의 차동 식을 설명 하기 위해이 메서드를 사용 해야, 우리의 최근 연구. 움직이는 척추 관련 시 냅 스 단백질 시 냅 스 소포에 협회에서 찾을 수 있습니다 및 영향 신경 전달 물질 방출^25,,2627이다. 우리 시 냅 스 소포 참조 표식으로 synaptophysin에 대 한 얼룩에 의해 시 냅 스 소포의 풍요에 발동기 식을 관련 있다. 우리는 특히 septal 핵, 복 부 마와 편도 체에 발동기의 높은 수준을 발견. 해 마, 내 우리 레이어 내부 hippocampal 계산와 입력 및 출력 계층의 낮은 수준에서에서 높은 수준으로 발동기의 다른 유형의 분포를 발견.

프로토콜

이 프로토콜은 실험 동물에 포함 되지 않습니다. 뇌 샘플을 얻기 위해 동물의 euthanizing 관련 실험 승인 번호 T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다.

참고:이 프로토콜에 대 한 3 성인 남성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.

1. 샘플 준비

1. 정착 액 및 0.1 M 인산 버퍼 (PB; 표 1참조)를 준비 합니다.
2. 게이지 외 에 설명 된 대로 transcardial 관류 하 여 동물을 해결 ²⁸. 먼저 0.9로 혈액을 씻어 %NaCl 해결책, 다음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 30 mL와 함께 perfuse.
3. 가 위 두개골을 열고 뇌 조직 손상을 방지 하려면 무딘 가장자리와 숟가락을 사용 하 여 조심 스럽게 분리 합니다.
4. 정착 액 50 mL 반응 관 작성 및 4%에서 뇌를 후 위 PFA 하룻밤에 4 ° C에서.
5. 정착 액을 제거 하 고 30 분 통에 0.1 m M PB의 50 mL에 뇌 세척.
6. 세척, 후 48 h 또는 cryoprotection 4 ° C에서 튜브에 싱크까지 0.1 m M 샌드위치에 30% 자당에서 50 mL 반응 관에 뇌를 품 어.
7. 날카로운 블레이드와 cryoprotected 뇌를 손질 하 고는 cryomold에 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물 포함. 거품을 하지 마십시오. 두뇌를 동양 및 cryomold-80 ° C 냉장고에서 동결.
8. 단면에 대 한 냉동된 조직을 탑재 합니다. 구분 하기 전에 적어도 15 분 동안 cryomicrotome 온도 조직 equilibrate.
9. 25 µ m 두께 코로나 조각으로 두뇌를 섹션. 뇌 조직을 건드리지 않고 신중 하 게 유리 걸이로 10 월을 터치 합니다. 24 잘 접시에 잘 당 3 인접 한 조각을 수집 하 고 얼룩까지 4 ° C에서 0.1 M PB에 저장.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기까지 2 주 동안. 긴 저장 시간 조직 품질을 방해 하 고 따라서 실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

2입니다. 면역 형광 검사

1. 블로킹 버퍼, 항 체 버퍼, 세척 버퍼 1, 및 세척 버퍼 2 ( 표 1참조)를 포함 한 솔루션을 준비 합니다.
2. 초과 10 월을 제거 하는 PB와 한 번 분할 영역을 씻어.
   1. 두뇌 조각에서 빠는 없이 플라스틱 피 펫과 솔루션을 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫과 신선한 PB의 250 µ L를 추가 합니다.
      주의: 분할 영역 해야 하지 밖으로 건조, 그래서 제거 하 고 체액 잘에 의해 잘 추가.
3. 플라스틱 피 펫으로 PB를 제거 하 고 250 µ L 당 1000 µ L 피 펫 잘 차단 버퍼의 추가. 셰이 커에 실 온 (RT)에서 3 h에 대 한 품 어.
4. 인큐베이션 기간 동안, 항 체 반응 튜브에 버퍼에서 기본 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
   참고: 배경 형광을 확인 하려면 stainings 또한 수행 되어야 한다 1 차 항 체를 추가 하지 않고. 그에 대 한 항 체는 프로토콜에 따라 기본 항 체 없이 솔루션에서 슬라이스를 품 어.
5. 외피 시간 후 플라스틱 피 펫과 블로킹 버퍼를 제거 하 고 잘 당 1 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체로 분할 영역을 품 어.
6. 다음 날, 세척 버퍼 1 3 조각 씻어 통에 RT에서 10 분에 대 한 x.
   1. 플라스틱 피 펫과 매체를 제거 하 고 잘 당 버퍼 1 세척의 300 µ L를 추가 합니다. 10 분 반복 3 번 RT에서 품 어.
7. 세척 단계 동안 반응 관에서 항 체 버퍼에 fluorophore 결합 보조 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
   주의: 항 체는 빛에 민감한, 때문에이 시점에서 모든 단계 어둠 속에서 수행 해야 합니다.
8. 세척 단계, 세척 플라스틱 피 펫을 버퍼링 하 고 잘 당 2 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 제거 후. 어둠 속에서 RT에서 90 분에 대 한 2 차 항 체로 슬라이스를 품 어.
9. 버퍼 2 3의 세척 조각 씻어 실시간에서 10 분 x
10. 세척 단계 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M 샌드위치 1: 2000의 농도에서 희석.
11. 플라스틱 피 펫으로 세척 버퍼 2를 제거 하 고 잘 당 DAPI 솔루션의 250 µ L을 추가. 셰이 커에 RT에 5 분 동안 품 어.
12. 플라스틱 피 펫 DAPI 솔루션을 제거 하 고 1000 µ L 피 펫 잘 당 0.1 M PB의 500 µ L을 추가.
13. 현미경 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다.
    1. 장소는 stereoscope 아래 현미경 슬라이드입니다. 정밀한 브러시와 함께 슬라이드에 0.1 m M PB의 세 가지 별도 방울을 추가 합니다. 현미경 슬라이드에 드롭 당 하나의 슬라이스를 놓습니다.
    2. 좋은 브러시를 사용 하 여 평평 하 고 방향을 현미경 슬라이드에서 조각.
    3. 모든 분할 영역을 올바르게 배치 하는 경우 초과 PB 화장지로 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드를 건조.
       주의: 두뇌 분할 영역을 완전히 건조 하지 마십시오.
    4. 슬라이드에 매체를 포함 80 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 그로 인하여 뇌 조각 포함 슬라이드에 coverslip 낮은.
    5. 1-2 h에 대 한 증기 두건에서 건조 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관
       참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 영상

