Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Riepilogo

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Abstract

La presenza, assenza o livelli di specifiche proteine sinaptiche possono influire gravemente trasmissione sinaptica. Oltre a chiarire la funzione di una proteina, è fondamentale per determinarne anche la distribuzione. Qui, descriviamo un protocollo che impiegano immunofluorescenza, microscopia confocale e l'analisi computerizzata per determinare la distribuzione della proteina sinaptica Mover (chiamato anche TPRGL o SVAP30). Mettiamo a confronto la distribuzione del motore a quello della sinaptofisina proteine delle vescicole sinaptiche, determinando la distribuzione del motore in maniera quantitativa rispetto l'abbondanza delle vescicole sinaptiche. In particolare, questo metodo potrebbe potenzialmente essere implementato per consentire il confronto tra la distribuzione delle proteine usando anticorpi differenti o microscopi o attraverso studi differenti. Il nostro metodo elude la variabilità inerente di immunofluorescente stainings cedendo un rapporto piuttosto che i livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre, il metodo descriviamo consente al ricercatore di analizzare la distribuzione di una proteina su diversi livelli: dalle fette di cervello intero a regioni del cervello a subregions differenti nell'area di un cervello, come i diversi strati dell'ippocampo o sensoriali cortecce. Mover è una proteina di vertebrato-specifico che è associata con vescicole sinaptiche. Con questo metodo, dimostriamo che Mover è eterogeneo tra aree del cervello, con gli alti livelli nell'amigdala, i nuclei settali e pallidum ventrale e anche all'interno di aree cerebrali singole, ad esempio i diversi strati dell'ippocampo.

Introduzione

Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi¹. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello², e la presenza o l'assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termine e dynamics delle vescicole sinaptiche^{3, 4 , 5}. Pertanto, è di vitale importanza per essere in grado di identificare la presenza di diverse proteine sinaptiche tra aree del cervello.

I metodi di scelta per la quantificazione delle proteine sinaptiche - finora - sono di spettrometria di massa e Western blotting, piuttosto che immunohistochemistry^6,7,8,9. In alcuni casi, vengono utilizzati diversi metodi per completarsi a vicenda per valutare sia la quantità e la localizzazione delle proteine specifiche (cioè, Wilhelm et al. ¹⁰). il metodo qui descritto consente per la localizzazione e la quantificazione delle proteine di interesse senza la necessità di utilizzare qualsiasi metodo di biochimica, semplicemente che impiegano gli stainings immunofluorescenti. Un altro vantaggio è che la quantificazione può essere fatto su aree molto più piccoli e, dunque, più specifico, rispetto a quelli realizzati con altri metodi. Tuttavia, uno deve prendere in considerazione che una proteina di riferimento affidabile è necessario per valutare la distribuzione della proteina di interesse.

Macchiatura fluorescente da immunohistochemistry permette di identificare sistematicamente la localizzazione delle proteine attraverso aree cerebrali, così come all'interno di diversi compartimenti neuronali. Per identificare i diversi compartimenti, vengono utilizzati gli indicatori specifici. In genere, anticorpi contro la sinapsina e lo synaptophysin¹¹ possono essere usati per etichettare le vescicole sinaptiche, mentre gli anticorpi contro fagotto etichettare la zona attiva di un terminale presinaptico¹². Trasportatori vescicolari, quali i trasportatori del glutammato vescicolare dei suini (vGluT) o il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT), vengono utilizzati per etichettare eccitatorio¹³ e inibitorio¹⁴ terminali presinaptici, rispettivamente. Sul versante postsinaptico, anticorpi contro la proteina Homer possono essere impiegati per contrassegnare terminali postsinaptici e anticorpi contro densità postsinaptica proteina 95 (PSD95)^15,16,17 o gephyrin^{18 , 19 , 20} può etichettare terminali postsinaptici eccitatori o inibitori, rispettivamente. Usando gli anticorpi contro una proteina di interesse e marcatori come quelle descritte sopra, si può determinare la localizzazione di tali proteine. Molti studi fino ad oggi hanno fatto questo in un modo qualitativo²¹. Tuttavia, per determinare in modo affidabile la distribuzione differenziale di una specifica proteina sinaptica, si deve non solo determinare la presenza o assenza, ma anche la concentrazione relativa. L'eterogeneità di dimensioni e densità delle sinapsi lo rende importante per stabilire un rapporto tra il marcatore sinaptico e la proteina di interesse. In caso contrario, sinapsi ricche regioni quali gli strati non-piramidali dell'ippocampo e strato molecolare del cervelletto mostrerà un'alta densità di proteine sinaptiche, solo a causa della maggiore densità delle sinapsi, ma non a causa di una forte presenza di quella proteina in ogni sinapsi (ad es., Wallrafen e Dresbach¹). D'altra parte, proteine in soma neuronale (ad es., TGN38²²) di solito mostrano forte presenza nella strato delle cellule piramidali hippocampal o strato delle cellule ippocampali o cerebellari del granello dovuta all'alta concentrazione di corpi delle cellule neuronali in quelle zone. Pertanto, questa distribuzione non omogenea delle strutture, in questo caso le sinapsi, può portare a una falsa stima della distribuzione della proteina di interesse stesso. Inoltre, vi è un'intrinseca variabilità nell'intensità di colorazione attraverso campioni in stainings immunohistochemical. Il protocollo descritto qui prende questo in considerazione ed evita tali pregiudizi, come pure altri avvertimenti che derivano da metodi immunohistochemical.

Nel nostro recente studio, abbiamo utilizzato questo metodo per descrivere l'espressione differenziale di Mover (chiamato anche TPRGL²³ o SVAP30²⁴) attraverso 16 di aree differenti del cervello¹. Mover è una proteina sinaptica di vertebrato-specifico che può essere trovata in associazione a vescicole sinaptiche ed influenze neurotrasmettitore rilascio^25,26,27. Abbiamo abbiamo riferito l'espressione Mover per l'abbondanza delle vescicole sinaptiche, macchiando per lo synaptophysin come un marcatore di riferimento delle vescicole sinaptiche. Abbiamo trovato alti livelli di Mover in particolare i nuclei settali, pallidum ventrale e l'amigdala. All'interno dell'ippocampo, abbiamo trovato una distribuzione eterogenea di Mover, con alti livelli negli strati connessi con calcolo intra-ippocampale e bassi livelli in livelli di ingresso e di uscita.

Protocollo

Questo protocollo non comporta esperimenti su animali vivi. Gli esperimenti che coinvolgono eutanasia degli animali per ottenere campioni del cervello sono stati approvati dalle autorità locali di protezione animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sotto il numero di omologazione T 10/30.

Nota: Per questo protocollo, sono stati utilizzati topi C57BL/6 3 maschio adulto.

1. preparazione del campione

1. Preparare il fissativo e tampone fosfato 0,1 M (PB; si veda tabella 1).
2. Difficoltà l'animale mediante perfusione perfusione come descritto in Gage et al. ²⁸. in primo luogo lavare il sangue con 0,9% NaCl-soluzione, quindi irrorare con 30 mL di paraformaldeide al 4% (PFA).
3. Aprire il cranio con le forbici e isolare accuratamente il cervello utilizzando un cucchiaio con spigoli arrotondati per evitare di danneggiare il tessuto.
4. Riempire una provetta di reazione da 50 mL con fissativo e postfix il cervello nel 4% PFA a 4 ° C durante la notte.
5. Rimuovere il fissativo e lavare il cervello in 50 mL di PB 0,1 M su un agitatore per 30 min.
6. Dopo il lavaggio, incubare il cervello in un tubo di reazione da 50 mL in 30% di saccarosio in PB 0,1 M per 48 h o fino a quando non si affonda nel tubo a 4 ° C per crioprotezione.
7. Tagliare il cervello di crioprotetti con una lama affilata, collocarlo in un cryomold e incorporarlo con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto. Evitare le bolle. Orientare il cervello e congelare il cryomold nel congelatore-80 ° C.
8. Montare il tessuto congelato per il sezionamento. Equilibrare il tessuto alla temperatura cryomicrotome per almeno 15 min prima di sezionamento.
9. Sezione del cervello a 25 µm spessore fette coronali. Toccare il OCT attentamente con un gancio di vetro senza toccare il tessuto cerebrale. Raccogliere 3 fette adiacenti per pozzetto in un piatto ben 24 e archiviarli in PB 0,1 M a 4 ° C fino a colorazione.
   Nota: Il protocollo può essere sospeso qui per fino a due settimane. Tempi di conservazione più lungo possono interferire con la qualità del tessuto e quindi influenzare il risultato dell'esperimento.

2. immunofluorescenza

1. Preparare soluzioni tra cui il tampone bloccante, il buffer di anticorpo, lavaggio buffer 1 e tampone di lavaggio 2 (Vedi tabella 1).
2. Sciacquare le fette una volta con PB per rimuovere l'eccesso OCT.
   1. Rimuovere la soluzione con una pipetta di plastica senza succhiare le fettine di cervello. Aggiungere 250 µ l di PB fresco con una pipetta di 1000 µ l.
      Attenzione: Fette non devono asciugarsi, quindi rimuovere e aggiungere liquidi Pozzetto da altro.
3. Rimuovere il PB con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di tampone bloccante per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente (TA) sull'agitatore.
4. Durante il periodo di incubazione, diluire gli anticorpi primari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione.
   Nota: Per determinare la fluorescenza di fondo, gli stainings deve essere eseguiti anche senza l'aggiunta dell'anticorpo primario. Per questo, incubare la fetta in soluzione di anticorpo senza anticorpi primari secondo il protocollo.
5. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il tampone di bloccaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo che contiene gli anticorpi primari per pozzetto. Incubare le fette con l'anticorpo primario durante la notte a 4 ° C in un agitatore.
6. Giorno successivo, lavare le fette con lavaggio tampone 1 3 x per 10 min a RT su un agitatore.
   1. Rimuovere il supporto con una pipetta di plastica e aggiungere 300 µ l di tampone 1 di lavaggio per pozzetto. Incubare a + RT 10 min ripetere 3 volte.
7. Durante le fasi di lavaggio, diluire i fluoroforo-accoppiati anticorpi secondari nel buffer dell'anticorpo in un tubo di reazione. Utilizzare 250 µ l di tampone di anticorpo per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (Vedi tabella 2) pipettando esso direttamente la soluzione utilizzando una pipetta 2 µ l. Miscelare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco in seguito per garantire la corretta miscelazione.
   Attenzione: Poiché gli anticorpi sono sensibili alla luce, tutte le misure da questo punto in poi devono essere eseguite nel buio.
8. Dopo i passaggi di lavaggio, Rimuovi il lavaggio tampone con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione di anticorpo contenente anticorpi secondari per pozzetto. Incubare le fette con anticorpo secondario per 90 min a RT nel buio.
9. Lavare le fette con lavaggio tampone 2 3 x per 10 minuti a TA.
10. Durante le fasi di lavaggio, diluire 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PB 0,1 M in una concentrazione di 1: 2000.
11. Rimuovere il tampone di lavaggio 2 con una pipetta di plastica e aggiungere 250 µ l di soluzione DAPI per pozzetto. Incubare per 5 min a RT sull'agitatore.
12. Rimuovere la soluzione DAPI con una pipetta di plastica e aggiungere 500 µ l di PB 0,1 M per pozzetto con una pipetta di 1000 µ l.
13. Montare fette su vetrini da microscopio.
    1. Posto un vetrino da microscopio sotto lo stereoscopio. Con un pennello fine, aggiungere tre gocce separate di 0.1 M PB sulla diapositiva. Mettete una fetta per goccia sul vetrino del microscopio.
    2. Utilizzare il pennello sottile per appiattire e orientare le fette sul vetrino da microscopio.
    3. Quando tutte le sezioni sono posizionate correttamente, rimuovere PB in eccesso con un panno e asciugare accuratamente la diapositiva.
       Attenzione: Evitare l'essiccazione le fette di cervello completamente.
    4. Aggiungere 80 µ l di mezzo nella diapositiva di inclusione. Abbassare con cautela il coprioggetto sulla diapositiva, quindi incorporare le fette di cervello.
    5. Lasciare le diapositive ad asciugare la cappa per 1-2 h (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e memorizzarli in una casella di scorrimento microscopio a 4 ° C.
       Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. imaging

1. Dopo il mezzo di inclusione è completamente indurito, posizionare il vetrino al microscopio confocale.
   Nota: Epifluorescenza combinato con software di deconvoluzione dovrebbe produrre qualità d'immagine simile.
2. Regolare le impostazioni di laser aumentando o diminuendo l'intensità del laser per ogni canale in modo che alcuni pixel sono sovraesposte per assicurare la massima distribuzione dei valori di grigio.
3. Acquisire tessuti virtuale della fetta intero cervello per i diversi canali.
   1. Nel software di imaging (Vedi Tabella materiali), selezionare l'opzione di piastrelle e delineare manualmente la fetta di cervello con la Piastrella regione Setup.
   2. Distribuire i punti di assistenza in tutta la regione di mattonelle e regolare il fuoco per i punti di supporto differente premendo Verificare Tile regioni/posizioni...
   3. Regolare le impostazioni in Modalità di acquisizione secondo la desiderata ad alta risoluzione e le dimensioni dell'immagine risultante e avviare la scansione.
4. Quando la scansione è terminata, è possibile utilizzare la funzione di cucitura per elaborare il tessuto virtuale. Esportare il file come un TIF con la funzione Esporta immagine.

4. computer-based Analysis

1. Caricare tutti i singoli canali per un'immagine in Figi²⁹ cliccando File | Aperto.
2. Con lo strumento selezione a mano libera , delineare un emisfero nel DAPI-canale. Creare una maschera di selezione facendo clic modifica | Selezione | Creare la maschera.
3. Determinare l'intensità media di fluorescenza per i singoli canali (Mover e lo synaptophysin) cliccando Analyze | Misura.
   Nota: Assicurarsi di selezionare i canali diversi per determinare i valori di intensità media di fluorescenza per ogni canale.
4. Copiare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un foglio di calcolo.
5. Determinare l'intensità media di fluorescenza per singoli canali in un'area di interesse di delineare la zona anche con lo strumento selezione a mano libera . Utilizzare un Atlante del cervello del mouse come riferimento.
6. Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per tutti gli emisferi e tutte le aree di interesse.
   Nota: Determinare i valori per ogni emisfero separatamente per poi confrontare i valori in un'area di interesse a quello nell'emisfero (Vedi punto 5.2).

5. il trattamento

1. Nel caso in cui la fluorescenza di fondo è alta (Vedi discussione), potrebbe essere necessario una sottrazione di sfondo. Per questo, determinare l'intensità media di fluorescenza per la fetta elaborata senza primaria dell'anticorpo contro la proteina di riferimento (qui: sinaptofisina) e sottrarre tale valore da tutti i valori ottenuti per le regioni del cervello e gli emisferi.
2. Quando sono state determinate le intensità media di fluorescenza per singoli canali per ogni emisfero e ogni area di interesse (Vedi tabella 3), calcolare il rapporto di Mover per lo synaptophysin dividendo il valore per Mover per il valore per lo synaptophysin ( giallo nella tabella 3). Questa azione eseguita separatamente per ogni emisfero e ogni area di interesse.
3. Dividere il rapporto ottenuto per un'area di interesse per il rapporto ottenuto per l'emisfero corrispondente (arancione nella tabella 3) per determinare il rapporto tra l'area di interesse per l'emisfero.
4. Per determinare la relativa abbondanza di Mover, tradurre il rapporto ottenuto in 5.2 in una percentuale da determinare la deviazione da 1 (in rosso nella tabella 3). Un rapporto di 1.25 darebbe quindi una relativa abbondanza di Mover del 25% superiore alla media, e un rapporto di 0,75 produrrebbe una relativa abbondanza di Mover del 25% inferiore alla media.

Risultati

Rappresentante modelli dei diversi marcatori di macchiatura può essere visto nella Figura 1. Il modello varia a seconda della distribuzione della proteina. Esempi di cinque livelli di rostro-caudale sono riportati nelle colonne (A)-(E). Un rappresentante colorazione DAPI è indicata nella prima riga: DAPI aderisce al DNA di una cellula e quindi i nuclei sono colorati. Ciò provoca un modello punctato. Regioni con una densit?...

Discussione

Il metodo qui presentato mira a quantificare la distribuzione di una proteina di interesse riguardante l'abbondanza di una proteina marker con una nota distribuzione. Colorazione di immunofluorescenza può mostrare un'alta variabilità dell'intensità tra le diverse sezioni di colorazione. L'approccio di quantificazione descritto qui aggira questo problema determinando il rapporto della proteina di interesse per i media in tutto l'emisfero. Di conseguenza, diverse intensità di colorazione attraverso fette sono vanificat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft