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Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à infecter primaire fibroblastes dermiques humains avec MCPyV. Le protocole prévoit l’isolement des fibroblastes dermiques, préparation des virions MCPyV, infection par le virus, immunofluorescence souillant et fluorescence hybridation in situ. Ce protocole peut être étendu pour la caractérisation des interactions hôte-MCPyV et découvrir d’autres types de cellules susceptible d’être infectés par MCPyV.

Résumé

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection peut mener à carcinome de cellules de Merkel (MCC), une forme très agressive de cancer de la peau. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV la biologie moléculaire et mécanismes oncogènes ont été entravés par un manque de modèles de culture de cellules adéquates. Nous décrivons ici une série de protocoles d’effectuer et de détecter l’infection des cellules de peau humaine primaire MCPyV. Les protocoles décrivent l’isolement des fibroblastes dermiques humains, préparation des recombinants MCPyV virions et détection de l’infection par le virus par immunofluorescence (IF) et la réaction en chaîne in situe hybridation de l’ADN (HCR), qui est un très sensible fluorescence en approche de situ hybridation (poisson). Les protocoles dans les présentes peuvent être adaptés par les chercheurs intéressés à identifier d’autres types de cellules ou lignées de cellules qui prennent en charge de l’infection MCPyV. L’approche décrite de poisson pourrait également être adapté pour détecter de faibles niveaux d’ADN viral présent dans la peau d’humaine infectée.

Introduction

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) est un virus à ADN double brin petit qui a été associé à un cancer de la peau rare mais agressif, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Le taux de mortalité du MCC, environ 33 %, dépasse celle du mélanome3,4. MCPyV possède un génome circulaire de ~ 5 kb1,5 , coupée en deux par une région régulatrice non codantes (RRRNC) en début et fin de codage régions1. Le RRRNC contient l’origine virale de la réplication (Ori) et promoteurs bidirectionnel pour transcription virale6,7. La région début encode les protéines de l’antigène tumoral grand T (LT), petit T (sT), 57kT, alternative LT ORF (ALTO), ainsi qu’une autorégulation miRNA1,8,9,10. La région fin encode les protéines de la capside VP1 et VP211,12,13. LT et sT sont les protéines de MCPyV mieux étudiés et auraient dû être divulgués à l’appui de la réplication de l’ADN virale et tumorigenèse induite par le MCPyV5. L’intégration clonale de MCPyV ADN dans le génome hôte, qui a été observée chez 80 % de CCM, est probablement un facteur causal pour séropositifs au virus de tumeur développement14,15.

L’incidence de la MCC a triplé sur les dernières vingt années16. Infection asymptomatique de MCPyV est également répandue dans la population générale17,18,19. Avec le nombre croissant de diagnostic de la CMC et la forte prévalence de l’infection à MCPyV, il est nécessaire d’améliorer notre compréhension du virus et son potentiel oncogène. Cependant, beaucoup d’aspects de la biologie de la MCPyV et mécanismes oncogènes demeure mal compris20. C’est en grande partie parce que les MCPyV se reproduit mal dans cellulaires établies lignes11,12,21,22,23 et, jusqu'à tout récemment, la peau des cellules capables de supporter MCPyV l’infection n’avait pas été découvert22. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV et son interaction avec les cellules hôtes ont été entravés par l’absence de système de culture cellulaire pour propager le virus5.

Nous avons découvert que les fibroblastes dermiques humains primaires (HDFs) isolement d’infection de prépuce humains néonatale soutien robuste MCPyV les deux in vitro et ex vivo24. De cette étude, nous avons créé le premier modèle d’infection de culture cellulaire pour MCPyV24. S’appuyant sur ce système modèle, nous avons montré que l’induction de gènes de matrix métalloprotéinases (MMP) par la voie et autres facteurs de croissance de signalisation WNT/β-caténine stimule l’infection MCPyV. En outre, nous avons constaté que le MEK approuvé par la FDA antagoniste trametinib inhibe efficacement MCPyV infection5,25. De ces études, nous avons aussi établi un ensemble de protocoles pour l’isolement des fibroblastes dermiques humains24,25, préparation des virions de MCPyV11,12, effectuant une infection MCPyV sur fibroblastes dermiques humains 24 , 25 et détecter les protéines MCPyV par IF coloration26. En outre, nous avons adapté l’in situ ADN hybridation réaction en chaîne (HCR) technologie27 pour développer une technique de poissons très sensible (HCR-DNA FISH) pour la détection des MCPyV ADN dans les cellules infectées de la peau humaine. Ces nouvelles méthodes seront utiles pour étudier le cycle infectieux de MCPyV ainsi que la réponse cellulaire à l’infection MCPyV. Les cellules de réservoir hôte naturel qui maintiennent l’infection MCPyV et les cellules qui donnent lieu à des tumeurs MCC demeurent inconnues. Les techniques que nous décrivons dans ce manuscrit pourraient être appliquées afin d’examiner les différents types de cellules humaines d’identifier aussi bien les cellules du réservoir et l’origine des tumeurs MCC. Nos méthodes établies, comme le HCR-ADN poisson, pourraient aussi servir à la détection d’autres virus de tumeur d’ADN et la caractérisation des interactions cellule hôte.

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Protocole

Prépuces néonatales humains proviennent de Penn Skin Disease Research Center. Fibroblastes humains adultes proviennent de peau normale au rebut après la chirurgie. Tous les protocoles ont été approuvés par l’Université de Pennsylvanie Institutional Review Board.

1. isolement des fibroblastes dermiques humains

  1. Utilisez une paire de ciseaux pour couper les tissus gras et sous-cutanée de prépuce néonatal humain et couper l’échantillon de peau en demis ou quarts.
  2. Incuber le tissu dans 5 mL d’a 10 mg/mL II dans du PBS additionné d’antibiotiques-antimycosiques à 4 ° C la nuit.
  3. Dans un récipient stérile de 10 cm, soigneusement séparer l’épiderme les couches dermiques avec une pincette de microdissection.
  4. Transfert du tissu cutané qui en résulte dans un tube conique 15 mL contenant 5 mL de collagénase de 2 mg/mL de type IV dans un milieu sans FBS additionné d’antibiotiques-antimycosiques.
  5. Incuber les échantillons à 37 ° C en 5 % CO2 pendant 4 à 6 h avec agitation périodique suivant jusqu'à ce qu’à quelques agrégats tissulaire macroscopique.
  6. Libérer des cellules individuelles du derme par pipetage vigoureusement et descendre (trituration) dix fois avec une pipette de 10 mL.
  7. Centrifuger à 180 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  8. Plaque des cellules dissociées dans le milieu DMEM additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine à 37 ° C à 5 % de CO2.

2. recombinant MCPyV préparation de virion

  1. Digest 50 µg de plasmide de pR17b (porteur du génome MCPyV) avec 250 U de BamHI-HF dans un volume de 200 µL (4 h à 37 ° C) pour séparer le génome viral de l’épine dorsale du vecteur (Figure 2).
  2. Ajouter 1200 µL de tampon PB (additionné de 10 µL de 3 M NaAc, pH 5,2) dans l’ADN digéré et purifier sur 2 colonnes miniprep à centrifuger (capacité de l’ADN de 20 µg). Éluer le plasmide digéré pR17b de chaque colonne avec 200 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, EDTA 1 mM).
  3. Préparer la réaction de ligature dans un tube à centrifuger 50 mL. Ajouter 400 µL de l’ADN de plasmide purifié de l’étape 2.2, 8,6 mL de tampon de ligase x T4 1.05 et 6 µL de ligase forte concentration T4. Incuber à 16 ° C durant la nuit.
  4. Ajouter 45 mL de tampon PB (additionné de 10 µL de 3 M NaAc, pH 5,2) à la ligature et utiliser une tubulure de vide pour charger à travers 2 colonnes miniprep à centrifuger. Éluer chaque colonne avec 50 µL de tampon TE. S’attendre à un rendement d’environ 30 µg d’ADN.
  5. En fin d’après-midi/soirée, semences 6 x 106 293TT28 cellules dans un 10 cm plat contenant milieu DMEM avec 10 % de sérum de veau foetal, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine sans hygromycine B.
  6. Le lendemain matin, faire en sorte que les cellules sont environ 50 % confluentes. Transfecter avec 66 µL de réactif de transfection (1,1 µL/cm2), 12 µg de MCPyV re-ligaturé isoler l’ADN de R17b de l’étape 2.4, 8,4 µg de ST expression plasmide pMtB et 9,6 µg de LT expression plasmide pADL *29.
  7. Lorsque les cellules transfectées sont presque confluentes, le lendemain, trypsinize les cellules et les transférer sur un plat de 15 cm pour la poursuite de l’expansion.
  8. Éventuellement prendre un petit nombre de cellules 293TT à expansion et effectuer si une coloration pour MCPyV LT (CM2B4) et VP1 (MCV VP1 lapin30) afin de déterminer l’efficacité de transfection. À ce stade, nucléaire signal LT peut-être être visible mais VP1 expression probablement ne sera pas détectable.
  9. Quand le plat 15 cm devient presque anastomosé (habituellement 5-6 jours après la transfection initiale), les cellules de transfert en trois plats de 15 cm. Récolter les cellules de la vaisselle de 15 cm quand ils deviennent presque confluentes et suivent le protocole de récolte des virus ci-dessous.
    Remarque : Effectuez éventuellement contrôle de la qualité si, comme décrit à l’étape 2.8. La plupart des cellules doit être MCPyV LT et VP1 positifs à ce stade.
  10. Pour récolter le virus, trypsinize cellules, tournent à 180 x g pendant 5 min à RT et éliminer le surnageant. Ajouter un volume de granulés cellulaire du SPD-Mg (SPD avec 9,5 mM MgCl2 et 1 x antibiotique-antimycosiques). Ajoutez ensuite le sulfate d’ammonium 25 mM (d’une solution mère de 1 M pH 9) puis 0,5 % X-100 Triton (d’une solution stock de 10 %), 0,1 % Benzonase et 0,1 % d’une DNase ATP-dépendante. Bien mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant la nuit.
  11. Incuber le mélange pendant 15 minutes sur la glace, puis ajouter 0,17 volume de 5 M de NaCl. Mélanger et laisser incuber sur glace pour un autre 15 min. Spin pendant 10 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse de 4 ° C. Si le liquide surnageant n’est pas clair, délicatement inverser le tube et répétez l’étape de rotation. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  12. Resuspendre le culot à l’aide d’un seul volume de SPD additionné de 0,8 M de NaCl et un essorage à nouveau, comme indiqué au point 2.11.
  13. Combiner les surnageants de l’étape 2.11 et 2.12 et faites tourner une fois de plus comme indiqué au point 2.11.
  14. Verser des gradients d’iodixanol dans des tubes de polyallomère à paroi fine 5 mL par sous-jacente (27 %, puis 33 %, puis 39 %) ~0.7 étapes de mL à l’aide d’une seringue de 3 mL muni d’une longue aiguille ou une pipette p1000.
  15. Charge de 3 mL de surnageant clarifié contenant le virus sur le gradient iodixanol préparés.
  16. Tournez pendant 3,5 h à 234 000 x g et 16 ° C dans un rotor SW55ti. Définir l’accélération et décélération à ralentir.
  17. Après ultracentrifugation, recueillir 12 fractions dans les tubes de mastic (chaque fraction est ~ 400 µL).
  18. Analyser les fractions pour la présence du virus en ADN double brin réactif et/ou Western blot pour VP1 (MCV VP1 lapin30). Poule des fractions dégradées avec crête dsDNA et/ou contenu VP1 et caractériser le stock par PCR quantitative pour calculer l' équivalent du génome viral31. Magasin stock virion MCPyV à-80 ° C.

3. infection

  1. Maintenir des fibroblastes dermiques humains primaires en DMEM avec sérum de veau foetal de 10 %, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % L-glutamine. En arrivant à confluence, diviser fibroblastes 1:4 sans rotation vers le bas.
    Remarque : Pour une plus grande efficacité d’infection MCPyV, utiliser des fibroblastes primaires entre 5 et 12 qui se divisent activement au moment de l’électrodéposition de passages.
  2. Pour infecter des fibroblastes dermiques humains, aspirer le milieu et laver les cellules avec le SPD.
  3. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA au plat et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
  4. Vérifier au microscope pour s’assurer que les cellules sont à venir sur le plat.
  5. Ajouter 10 mL de milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF et 3 µM CHIR99021, qui stimulent l’infection MCPyV24, au plat et transvaser la solution de cellules dans un tube de 15 mL.
  6. Tournez en bas les cellules à 180 x g pendant 2 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF et 3µM CHIR99021 à 2-4 x 104 cellules / mL.
  7. Graines de 200 µL de la suspension cellulaire additionnée de 1 mg/mL collagénase de type IV dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Décongeler le stock virion MCPyV sur la glace. Ajouter 109 équivalents de génome viral des virions MCPyV (calculée en étape 2.18) par 1 µL d’iodixanol pour chaque cellules de 2 500 à 5000 infectées.   Appuyez doucement sur le côté de la plaque et placer la plaque dans l’incubateur.
  8. Après incubation à 37 ° C en 5 % CO2 pendant 48 à 72 heures, ajouter 20 % FBS dans chaque puits.
  9. Permettre l’infection de procéder à 37 ° C en 5 % CO2 pendant les 72-96 h.

4. immunofluorescence

  1. Difficulté des cellules obtenues à l’étape 3.9 avec 3 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 min.
  2. Laver les cellules avec du PBS.
  3. Incuber les cellules dans un tampon bloquant/perméabilisation (0,5 % X-100 Triton, 3 % de BSA dans du PBS filtrés par l’intermédiaire de 0,22 µm filtre) à ta pendant 1 h.
  4. Incuber les cellules avec les anticorps primaires suivantes : anticorps monoclonal anti-MCPyV LT (CM2B4) de la souris (1 : 1000) et anticorps de VP1 polyclonaux anti-MCPyV de lapin (1 : 2000), à la droite pendant 3 h.
  5. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  6. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaires : Fluor 594 chèvre anti-souris IgG (1 : 1000) et de Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (1/500) à la droite pendant 1 h.
  7. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  8. Contre-coloration les cellules avec 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate).
  9. Lamelles de Mont sur verre glisse et analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé.

5. In situ ADN-HCR

NOTE : Cette technique requiert que les cellules être ensemencé sur lamelles couvre-objet. À cette fin, les conditions d’infection décrites ci-dessus (étape 3) peuvent être transposées au format plaque 24 puits.

  1. Difficulté des cellules cultivées sur des lamelles couvre-objet avec 4 % PFA dans du PBS pour 10 min. Lavez les lamelles deux fois avec du PBS, puis traiter avec éthanol à 70 % pour permeabilize les cellules à 4 ° C durant la nuit.
    Remarque : Les échantillons fixes peuvent rester dans cet état pendant plusieurs jours.
  2. Hybrider les échantillons en remplaçant l’éthanol avec tampon d’hybridation de sonde et en incubant pendant 60 min à température ambiante.
  3. Diluer les sondes (1 µM) (tableau 1) dans l’hybridation de la sonde solution tampon à dilution 1/500 30 min avant la fin de l’étape de pré hybridation et incuber à 45 ° C.
  4. À la fin de l’incubation, distribuer ~ 10 μL de la mélange de sonde dilué par lamelle sur lames de microscope. Place les lamelles, cellule-vers le bas, sur leurs gouttelettes respectifs de sonde d’hybridation se mélangent. Sceller les bords et dos les lamelles pour les diapositives avec une libérale quantité de ciment de caoutchouc.
  5. Faire chauffer les diapositives avec sondes ajoutés à 94 ° C pendant 3 min en définissant les diapositives sur le côté plat d’un bloc chauffant. Transférer les lames à une chambre humidifiée et incuber à 45 ° C durant la nuit. Pour faire une simple chambre humidifiée, Humectez un peu d’essuie-tout stérile avec dH2O et le placer dans le fond d’un récipient en plastique qui scelle avec un joint en caoutchouc.
    Remarque : Le ciment de caoutchouc de chauffage peut brièvement bubble. Cependant, assurez-vous que le joint ne se brise pas.
  6. Avec précaution, décollez le ciment de caoutchouc avec une pince et placez le couvre-objet cellule-côté dos dans des puits d’une plaque 24 puits. Laver les lamelles couvre-objet avec tampon de lavage sonde à ta trois fois.
  7. Incuber le couvre-objet dans le tampon d’amplification (200 µL en plaques 24 puits) à ta 30-60 min.
  8. Pendant ce temps, recuire chacune des deux épingles à cheveux oligonucléotide marqué reconnaissant les sondes (tableau 1) dans des tubes distincts de PCR par chauffage à 94 ° C pendant 90 s et refroidissement à RT pendant 30 min, tout en protégeant de la lumière. Mélanger les deux épingles à cheveux dans le tampon d’amplification, chacun à une dilution de 01:50.
  9. Rendre une surface pour la réaction d’amplification en étirant le film de paraffine sur la face ouverte d’un couvercle de plaque 24 puits. Pipetter gouttes de 50-100 µL du mélange tampon en épingle à cheveux/amplification sur le film de paraffine pour chaque lamelle couvre-objet. Forceps permet de retirer délicatement les lamelles de la solution de pré-amplification. Sécher la lamelle couvre-objet en touchant le bord d’une lingette jetable poreux et placez le côté cellule sur la goutte de l’amplification.
  10. Placez le couvercle de plaque tenant les lamelles dans une chambre humidifiée et incuber une nuit à ta dans l’obscurité.
  11. Retournez les lamelles à puits une fois de plus. Incuber les échantillons avec 5 x SSCT [5 x chlorure de sodium citrate de sodium (SSC) 0,1 % Tween 20 filtré par un filtre de 0,22 µm] contenant 0,5 µg/mL DAPI pendant 1 h à température ambiante. laver les échantillons deux fois avec 5 x SSCT à température ambiante.
  12. Monter les lamelles sur lames de microscope. Analyser les cellules et les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé l’image.

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Résultats

Le protocole décrit dans ce manuscrit a permis l’isolement d’une population presque homogène du HDFs (Figure 1). Tel que démontré par immunofluorescence, presque 100 % des cellules dermiques humains isolés utilisant les conditions décrites dans le présent protocole ont été positivement colorées pour les marqueurs des fibroblastes dermiques, vimentine et collagène j’ai24, mais négatif pour l’homme marqueur de kérati...

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Discussion

Les méthodes décrites ci-dessus, y compris l’isolement des fibroblastes dermiques de tissus de la peau humaine, la préparation des virions de MCPyV recombinantes, l’infection de cellules cultivées, immunofluorescence et une méthode sensible de poisson adapté de la technologie HCR, qui devrait permettre aux chercheurs d’analyser MCPyV infection27. Une des étapes plus critiques pour atteindre MCPyV infection in vitro est la production de préparations de haut-titre virion. Utilisant le ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiens à remercier le Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) et Dr M. Celeste Simon (Université de Pennsylvanie) pour la fourniture de réactifs et support technique. Nous remercions également les membres de nos laboratoires de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions (R01CA187718, R01CA148768 et R01CA142723), la subvention d’appui NCI Cancer Center (NCI P30 CA016520) et le prix Penn CFAR (P30 Ia 045008).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

Références

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