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摘要

在这里, 我们提出了一个方案, 以感染原生真皮成纤维细胞与 mcpyv。该方案包括皮肤成纤维细胞的分离、mcpyv 病毒的制备、病毒感染、免疫荧光染色和荧光原位杂交。该协议可以扩展到描述 mcpyv-主机相互作用的特征, 并发现 mcpyv 注入的其他细胞类型。

摘要

默克尔细胞多瘤病毒 (mcpyv) 感染可导致默克尔细胞癌 (mcc), 这是一种极具攻击性的皮肤癌。由于缺乏适当的细胞培养模型, 充分研究 mcpyv 分子生物学和致癌机制的力学研究受到了阻碍。在这里, 我们描述了一组执行和检测人类皮肤细胞 mcpyv 感染的协议。这些协议描述了人真皮成纤维细胞的分离、重组 mcpyv 病毒的制备, 以及免疫荧光 (if) 染色和原位 dna 杂交链反应 (hcr) 检测病毒感染的方法, 这是一种高度敏感的方法。荧光原位杂交 (fish) 方法。有兴趣的研究人员可以对本文中的协议进行调整, 以确定支持 mcpyv 感染的其他细胞类型或细胞系。所描述的 fish 方法也可以用来检测受感染的人类皮肤中存在的低病毒 dna 水平。

引言

默克尔细胞多瘤病毒 (mcpyv) 是一种小型双链 dna 病毒, 与罕见但具有攻击性的皮肤癌, 默克尔细胞癌 (mcc)1,2。mcc 的死亡率, 约 33%, 超过黑色素瘤 3,4。mcpyv 的圆形基因组约为 5 kb 1,5 被非编码调控区 (ncrr) 一分为二, 进入早期和后期编码区域1。ncrr 包含病毒复制 (ori) 的病毒来源和病毒转录的双向启动子 6,7。早期区域编码肿瘤抗原蛋白称为大 t (lt), 小 t (st), 57kt, 替代 lt orf (alto), 以及自动调节 mirna1,8, 9, 10.后期区域编码衣壳蛋白 vp1 和 vp211,12,13。lt 和 st 是研究最多的 mcpyv 蛋白, 已被证明支持病毒 dna 复制和 mcpyv 诱导的肿瘤发生 5。mcpyv dna 在宿主基因组中的克隆整合, 在多达80% 的 mcc 中被观察到, 很可能是病毒阳性肿瘤发生 14,15的一个因果因素。

在过去20年中, mcc 的发病率增加了两倍16。无症状 mcpyv 感染在一般人群中也很普遍,为 17,18,19。随着 mcc 诊断数量的增加和 mcpyv 感染的高流行率, 有必要提高我们对病毒及其致癌潜力的认识。然而, mcpyv 生物学和致癌机制的许多方面仍然鲜为人知20。这主要是因为 mcpyv 在现有细胞系11、12、21、22、23以及直到最近的皮肤细胞中复制得很差, 直到最近, 还有能够支持 mcpyv 的皮肤细胞感染没有被发现 22。由于缺乏传播病毒的细胞培养系统, 充分研究 mcpyv 及其与宿主细胞相互作用的力学研究受到了阻碍。

我们发现, 从新生儿包皮中分离出的原代人真皮成纤维细胞 (hdf)在体外和体外24支持强大的 mcpyv 感染。通过本研究, 建立了 mcpyv24的第一个细胞培养感染模型。在该模型系统的基础上, 我们发现, 通过 wnt/β-儿茶素信号转导途径和其他生长因子诱导基质金属蛋白酶 (mmp) 基因刺激 mcpyv 感染。此外, 我们还发现, fda 批准的 mek 拮抗剂曲美替尼有效地抑制 mcpyv 感染5,25。通过这些研究, 我们还建立了一套隔离人真皮成纤维细胞 24,25的协议, 准备 mcpyv 病毒 11,12, 对人类真皮成纤维细胞进行 mcpyv 感染24,25和 mcpyv 蛋白的 if 染色26。此外, 我们还采用原位 dna 杂交链反应 (hcr) 技术27 , 开发了一种高度敏感的 fish 技术 (hcr-dna fish), 用于检测受感染的人类皮肤细胞中的 mcpyv dna。这些新方法将有助于研究 mcpyv 的感染周期以及细胞对 mcpyv 感染的反应。维持 mcpyv 感染的天然宿主水库细胞和引起 mcc 肿瘤的细胞仍然是未知的。我们在这篇手稿中描述的技术可以用来检查各种类型的人体细胞, 以确定储集细胞和 mcc 肿瘤的起源。我们已建立的方法, 如 hcr-dna fish, 也可用于检测其他 dna 肿瘤病毒和宿主细胞相互作用的特征。

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研究方案

人类新生儿包皮是从宾州皮肤病研究中心获得的。成人人成纤维细胞是在手术后从废弃的正常皮肤中获得的。所有议定书都得到了宾夕法尼亚大学机构审查委员会的批准。

1. 人真皮成纤维细胞的分离

  1. 使用剪刀剪掉人类新生儿包皮的脂肪和皮下组织, 并将皮肤样本切成两半或四分之一。
  2. 在 pbs 中将 10 mgml 消解酶 ii 中的5毫升组织在4°c 后补充抗生素抗真菌。
  3. 在10厘米的无菌盘子里, 使用微解剖钳将表皮与真皮层仔细分离。
  4. 将产生的真皮组织转移到含有5毫升 2 mgml 胶原酶 iv 型的 15 ml 锥形管中, 在 fbs 不含源培养基中补充抗生素抗真菌药。
  5. 在37°c 的情况下将样品在 5% co2 中培养 4-6, 并有周期性晃动, 直到只保留几个宏观组织集体。
  6. 用10毫升的移液器, 通过上下移液 (三管) 大力释放单个细胞十次。
  7. 以 180 x g 离心 5分钟 , 并丢弃上清液。
  8. 在 5% co2 中, 在37°c 条件下, 在 dmem 培养基中培养离解细胞, 辅以10% 的胎儿小牛血清、1% 的非必需氨基酸和 1%的 l-谷氨酰胺。

2. 重组 mcpyv virion 制剂

  1. 以200μl 体积 (37°c 时 4小时) 的 250 u bahi-hf 消化50μg 的 pr17b 质粒 (携带 mcpyv 基因组), 将病毒基因组与病媒主干分离 (图 2)。
  2. 在消化的 dna 中加入1200μl 缓冲 pb (辅送10μl 的 3m naac, ph 5.2), 并通过2个微制备自旋柱 (20μg dna 容量) 进行纯化。用 200μl te 缓冲液 (10 mm tris-hcl, pR17b, 1 mm edta) 从每根柱中清除消化的 pr17b 质粒。
  3. 在50毫升离心管中准备结扎反应。从步骤2.2 中加入400μl 纯化质粒 dna, 将 1.05 x t4 连接酶缓冲液 8.6 ml 和高浓度 t4 连接酶6μl。在16°c 下隔夜孵化。
  4. 在结扎中加入45毫升缓冲 pb (辅以10μl 的 3m naac, ph 5.2), 并使用真空歧管通过2个微准备自旋柱加载。用 50μl te 缓冲液对每根柱进行洗脱。预计 dna 的产量约为30微克。
  5. 在傍晚, 种子 6 x10 6 293tt28细胞进入一个10厘米的盘子含有 dmem 培养基, 辅以10% 的胎儿小牛血清, 1% 非必需氨基酸, 1% l-谷氨酰胺没有湿霉素 b。
  6. 第二天早上, 确保细胞融合在 5 0% 左右。转染使用66微克升转染试剂 (1.1 微克 lcm2), 12 微克重组 mcpyv 分离 r17b dna 从步骤 2.4, 8.4 微克 st 表达质粒 pmtb 和9.6 微克 lt 表达质粒 padl *29。
  7. 当转染的细胞接近融合时, 第二天, 对细胞进行胰蛋白酶化, 并将其转移到 1 5 厘米的盘子中继续扩张。
  8. 可选在扩张时取少量293tt 细胞, 并对 mcpyv lt (cm2b4) 和 vp1 (mcv vp1 兔 30) 进行 if 染色, 以确定转染效率。在这个阶段, 核 lt 信号可能是可见的, 但 vp1 表达式可能无法检测到。
  9. 当15厘米的菜变成几乎融合 (通常5-6 后, 最初转染), 转移细胞成三个15厘米的菜。收获细胞从15厘米的菜肴时, 他们成为几乎融合, 并遵循下面的病毒收获协议。
    注: (可选) 执行质量控制 if, 如步骤2.8 中所述。在这一阶段, 大多数细胞应同时呈 mcpyv lt 和 vp1 阳性。
  10. 要收获病毒, 胰蛋白酶细胞, 在 rt 以 180 x g旋转 5分钟, 并去除上清液。加入一个细胞颗粒体积的 dpbs-mg (dbs 与 9.5 mm mgcl2和1x 抗生素-抗真菌)。然后加入 25 mm 硫酸铵 (从 1m ph 9k 库存溶液), 然后加入 0.5% triton x-100 (来自10% 的库存溶液)、0.1% 的苯并二酶和0.1% 的 atp 依赖 dnase。混合良好, 在37°c 孵育过夜。
  11. 将混合物在冰上加生量 15分钟, 然后加入0.17 体积的 5m ncl。在4°c 的离心机中, 在 12, 000 x 克的情况下, 在冰上再搅拌 15分钟, 旋转10分钟。如果上清液不清晰, 轻轻反转管, 重复纺纱步骤。将上清液转移到新管中。
  12. 如步骤2.11 所述, 使用一个容量的 dpbs 再加上 0.8 m 氯化钠, 然后再旋转。
  13. 将步骤2.11 和2.11 中的上清液结合起来, 再旋转一次, 如步骤2.11 中所述。
  14. 将碘沙诺梯度倒在薄壁5毫升多色管中, 采用底放 (27%, 然后 33%, 然后 39%) ~ 0.7 ml 步骤, 使用装有长针或 p1000 移液器的3毫升注射器。
  15. 在制备的碘化醇梯度上加载3毫升澄清含病毒上清液。
  16. 在 sw55ti 转子中旋转3.5 小时 , 温度为 2.4000 x g 和16°c。将加速和减速设置为慢速。
  17. 超离心后, 在硅化管中收集12个组分 (每个分数约 400μl)。
  18. 用 dsdna 试剂和/或西方印迹分析 vp1 (mcv vp1兔 30) 病毒存在的分数。池梯度分数与峰值 dsdna 和/或 vp1 含量, 并通过定量 pcr 表征股票, 以计算病毒基因组当量31。将 mcpyv 维瑞翁库存存放在-80°c。

3. 感染

  1. 在 dmem 中保持原代人真皮成纤维细胞, 有10% 的胎儿小牛血清、1% 的非必需氨基酸和1% 的 l-谷氨酰胺。到达合流处时, 分裂成纤维细胞 1: 4 而不向下旋转。
    注: 对于最高的 mcpyv 感染效率, 请使用在电镀时主动分裂的通道5和12之间的原生成纤维细胞。
  2. 感染人真皮成纤维细胞, 吸入培养基, 并用 dpbs 清洗细胞。
  3. 在盘中加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
  4. 检查显微镜下, 以确保细胞从盘子里脱落。
  5. 加入含有 20 ngmml egf、20 ngml bfgf 和 3μm chr99021 的 dmm/f12 培养基的10毫升, 所有这些介质都刺激 mcpyv 感染24, 并将细胞溶液转移到 15 ml 管中。
  6. 将细胞向下旋转, 以 180 x g的速度旋转 2分钟, 并丢弃上清液。在 dmm/f12 培养基中, 在 2-4 x 10 4 细胞中, 将含有 20 ng/ml egf、20 ngml bfgf 和 3μm chr99021 的细胞重新移植。
  7. 种子200μl 的细胞悬浮液补充 1 mgml 胶原酶 iv 型到每口井的96孔板。解冻 mcpyv virion 股票在冰上。每 2, 500 至5000个细胞每1μl 碘沙诺添加 10 9个 mcpyv 维利昂病毒基因组等价物 (在步骤2.18 中计算)。 轻轻轻触板的一侧, 然后将板放在孵化器中。
  8. 在 5% co2 37°c 孵育 48-72小时后, 在每口井中加入20% 的 fbs。
  9. 允许感染在25°c 时在 5% co 2 中进行 72-96小时.

4. 免疫荧光染色

  1. 将步骤3.9 中获得的细胞与 pbs 中3% 的甲醛固定20分钟。
  2. 用 pbs 清洗细胞两次。
  3. 在 rt 中, 将细胞培养在块渗透缓冲液中 (0.5% triton x-100, 3% bsa 通过0.22μm 过滤器过滤1小时。
  4. 用以下原代抗体培养细胞: 小鼠单克隆抗 mcpyv lt (CM2B4) (1:1000) 和兔多克隆抗 anti-MCPyV vp1 抗体 (1:1000), 在 rt 3小时。
  5. 用 pbs 清洗细胞三次。
  6. 用二级抗体培养细胞: 氟594山羊抗小鼠 igg (1xy1000) 和 fluor 488 山羊抗兔 igg (1: 500) 在 rt 1小时。
  7. 用 pbs 清洗细胞三次。
  8. 用 0.5μgml dapi (4 ', 6-二胺-2-苯丁胺, 盐酸) 对细胞进行反染。
  9. 将盖板安装在玻璃幻灯片上, 并使用倒置荧光显微镜进行分析。

5. 就地 dna-hcr

注: 此技术要求在盖板上播种细胞。为此, 上述感染条件 (步骤 3) 可扩展到24井板格式。

  1. 用 4% pfa 在 pbs 中用 4% pfa 固定细胞 10分钟, 用 pbs 清洗两次盖板, 然后用70% 乙醇对其进行治疗, 使细胞在4°c 过夜时渗透。
    注: 固定示例可以在此状态下保留几天。
  2. 通过探针杂交缓冲液取代乙醇和在 rt 孵育 60分钟, 对乙醇进行预杂交。
  3. 在预杂交步骤结束前 30分钟, 在探针杂交缓冲液中稀释探针 (1:500) (表 1), 并在45°c 孵育。
  4. 在孵育结束时, 在显微镜幻灯片上, 每块布上的稀释探针混合的移液器 ~ 10μl。将盖板, 细胞侧向下, 在他们各自的杂交探针液滴混合。用少量的橡胶水泥将盖板的边缘和背面密封到滑梯上。
  5. 在94°c 时, 通过将滑块设置在热块的平面上, 将添加的探头加热3分钟。将滑块转移到加湿室, 并在45°c 下孵育过夜。为了使一个简单的加湿室, 轻轻抑制无菌纸巾与 dh2o 和放置在一个塑料容器的底部, 密封与橡胶垫片.
    注: 在加热过程中, 橡胶水泥可以短暂地起泡。但是, 请确保密封件不会破裂。
  6. 小心地剥去橡胶水泥用钳子, 并把盖板侧细胞侧回到一个24孔板的井。用探头清洗缓冲液在 rt 上清洗三次。
  7. 在 rt 30-60 内在放大缓冲液 (24 孔板中的 200μl) 中培养盖板。
  8. 同时, 退火两个标记的寡核苷酸发夹中的每一个通过加热到 94°c 90°c 和冷却到 rt 30分钟, 同时防止光线照射, 识别在单独的 pcr 管中的探针 (表 1)。将两个发夹混合在放大缓冲液中, 每个发夹稀释1:50。
  9. 通过将石蜡膜拉伸到24孔板盖的开口面上, 制作用于放大反应的表面。将发夹放大缓冲液混合物的液滴50-100μl 滴滴到石蜡膜上, 用于每个盖板。使用钳子小心地从预放大溶液中取出盖板。通过触摸边缘到多孔一次性擦拭, 擦干盖板, 并将细胞侧向下放置在放大液滴上。
  10. 将拿着盖板的盖板放在加湿的房间里, 在黑暗中在 rt 孵育一夜。
  11. 再一次把盖板还给井。用 5倍 ssct [5倍氯化钠 (ssc) 对样品进行过滤, 通过0.22μm 过滤器过滤 0.1% tween 20], 其中含有 0.5μgml dapi, 在 rt 用 5倍 ssct 清洗两次样品。
  12. 将盖板安装在显微镜幻灯片上。使用倒置荧光显微镜对细胞进行分析并对样品进行成像。

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结果

本手稿中描述的协议允许隔离几乎同质的 hdf 群 (图 1)。免疫荧光染色显示, 使用本协议中描述的条件分离的人真皮细胞中, 几乎100% 的皮肤细胞对真皮成纤维细胞标记物、vimentin 和胶原蛋白 i24 进行了阳性染色, 但对人体呈阴性。包皮角质形成细胞标记 k14 (图 1)。图 2显示了使用重组 mcpyv ?...

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讨论

上述方法包括从人体皮肤组织中分离真皮成纤维细胞、制备重组 mcpyv 病毒、培养细胞感染、免疫荧光染色和采用 hcr 技术的敏感 fish 方法。应该使研究人员能够分析 mcpyv 感染 27.在体外实现 mcpyv 感染的最关键步骤之一是生产高滴度病毒制剂。利用本文所述的重组 mcpyv 病毒的制备方案, 我们实现了每毫升的 10, 12个基因组拷贝的病毒滴度, 共 11,

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢 meenhard herlyn 博士 (wistar 研究所) 和 m. celeste simon 博士 (宾夕法尼亚大学) 提供试剂和技术支持。我们还感谢我们实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了国家卫生研究院 (r01ca187718、r01ca147778 和 R01CA187718)、nci 癌症中心支助赠款 (nci p30 c12016520) 和 penn cfar 奖 (p30 ai 045008) 的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

参考文献

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