1. 포함 매체 완전히 경화 된 후, confocal 현미경 현미경 슬라이드를 놓습니다.
   참고: Epifluorescence 현미경 deconvolution 소프트웨어와 함께 비슷한 이미지 품질을 양보 한다.
2. 증가 또는 감소 하는 모든 채널에 대 한 레이저 강도 몇 픽셀 회색 값의 최대 배포 되도록 과도 노출 레이저 설정을 조정 합니다.
3. 다른 채널에 대 한 전체 뇌 조각의 가상 조직 취득.
   1. 이미징 소프트웨어에서 ( 재료의 표참조), 타일 옵션을 선택 하 고 수동으로 타일 지역 설치뇌 조각 윤곽을 그리 다.
   2. 지원 포인트 타일 지역에 걸쳐 배포 하 고 확인 타일 지역/위치... 를 눌러 다른 지원 포인트에 대 한 초점을 조정
   3. 결과 이미지의 원하는 해상도 파일 크기에 따라 획득 모드 에서 설정을 조정 하 고 스캔을 시작.
4. 검사가 완료 되 면 가상 조직 처리를 바느질 함수를 사용 합니다. .Tif 이미지 내보내기기능으로 파일을 내보냅니다.

4. 컴퓨터 기반 분석

1. 파일을 클릭 하 여 피지²⁹ 으로 하나의 이미지에 대 한 모든 단일 채널 로드 | 오픈.
2. 자유형 선택 도구와 함께 한 반구를 DAPI 채널에 나타냅니다. 편집을 클릭 하 여 선택의 마스크를 만들기 | 선택 | 마스크 레이어 만들기.
3. 분석을 클릭 하 여 단일 채널 (발동기 및 synaptophysin)에 대 한 평균 형광 강도 결정 | 측정.
   참고: 각 채널에 대 한 평균 형광 강도 값을 결정 하는 다른 채널을 선택할 수 있는지 확인 합니다.
4. 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 스프레드시트에 복사 합니다.
5. 또한 자유 선택 도구로 영역을 묘사 하 여 관심의 영역에서 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 결정 합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 사용 하 여 참조로.
6. 모든 관심 분야에 대 한 모든 반구 4.1-4.5 단계를 반복 합니다.
   참고: 별도로 나중에서 그 관심의 영역에 값을 비교 하기 위해 각 반구에 대 한 값을 결정 (단계 5.2 참조).

5. 데이터 처리

1. 배경 형광은 높은 경우 ( 내용참조), 배경 빼기 필요. 그에 대 한 참조 단백질에 대 한 1 차적인 항 체 없이 처리 하는 조각에 대 한 평균 형광 강도 결정 (여기: synaptophysin) 뇌 영역 및 반구에 대 한 가져온 모든 값에서 해당 값을 뺍니다.
2. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한 단일 채널에 대 한 평균 형광 강렬을 확인 한 때 ( 표 3참조), synaptophysin (에 대 한 값으로 발동기에 대 한 값을 분할 하 여 synaptophysin에 발동기의 비율을 계산 표 3에 노란색)입니다. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한이 작업을 별도로 수행할.
3. 북반구에 관심 분야의 비율을 확인 하려면 해당 반구 ( 표 3에 오렌지) 획득 비율에 의해 얻은 관심의 한 영역에 대 한 비율을 나눕니다.
4. 상대 발동기 풍부를 확인 하려면 1 ( 표 3에 빨간색)에서 편차를 확인 하 여 백분율에 5.2에서 얻은 비율을 번역 합니다. 1.25 비율 따라서 평균, 이상 25%의 상대 발동기 풍부 줄 고 0.75의 비율 평균 25%의 상대 발동기 풍부를 얻을 것 이다.

결과

대표 다른 마커 패턴을 얼룩이 지는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 패턴은 단백질의 분포에 따라 달라 집니다. 5 rostro 꼬리 수준의 예 열 (A)에 표시 됩니다-(E). 첫 번째 행에 표시 되는 대표적인 DAPI 얼룩: DAPI는 세포의 DNA를 준수 하 고 따라서 핵은 스테인드. 이 결과 punctate 패턴. 높은 세포 밀도 낮은 세포 밀도와 지역 보다 밝은....

토론

메서드는 알려진된 분포와 마커 단백질의 풍부에 상대적인 관심사의 단백질의 분포를 측정 하는 겨냥 여기 제시. 면역 형광 염색 얼룩 다른 조각 사이 농도의 높은 다양성을 표시할 수 있습니다. 정량화 방법은 여기에 설명 된 북반구 전체 평균에 관심사의 단백질의 비율을 결정 하 여이 문제를 circumvents. 따라서, 분할 영역에 걸쳐 서로 다른 착 색 농도가 밖으로 취소 하 고 정량에 대 한 허용.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft