Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

Abstract

נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.

Introduction

התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה1. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח2, נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics3, 4 , 5. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפטיים שונים על פני אזורים במוח.

השיטות של בחירה על כימות של חלבונים סינפטיים - כה - הן ספקטרומטר מסה המערבי סופג, במקום אימונוהיסטוכימיה6,7,8,9. במקרים מסוימים, מספר שיטות משמשות משלימים אחד את השני כדי להעריך את הכמות וגם הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים (קרי, וילהלם. et al. 10). שיטת נתאר כאן מאפשרת התאמה לשפות אחרות, כימות של חלבונים עניין ללא צורך באמצעות כל שיטה ביוכימית, פשוט העסקת immunofluorescent stainings. יתרון נוסף כאן הוא כימות יכול להיעשות על אזורים הרבה יותר קטן, לכן, ספציפיות יותר, מאשר אלה מושגת על ידי שיטות אחרות. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי חלבון התייחסות אמין יש צורך להעריך את ההתפלגות של החלבון עניין.

צביעת פלורסנט מאת אימונוהיסטוכימיה מאפשר לנו לזהות באופן שגרתי הלוקליזציה של חלבונים על פני אזורים במוח, כמו גם בתוך תאים עצביים שונים. כדי לזהות את מדורים שונים, משמשות סמני ספציפיים. בדרך כלל, נוגדנים נגד סינפסין ו synaptophysin11 ניתן לתייג הסינפטיות, בעוד נוגדנים נגד בסון תווית האזור הפעיל של מסוף presynaptic12. Vesicular מובילים, כגון שנאים גלוטמט vesicular (vGluT) או גאבא vesicular טרנספורטר (vGAT), משמשים להוספת תווית סינאפסות13 ו מעכבות14 מסופי presynaptic, בהתאמה. בצד postsynaptic, נוגדנים נגד החלבון הומר יכול להיות מועסק כדי לסמן מסופי postsynaptic ולאחר נוגדנים נגד צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD95)15,16,17 או gephyrin18 , 19 , 20 יכול תווית מסופי postsynaptic סינאפסות או מעכבות, בהתאמה. באמצעות נוגדנים נגד חלבון של עניין סמנים כגון אלה שתוארו לעיל, ניתן לקבוע הלוקליזציה של חלבון כזה. מחקרים רבים עד היום לעשות את זה באופן איכותי21 עם זאת, כדי לקבוע באופן אמין ההתפלגות דיפרנציאלית של חלבון ספציפי סינפטית, אחד חייב לא רק לקבוע נוכחותו או היעדרות אלא גם הריכוז היחסי שלו. את הטרוגניות בגדלים וצפיפות של הסינפסות הופך חשוב להקים יחס בין דה מרקר סינפטית החלבון עניין. אחרת, סינפסה-עשיר אזורים כגון שכבות שאינן פירמידה של ההיפוקמפוס, השכבה המולקולרית של הצרבלום יראה צפיפות גבוהה של חלבונים סינפטיים, רק בשל צפיפות גבוהה יותר של הסינפסות אך לא בשל נוכחות חזקה של חלבון זה כל סינפסה (למשל, Wallrafen, Dresbach1). מצד שני, חלבונים ב- סומא עצביים (למשל, TGN3822) בדרך כלל יראה נוכחות חזקה שכבת תאים כפירמידה בהיפוקמפוס או שכבת תאים בהיפוקמפוס או אסטרוציטומה גרגר בשל הריכוז הגבוה של גופי תאים עצביים באזורים אלו. לכן, התפלגות זו אי-הומוגניות של מבנים, במקרה זה synapses, יכול להוביל שערוך שווא של ההתפלגות של החלבון עניין עצמו. יתר על כן, יש השתנות מהותי צביעת עוצמות מדגמים ב- immunohistochemical stainings. הפרוטוקול המתואר כאן לוקח זאת בחשבון ומונעת הטיות כזה, כמו גם אזהרות אחרים הנובעים משימוש בשיטות immunohistochemical.

האחרונים שלנו לומדים, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי לתאר את הביטוי דיפרנציאלית של Mover (הנקרא גם TPRGL23 או SVAP3024) על פני אזורים שונים במוח116. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות סינפטית זה ניתן למצוא האגודה כדי הסינפטיות ומשפיע על2726,25,שחרור נוירוטרנסמיטר. לנו יש הקשורים לביטוי Mover שפע הסינפטיות, על ידי צביעת עבור synaptophysin כסמן הפניה שלפוחית סינפטית. מצאנו רמות גבוהות של Mover בפרט גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית pallidum על הגחון, האמיגדלה. בתוך ההיפוקמפוס, מצאנו בהתפלגות הטרוגנית של Mover, עם רמות גבוהות הרבדים הקשורים למחשוב אינטרה-בהיפוקמפוס, רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט.

Protocol

פרוטוקול זה אינו כרוך בניסויים בבעלי חיים. בניסויים המערבים המתות חסד של בעלי החיים כדי להשיג דגימות המוח אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת מספר אישור T 10/30.

הערה: עבור פרוטוקול זה, 3 עכברים C57BL/6 מבוגרים זכר שימשו.

1. הכנת הדוגמא

  1. להכין מקבע מאגר פוספט 0.1 M (PB; ראה טבלה 1).
  2. לתקן את החיה על-ידי transcardial זלוף כפי שמתואר Gage. et al. 28. קודם לשטוף את הדם עם 0.9% NaCl-פתרון, אז perfuse עם 30 מ של 4% paraformaldehyde (PFA).
  3. לפתוח את הגולגולת עם מספריים ולבודד בזהירות בעזרת כפית עם קצוות קהים כדי למנוע נזק לרקמת המוח.
  4. מלא צינור תגובה 50 מ עם מקבע, postfix המוח ב- 4% מחברים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. הסר את מקבע, לשטוף את המוח ב- 50 מ של 0.1 M PB-מטרף למשך 30 דקות.
  6. לאחר הרחצה, דגירה המוח בשפופרת תגובה 50 מ ב- 30% סוכרוז ב PB 0.1 M 48 שעות או עד שהיא שוקעת בצינור ב 4 ° C עבור cryoprotection.
  7. לקצץ את המוח cryoprotected עם סכין חדה, מניחים אותה cryomold, תטביע אותו עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. להימנע בועות. אוריינט המוח, להקפיא את cryomold במקפיא-80 ° C.
  8. הר הרקמה קפוא על חלוקתה. Equilibrate את הרקמה כדי הטמפרטורה cryomicrotome למשך לפחות 15 דקות לפני חלוקתה.
  9. בסעיף המוח 25 מיקרומטר הילתית פרוסות עבות. לגעת OCT בזהירות עם קרס זכוכית בלי לגעת על רקמת המוח. לאסוף 3 סמוך פרוסות לכל באר היטב צלחת 24 ואחסן אותם ב- 0.1 M PB ב 4 ° C עד מכתים.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עד שבועיים. עוד פעמים אחסון ניתן לשבש מאיכות רקמות, ובכך להשפיע על תוצאות הניסוי.

2. immunofluorescence

  1. להכין פתרונות כולל מאגר חסימה, מאגר נוגדן, שטיפת מאגר 1, ומאגר כביסה 2 (ראה טבלה 1).
  2. לשטוף פרוסות פעם אחת עם חמאת בוטנים כדי להסיר עודפי OCT.
    1. הסר את הפתרון עם פיפטה פלסטיק ללא מכניסה את פרוסות המוח. להוסיף 250 µL של חמאת בוטנים טריים עם פיפטה µL 1000.
      התראה: פרוסות צריך לא יתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים טוב מאת טוב.
  3. להסיר את חמאת בוטנים עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 מאגר חסימה לכל באר עם פיפטה 1000 µL. תקופת דגירה של 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על ניעור.
  4. במהלך זמן הדגירה, לדלל הנוגדנים העיקרית במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
    הערה: כדי לקבוע את הרקע פלורסצנטיות, stainings יש גם לבצעו ללא הוספת נוגדן ראשוני. בשביל זה, דגירה הפרוסה ב נוגדן פתרון ללא נוגדנים העיקרי לפי הפרוטוקול.
  5. לאחר זמן הדגירה, להסיר את המאגר חסימה עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים העיקרי לכל טוב. דגירה פרוסות עם נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C-מטרף.
  6. ביום למחרת, לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 1 3 x 10 דקות ב RT-מטרף.
    1. להסיר את המדיום עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 300 µL לרחוץ את מאגר 1 לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 10 דקות חוזרת 3 פעמים.
  7. במהלך השלבים כביסה, לדלל הנוגדנים משני מצמידים fluorophore במאגר נוגדן בשפופרת התגובה. השתמש מאגר נוגדן µL 250 לכל טוב ולהוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (ראה טבלה 2) מאת pipetting זה ישירות לתוך הפתרון באמצעות פיפטה 2 µL. מערבבים את הפתרון על-ידי pipetting בעדינות לאורך מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח לערבב.
    התראה: בגלל הנוגדנים הם רגישים לאור, כל הצעדים מנקודה זו ואילך יש לבצע בחושך.
  8. אחרי הצעדים כביסה, הסר הכביסה מאגר עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של נוגדן פתרון המכיל נוגדנים משניים לכל טוב. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים משניים עבור 90 דקות ב RT בחושך.
  9. לשטוף את הפרוסות עם שטיפה מאגר 2 3 x 10 דקות ב- RT.
  10. במהלך השלבים כביסה, לדלל 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב PB 0.1 M בריכוז של 1:2000.
  11. להסיר את המאגר כביסה 2 עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף µL 250 של דאפי פתרון לכל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT-ניעור.
  12. להסיר את הפתרון דאפי עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 500 µL של 0.1 M PB לכל באר עם פיפטה 1000 µL.
  13. הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ.
    1. בשקופית מיקרוסקופ תחת סטריאוסקופ המקום. עם מברשת בסדר, להוסיף 3 טיפות נפרדים של 0.1 M PB אותן לשקופית. מניחים פרוסה אחת לכל טיפה על גבי השקופית מיקרוסקופ.
    2. השתמש בכלי מברשת בסדר כדי לרדד, אוריינט את הפרוסות על השקופית מיקרוסקופ.
    3. כאשר כל הפרוסות ממוקמות כהלכה, להסיר את עודף חמאת בוטנים עם טישו ויבש השקופית בקפידה.
      זהירות: הימנעו ייבוש את פרוסות המוח לגמרי.
    4. הוסף µL 80 הטבעה בינוני אותן לשקופית. בזהירות הנמך את coverslip על גבי השקופית, ובכך להטביע את פרוסות המוח.
    5. להשאיר את השקופיות להתייבש בשכונה fume במשך 1-2 h (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

3. הדמיה

  1. לאחר המדיום ההטבעה לחלוטין מוקשה, במקום השקופית מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: מיקרוסקופ Epifluorescence בשילוב עם תוכנת deconvolution אמור להניב איכות תמונה דומה.
  2. התאם את הגדרות לייזר על-ידי הגדלת או הקטנת עוצמת לייזר עבור כל ערוץ כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.
  3. רוכשים את רקמות וירטואלי של הפרוסה כל המוח עבור הערוצים השונים.
    1. בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), בחרו באפשרות ' אריחים ', ניסחו באופן ידני על הפרוסה המוח בעזרת הגדרת אזור אריח.
    2. להפיץ נקודות תמיכה ברחבי אזור אריח ולהתאים את המוקד על הנקודות התמיכה השונים על-ידי הקשת לוודא אריח אזורים/תפקידים.
    3. התאם את ההגדרות במצב רכישה בהתאם לגודל הרצוי הרזולוציה ואת הקובץ של התמונה שתיווצר ולהתחיל את הסריקה.
  4. עם סיום הסריקה, השתמש בפונקציה Stitching לעבד את הרקמה וירטואלי. לייצא את הקובץ. tif עם הפונקציה לייצא את התמונה.

4. המחשב המבוסס על ניתוח

  1. לטעון כל הערוצים יחיד עבור תמונה אחת לתוך פיג'י29 על ידי לחיצה על קובץ | פתוח.
  2. בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית , ניסחו אחד בחצי הכדור דאפי-הערוץ. ליצירת מסיכה של הבחירה על ידי לחיצה עריכה | בחירה | יצירת מסיכת.
  3. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד (Mover ו- synaptophysin) על ידי לחיצה נתח | מדד.
    הערה: הקפד לבחור את הערוצים השונים כדי לקבוע את ערכי העוצמה של זריחה מתכוון לכל ערוץ.
  4. העתק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד לתוך גיליון אלקטרוני.
  5. לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע עבור הערוצים יחיד באזור עניין על ידי בהתוויית האזור גם בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית . השתמש אטלס מוח של עכבר כהפניה.
  6. חזור על הצעדים 4.1-4.5 כל האונות ואת כל תחומי עניין.
    הערה: לקבוע את הערכים עבור האונה כל בנפרד על מנת מאוחר יותר להשוות את הערכים באזור לעניין זה בחצי הכדור הצפוני (ראה שלב 5.2).

5. נתונים טיפול

  1. במקרה הרקע הוא גבוה (ראה דיון), ייתכן שיש צורך חיסור רקע. בשביל זה, לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע על הפרוסה ללא ראשי נוגדן כנגד החלבון הפניה (כאן: synaptophysin) החסר ערך זה מ כל הערכים שהתקבלו עבור אזורים במוח והאונות.
  2. מתי נקבע עוצמות קרינה פלואורסצנטית רעה עבור הערוצים יחיד עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין (ראו טבלה 3), לחשב את היחס שבין Mover כדי synaptophysin על-ידי חלוקת הערך עבור Mover לפי הערך עבור synaptophysin ( צהוב בטבלה3). בצע פעולה זו עבור כל חצי הכדור ואזור בכל עניין בנפרד.
  3. לחלק של היחס שהתקבל עבור אזור אחד של עניין על-ידי היחס שהתקבל עבור הכדור המתאים (כתום בטבלה3) כדי לקבוע את היחס של האזור בעל עניין הכדור.
  4. כדי לקבוע את השפע Mover היחסי, לתרגם את היחס שהתקבל ב- 5.2 באחוזים על-ידי קביעת שלו סטייה 1 (אדום בטבלה3). יחס של 1.25 ייתן לכן שפע Mover היחסי של 25% מעל הממוצע, יחס של 0.75 יניב שפע Mover היחסי של 25% מתחת לממוצע.

תוצאות

נציג מכתים דפוסים של סמנים שונים ניתן לראות באיור1. התבנית משתנה בהתאם להתפלגות של החלבון. דוגמאות של חמש רמות rostro-סימטרית מוצגים בעמודות (א)-(E). צביעת דאפי נציג מוצג בשורה הראשונה: דאפי לאנאפוליס ה-DNA של התא, ובכך גרעינים מוכתמים. התוצאה ה?...

Discussion

השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים ש?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מעולה. המחברים להכיר תמיכה על ידי הרמס Pofantis ו Andoniya Petkova. המחברים גם תודה מכון מדעי המוח האירופית השימוש של LSM800, סיוע טכני, במיוחד על ידי ד ר נילס Halbsgut. עבודה זו מומן על ידי גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת. JSV מאשר תמיכה על ידי המרכז עבור ננו מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL reaction tubesEppendorf30120094
50 mL reaction tubesGreiner Bio-One227261
multiwell 24 wellFisher Scientific                                                                                                087721H
plastic pipette (disposable)Sarstedt861,176
1000 mL pipetteRainin 17014382
2 ml pipetteEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel microscope slidesFisher Scientific                                                                                          10144633CF
StereoscopeLeica
LSM800ZeissConfocal microscope
freezing microtomeLeica
PBS (10X)Roche                                                                                       11666789001
PFASigma                                                                                            P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
sucroseneoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
normal goat serumMerck MilliporeS26-100ML
normal donkey serumMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
rabbit anti-MoverSynaptic SystemsRRID: AB_10804285
guinea pig anti-SynaptophysinSynaptic SystemsRRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                   475904
ZEN2 blue softwareZeissMicroscopy software
FIJIImageJAnalysis software
Microsoft ExcelMicrosoft

References

  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143ImmunofluorescenceMover

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved