Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Résumé

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Résumé

La présence, l’absence ou niveaux de protéines synaptiques spécifiques peuvent influencer considérablement la transmission synaptique. En plus d’élucider la fonction d’une protéine, il faut également déterminer sa diffusion. Nous décrivons ici un protocole utilisant l’immunofluorescence, microscopie confocale et l’analyse assistée par ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique Mover (également appelé TPRGL ou SVAP30). On compare la distribution de Mover à celui de la vésicule synaptique protéine synaptophysine, déterminant ainsi la distribution de Mover de manière quantitative par rapport à l’abondance des vésicules synaptiques. Notamment, cette méthode pourrait potentiellement être mises en œuvre pour permettre une comparaison de la distribution des protéines à l’aide d’anticorps différents ou microscopes ou à travers différentes études. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des salissures par immunofluorescence en cédant un rapport plutôt que des niveaux de fluorescence absolue. En outre, la méthode que nous décrivons permet au chercheur d’analyser la distribution d’une protéine à différents niveaux : des tranches de cerveau entier de régions du cerveau dans différentes sous-régions dans la zone d’un cerveau, telles que les différentes couches de l’hippocampe ou sensorielles cortex. Mover est une protéine spécifique vertébré associé de vésicules synaptiques. Avec cette méthode, nous montrons que le déménageur est hétérogène dans les zones du cerveau, avec des concentrations élevées dans le pallidum ventral, les noyaux septums et l’amygdale et aussi dans les zones du cerveau unique, telles que les différentes couches de l’hippocampe.

Introduction

Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse¹. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau², et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité synaptique à court terme et la vésicule synaptique dynamique^{3, 4 , 5}. par conséquent, il est d’une importance vitale pour pouvoir identifier la présence de différentes protéines synaptiques dans certaines zones du cerveau.

Les méthodes de choix pour la quantification des protéines synaptiques - jusqu'à présent - sont la spectrométrie de masse et de Western Blot, plutôt que d’immunohistochimie^6,7,8,9. Dans certains cas, plusieurs méthodes sont utilisées pour se compléter mutuellement afin d’évaluer la quantité et la localisation des protéines spécifiques (p. ex., Wilhelm et al. ¹⁰). la méthode que nous décrivons ici permet la localisation et quantification des protéines d’intérêt sans avoir besoin d’utiliser toute méthode biochimique, employant simplement les salissures par immunofluorescence. Un autre avantage ici est que la quantification peut être faite sur des zones beaucoup plus petites et, donc, plus précise, que ceux réalisés par d’autres méthodes. Cependant, il faut prendre en considération qu’une protéine de référence fiable est nécessaire pour évaluer la distribution de la protéine d’intérêt.

Une coloration fluorescente par immunohistochimie permet d’identifier systématiquement la localisation des protéines dans certaines zones du cerveau ainsi que dans différents compartiments neuronales. Pour identifier les différents compartiments, marqueurs spécifiques sont utilisés. En général, anticorps contre synapsine et synaptophysine¹¹ peuvent être utilisés pour étiqueter des vésicules synaptiques, tandis que les anticorps contre basson étiqueter la zone active d’un présynaptique borne¹². Transporteurs vésiculaires, tels que les transporteurs de glutamate vésiculaire (vGluT) ou le transporteur vésiculaire de GABA (vGAT), sont utilisés pour étiqueter les excitateurs¹³ et inhibitrice¹⁴ terminaisons présynaptiques, respectivement. Côté postsynaptique, anticorps dirigés contre la protéine Homer peuvent être utilisées pour marquer les bornes postsynaptiques et anticorps contre densité postsynaptique protéine 95 (PSD95)^15,16,17 ou gephyrin^{18 , 19 , 20} peut marquer les bornes postsynaptiques excitateurs ou inhibiteurs, respectivement. En utilisant des anticorps contre une protéine d’intérêt et de marqueurs tels que ceux décrits ci-dessus, on peut déterminer la localisation de cette protéine. De nombreuses études à ce jour l’ont fait dans une manière qualitative²¹. Toutefois, pour déterminer de manière fiable la distribution différentielle d’une protéine synaptique spécifique, il faut non seulement déterminer sa présence ou absence, mais aussi sa concentration relative. L’hétérogénéité de la taille et la densité des synapses rendent important d’établir un rapport entre le marqueur synaptique et la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire, les régions riches en synapse tels que les couches non pyramidaux de l’hippocampe et la couche moléculaire du cervelet montrera une densité élevée de protéines synaptiques, uniquement en raison de la densité plus élevée des synapses mais pas en raison d’une forte présence de cette protéine dans chaque synapse (p. ex., Wallrafen et Dresbach¹). En revanche, les protéines dans le soma neuronal (par exemple, TGN38²²) affichera généralement forte présence dans la couche de cellules pyramidales hippocampe ou la couche de cellules hippocampiques ou cérébelleux granule en raison de la forte concentration de corps des cellules neuronales dans ces domaines. Par conséquent, cette répartition non homogène des structures, synapses dans ce cas, peut conduire à une fausse estimation de la distribution de la protéine d’intérêt elle-même. En outre, il y a une variabilité intrinsèque en intensités de coloration dans les trois échantillons de salissures immunohistochimiques. Le protocole décrit ici tienne compte de cela et évite ces préjugés, mais aussi autres avertissements résultant de méthodes immunohistochimiques.

Dans notre récente étude, nous avons utilisé cette méthode pour décrire l’expression différentielle de Mover (également appelée TPRGL²³ SVAP30²⁴) l’ensemble 16 cerveau différents domaines¹. Mover est une protéine synaptique vertébré spécifiques qui se trouvent en association à des vésicules synaptiques et influence la neurotransmetteur dégagement^25,26,27. Nous avons lié l’expression Mover à l’abondance des vésicules synaptiques, par coloration pour synaptophysine comme un repère de vésicules synaptiques. Nous avons trouvé des niveaux élevés de Mover en particulier dans les noyaux septums, le pallidum ventral et l’amygdale. Dans l’hippocampe, nous trouvons une répartition hétérogène des Mover, avec des niveaux élevés dans les couches associées calcul intra-hippocampique et faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie.

Protocole

Ce protocole n’implique pas d’expériences sur des animaux vivants. Expériences portant sur l’euthanasie des animaux pour prélever des échantillons de cerveau ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T 10/30.

Remarque : Pour ce protocole, 3 souris C57BL/6 mâles adultes ont été utilisées.

1. préparation de l’échantillon

1. Préparer le fixateur et tamponné au phosphate 0,1 M (PB ; voir tableau 1).
2. Difficulté de l’animal par la perfusion de transcardial comme décrit en Gage et al. ²⁸. tout d’abord laver le sang avec 0,9 % NaCl-solution, puis perfuse avec 30 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA).
3. Ouvrir le crâne avec des ciseaux et isoler soigneusement le cerveau à l’aide d’une cuillère angles pour éviter d’endommager le tissu.
4. Remplir un tube de réaction de 50 mL de fixateur et postfix le cerveau chez 4 % PFA à 4 ° C durant la nuit.
5. Enlever le fixateur et laver le cerveau dans 50 mL de 0.1 M PB sur un agitateur pendant 30 min.
6. Après le lavage, incuber le cerveau dans un tube de réaction de 50 mL à 30 % de saccharose à 0,1 M PB pendant 48 h ou jusqu'à ce qu’elle s’enfonce dans le tube à 4 ° C pour la cryoprotection.
7. Rogner le cerveau de cryoprotected avec une lame tranchante, placez-le dans un cryomold et incorporez-le avec la température de coupe optimale (OCT) composée. Éviter les bulles. Orientez le cerveau et geler le cryomold dans le congélateur à-80 ° C.
8. Monter les tissus congelés pour la coupe. Equilibrer le tissu à la température de cryomicrotome pendant au moins 15 min avant la découpe.
9. Section du cerveau en tranches épaisses coronale de 25 µm. Touchez l’OPO soigneusement avec un crochet de verre sans toucher le tissu cérébral. Collecter 3 tranches adjacentes par puits dans une plaque 24 puits et stockez-les en PB de 0,1 M à 4 ° C jusqu'à coloration.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici pendant deux semaines. Les périodes de conservation plus longues peuvent interférer avec la qualité du tissu et ainsi influencer le résultat de l’expérience.

2. immunofluorescence

1. Préparer des solutions, y compris le tampon de blocage, le tampon de l’anticorps, lavage buffer 1 et laver 2 (voir tableau 1).
2. Rincez les tranches une fois avec PB pour enlever l’excès OCT.
   1. Supprimer la solution avec une pipette en plastique sans sucer dans les tranches de cerveau. Ajouter 250 µL de PB fraîche avec une pipette de 1000 µL.
      Attention : Tranches devraient s’assèchent pas, donc supprimer et ajouter des fluides bien par bien.
3. Retirer le PB avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de tampon de blocage / puits avec une pipette de 1000 µL. Incuber pendant 3 h à température ambiante (RT) sur l’agitateur.
4. Au cours de la période d’incubation, diluer l’anticorps primaires dans le tampon d’anticorps dans un tube à essais. Utiliser 250 µL de tampon d’anticorps / puits et ajouter la quantité appropriée d’anticorps (voir tableau 2) par pipetage il directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 µL. Mélanger la solution de pipetage doucement et descendre plusieurs fois. Vortex sous peu par la suite pour assurer un bon mélange.
   Remarque : Pour déterminer la fluorescence de fond, salissures doit également être effectuée sans ajouter de l’anticorps primaire. Pour cela, incuber la tranche dans la solution d’anticorps sans anticorps primaires selon le protocole.
5. Après la période d’incubation, retirer le tampon de blocage avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution d’anticorps contenant des anticorps primaires / puits. Incuber les tranches avec l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur.
6. Le lendemain, laver les tranches avec lavage tampon 1 3 x 10 min à ta sur un agitateur.
   1. Enlever le support avec une pipette en plastique et ajouter 300 µL de tampon 1 de lavage / puits. Incuber à RT pendant 10 min. Répétez 3 fois.
7. Au cours des étapes de lavage, diluer l’anticorps secondaires couplés fluorophore dans le tampon d’anticorps dans un tube à essais. Utiliser 250 µL de tampon d’anticorps / puits et ajouter la quantité appropriée d’anticorps (voir tableau 2) par pipetage il directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 µL. Mélanger la solution de pipetage doucement et descendre plusieurs fois. Vortex sous peu par la suite pour assurer un bon mélange.
   Attention : Puisque les anticorps sont sensibles à la lumière, toutes les étapes de ce moment doivent être effectuées dans l’obscurité.
8. Après les étapes de lavage, enlever le lavage de la mémoire tampon avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution d’anticorps contenant des anticorps secondaires / puits. Incuber les tranches avec un anticorps secondaire pendant 90 min à ta dans l’obscurité.
9. Laver les tranches avec lavage tampon 2 3 x pendant 10 min à température ambiante.
10. Au cours des étapes de lavage, diluer 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 0,1 M PB dans une concentration de 1 : 2000.
11. Retirer le tampon de lavage 2 avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution DAPI / puits. Incuber 5 min à ta sur l’agitateur.
12. Enlever la solution DAPI avec une pipette en plastique et ajouter 500 µL de PB de 0,1 M / puits avec une pipette de 1000 µL.
13. Monter les tranches sur lames de microscope.
    1. Placez une lame de microscope sous le stéréoscope. Avec une brosse fine, ajouter trois gouttes distincts de 0,1 M PB sur le toboggan. Placer une tranche par goutte d’eau sur la lame de microscope.
    2. Utilisez la brosse fine à s’aplatir et à orienter les tranches sur la lame de microscope.
    3. Lorsque toutes les tranches sont correctement positionnés, enlever PB excédent avec un mouchoir et essuyer la lame soigneusement.
       Attention : Éviter de sécher les tranches de cerveau complètement.
    4. Ajouter 80 µL d’incorporation médium sur le toboggan. Déposez délicatement la lamelle sur le toboggan, intégrant ainsi les tranches de cerveau.
    5. Laissez les diapositives à sécher sous la hotte pendant 1-2 h (couvrir afin d’éviter l’exposition à la lumière) et stockez-les dans une boîte de glissière de microscope à 4 ° C.
       Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

3. imagerie

1. Après que le milieu d’enrobage est complètement trempé, placez la lame de microscope sous le microscope confocal.
   NOTE : Microscopie à épifluorescence associée au logiciel de déconvolution devrait produire une qualité d’image similaire.
2. Ajustez les réglages du laser en augmentant ou en diminuant l’intensité du laser pour chaque canal afin que quelques pixels sont surexposés afin d’assurer une répartition maximale des valeurs de gris.
3. Acquérir des tissus virtuels de la tranche de cerveau entier pour les différents canaux.
   1. Les logiciels d’imagerie (voir Table des matières), sélectionnez l’option de tuiles et de définir manuellement la tranche de cerveau avec la Tuile région d’installation.
   2. Distribuer des points d’appui dans toute la région de tuile et ajuster le focus pour les points d’appui différents en appuyant sur Vérifier carrelage régions/Positions...
   3. Ajuster les réglages en Mode d’Acquisition selon la taille désirée de résolution et de fichier de l’image qui en résulte et démarrer la recherche.
4. Lorsque le scan est terminé, utilisez la fonction de couture pour traiter le tissu virtuel. Exporter le fichier comme un .tif avec la fonction Exporter Image.

4. computer-based Analysis

1. Charger tous les canaux pour une seule image dans Fidji²⁹ en cliquant sur fichier | Ouvert.
2. Avec l’outil de sélection à main levée , délimiter un hémisphère dans le DAPI-canal. Créer un masque de la sélection en cliquant sur Edition | Sélection | Créer le masque.
3. Déterminer l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux (Mover et synaptophysine) en cliquant sur Analyze | Mesure.
   Remarque : Veillez à sélectionner les différents canaux pour déterminer les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne pour chaque canal.
4. Copiez l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux dans une feuille de calcul.
5. Déterminer l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux dans un domaine d’intérêt en délimitant la zone aussi avec l’outil de sélection à main levée . Utiliser un atlas de cerveau de souris comme référence.
6. Répétez les étapes 4.1 à 4.5 pour tous les hémisphères et tous les domaines d’intérêt.
   NOTE : Déterminer les valeurs pour chaque hémisphère séparément afin de pouvoir pour comparer plus tard les valeurs dans une zone d’intérêt que dans l’hémisphère (voir étape 5.2).

5. traitement

1. Dans le cas où la fluorescence de fond est élevée (voir Discussion), une soustraction de fond peut-être s’avérer nécessaires. Pour cela, déterminer l’intensité de fluorescence moyenne pour la tranche traitée sans anticorps primaire contre la protéine de référence (ici : synaptophysine) et soustraire cette valeur de toutes les valeurs obtenues pour les régions du cerveau et des hémisphères.
2. Lorsque les intensités de fluorescence moyenne pour les canaux pour chaque hémisphère et tous les domaines d’intérêt ont été déterminées (voir tableau 3), calculer le rapport de Mover à synaptophysine en divisant la valeur Mover de la valeur pour synaptophysine ( jaune dans le tableau 3). Effectuer cette opération pour chaque hémisphère et tous les domaines d’intérêt séparément.
3. Diviser le ratio obtenu pour un domaine d’intérêt par le ratio obtenu pour l’hémisphère correspondant (orange dans le tableau 3) pour déterminer le rapport entre la zone d’intérêt dans l’hémisphère.
4. Pour déterminer l’abondance relative des Mover, traduire le ratio obtenu en 5.2 en pourcentage en déterminant son écart par rapport à 1 (en rouge dans le tableau 3). Un ratio de 1,25 donnerait donc une abondance relative de Mover de 25 % au-dessus de la moyenne, et un ratio de 0,75, produirait une abondance relative de Mover de 25 % inférieure à moyenne.

Résultats

Représentant de modèles de différents marqueurs de coloration peut être vu dans la Figure 1. Le modèle varie en fonction de la répartition de la protéine. Exemples de cinq niveaux rostro-caudal sont indiqués dans les colonnes (A)-(E). Une souillure de DAPI représentatif est montrée dans la première rangée : DAPI adhère à l’ADN d’une cellule et donc les noyaux sont colorés. Il en résulte un motif ponctué....

Discussion

La méthode présentée ici vise à quantifier la distribution d’une protéine d’intérêt par rapport à l’abondance d’une protéine marqueur avec une aire de répartition connue. Immunofluorescence souillant peut montrer une forte variabilité des intensités entre les différentes tranches de coloration. La méthode de quantification décrite ici contourne ce problème en déterminant la proportion de la protéine d’intérêt à la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère. Par conséquent, différentes ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft