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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l'infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l'ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.

Abstract

Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l'esecuzione e la rilevazione dell'infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l'isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell'infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L'approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.

Introduzione

Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni1. Il NCRR contiene l'origine virale della replica (Ori) e promotori di bidirezionale per trascrizione virale6,7. La regione precoce codifica proteine antigene tumore chiamati grande T (LT), piccolo T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), come pure un autoregulatory miRNA1,8,9,10. La regione tarda codifica per le proteine del capside VP1 e VP211,12,13. LT e sT sono le proteine di MCPyV meglio studiate e sono stati indicati per sostenere la replicazione del DNA virale e tumorigenesis indotto MCPyV5. Integrazione clonale di MCPyV DNA nel genoma ospite, che è stato osservato in fino a 80% di MCCs, è probabilmente un fattore causale per tumore virus-positivo sviluppo14,15.

L'incidenza di MCC è triplicato sopra i venti anni ultimi16. MCPyV l'infezione asintomatica è diffuso nella popolazione generale17,18,19. Con il crescente numero di diagnosi MCC e l'alta prevalenza dell'infezione di MCPyV, c'è la necessità di migliorare la nostra comprensione del virus e la sua potenziale oncogeno. Tuttavia, molti aspetti della biologia di MCPyV e meccanismi oncogenici rimangono capita male20. Questo è in gran parte perché MCPyV replica scarsamente cellulari stabilizzate linee11,12,21,22,23 e, fino a poco tempo, in grado di supportare MCPyV le cellule della pelle infezione non era stati individuati22. Gli studi meccanicistici per investigare completamente MCPyV e la sua interazione con cellule dell'ospite sono stati ostacolati dalla mancanza di sistema di coltura cellulare per propagare il virus5.

Abbiamo scoperto che fibroblasti cutanei umani primari (HDFs) isolato da infezione di prepuzio umano neonatale supporto robusto MCPyV entrambi in vitro ed ex vivo24. Da questo studio, abbiamo stabilito il primo modello di infezione di coltura cellulare per MCPyV24. Sulla base di questo sistema di modello, abbiamo mostrato che l'induzione di geni metalloproteasi (MMP) matrice di WNT/β-catenin signaling pathway e altri fattori di crescita stimola l'infezione MCPyV. Inoltre, abbiamo trovato che la nuova antagonista MEK approvato dalla FDA inibisce efficacemente l'infezione MCPyV5,25. Da questi studi, abbiamo anche stabilito una serie di protocolli per l'isolamento di fibroblasti cutanei umani24,25, preparando MCPyV virioni11,12, eseguendo MCPyV infezione su fibroblasti cutanei umani 24 , rilevazione MCPyV proteine di IF colorazione26e 25 . Inoltre, ci siamo adattati in situ del DNA ibridazione reazione a catena (HCR) tecnologia27 per sviluppare una tecnica altamente sensibile di pesce (pesce HCR-DNA) per la rilevazione del DNA di MCPyV in cellule epiteliali umane infettate. Questi nuovi metodi sarà utili per lo studio del ciclo infettivo di MCPyV, come pure la risposta cellulare all'infezione MCPyV. Le cellule di serbatoio ospite naturale che mantengono l'infezione MCPyV e le cellule che danno origine a tumori MCC rimangono sconosciute. Le tecniche che descriviamo in questo manoscritto potrebbero essere applicate per esaminare vari tipi di cellule umane di identificare sia le cellule del serbatoio e l'origine dei tumori MCC. I nostri metodi consolidati, come il pesce HCR-DNA, potrebbero essere impiegati anche nel rilevamento di altri virus oncogeni a DNA e la caratterizzazione delle interazioni delle cellule ospite.

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Protocollo

Prepuzi neonatale umane sono stati ottenuti da Penn pelle malattia Research Center. Fibroblasti umani adulti sono stati ottenuti da pelle normale scartata dopo la chirurgia. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Università della Pennsylvania Institutional Review Board.

1. isolamento dei fibroblasti cutanei umani

  1. Utilizzare un paio di forbici per tagliare il grasso e del tessuto sottocutaneo dal prepuzio umano neonatale e tagliare il campione di pelle in metà o in quarti.
  2. Incubare il tessuto in 5 mL di dispase 10mg/mL II in PBS completati con antibiotico antimicotico a 4 ° C durante la notte.
  3. In un piatto sterile 10cm, separare con cura l'epidermide dagli strati cutanei mediante microdissezione forcipe.
  4. Trasferimento il tessuto cutaneo risultante in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di collagenasi di 2 mg/mL tipo IV in FBS-libero supplementato con antibiotico antimicotico.
  5. Incubare il campione a 37 ° C in 5% CO2 per 4-6 h con agitazione periodica fino a quando rimangono solo pochi aggregati macroscopici del tessuto.
  6. Rilasciare singole cellule dal derma pipettando su e giù (triturazione) vigorosamente dieci volte con una pipetta da 10 mL.
  7. Centrifugare a 180 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  8. Piastra le cellule dissociate in medium DMEM completate con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina a 37 ° C in 5% CO2.

2. preparazione di virion ricombinante MCPyV

  1. Digest 50 µ g di plasmide pR17b (che trasportano MCPyV genoma) con 250 U di BamHI-HF in un volume di 200 µ l (4 h a 37 ° C) per separare il genoma virale dalla spina dorsale vettoriale (Figura 2).
  2. Aggiungere 1200 µ l di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) al DNA digerito e purificare oltre 2 colonne di spin miniprep (capacità del DNA di 20 µ g). Eluire il plasmide pR17b digeriti da ogni colonna con 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Preparare la reazione di legatura in una provetta da centrifuga 50 mL. Aggiungere 400 µ l di DNA plasmidico purificato dal passaggio 2.2, 8,6 mL di tampone di ligasi x T4 1.05 e 6 µ l della ligasi di alta concentrazione di T4. Incubare a 16 ° C durante la notte.
  4. Aggiungere 45 mL di tampone PB (supplementato con 10 µ l di 3 M Pierantonio, pH 5.2) per la legatura e utilizzare un collettore ad aspirazione per caricare attraverso 2 colonne di spin miniprep. Eluire ogni colonna con 50 µ l di buffer di TE. Aspettatevi una resa di circa 30 µ g di DNA.
  5. Nel tardo pomeriggio/sera, cellule di seme 6 x 106 293TT28 in 10 cm piatto contenente DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina senza igromicina B.
  6. La mattina successiva, assicurarsi che le celle sono circa il 50% confluenti. Transfect utilizzando 66 µ l di reagente di transfezione (1,1 µ l/cm2), 12 µ g di re-legato MCPyV isolare R17b DNA dal punto 2.4, 8,4 µ g di ST espressione plasmide pMtB e 9,6 µ g di LT espressione plasmide pADL *29.
  7. Quando le cellule transfettate sono quasi confluenti, il giorno seguente, tripsinizzano le cellule e trasferirli su un piatto di 15 cm per la continua espansione.
  8. Eventualmente prendere un piccolo numero di cellule 293TT all'espansione ed eseguire se macchiatura per MCPyV LT (CM2B4) e VP1 (MCV VP1 coniglio30) per determinare l'efficienza di trasfezione. In questa fase, nucleare LT segnale potrebbe essere visibile, ma espressione di VP1 probabilmente non sarà rilevabile.
  9. Quando il piatto di 15cm diventa quasi confluenti (solitamente 5-6 giorni dopo trasfezione iniziale), trasferire le cellule in tre piatti di 15 cm. Raccogliere le cellule dai piatti 15cm quando diventano quasi confluenti e seguire il protocollo di raccolta virus qui sotto.
    Nota: Facoltativamente eseguire il controllo di qualità se come descritto al punto 2.8. La maggior parte delle cellule dovrebbe essere MCPyV LT sia VP1 positivo in questa fase.
  10. Per raccogliere il virus, tripsinizzano cellule, gira a 180 x g per 5 min a RT e rimuovere il surnatante. Aggiungere un volume di pellet cellulare di DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM MgCl2 e 1 x antibiotico antimicotico). Quindi aggiungere solfato di ammonio di 25 mM (da una soluzione madre 1 M a pH 9) seguita da 0,5% Triton X-100 (da una soluzione madre 10%), 0,1% Benzonase e 0,1% di una dnasi ATP-dipendente. Mescolare bene e incubare a 37 ° C durante la notte.
  11. Incubare la miscela per 15 min sul ghiaccio e poi aggiungere 0.17 volume di 5 M di NaCl. Miscelare e incubare in ghiaccio per un altro 15 min Spin per 10 min a 12.000 x g in una centrifuga di 4 ° C. Se non è chiaro il supernatante, delicatamente capovolgere la provetta e ripetere il passaggio di filatura. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  12. Risospendere il pellet utilizzando un volume di DPBS completati con 0,8 M di NaCl e spin di nuovo, come descritto al punto 2.11.
  13. Combinare i surnatanti dal passo 2.11 e 2.12 e girare ancora una volta come descritto al punto 2.11.
  14. Via sottostante (27%, quindi 33%, quindi 39%) pour pendenze di iodixanol in tubi a parete sottile 5ml polyallomer ~0.7 passaggi di mL utilizzando una siringa da 3 mL muniti di un lungo ago o una pipetta p1000.
  15. Caricare 3 mL di surnatante chiarificato contenenti virus sul gradiente iodixanol preparati.
  16. Spin per 3,5 h a 234.000 x g e a 16 ° C in un rotore di SW55ti. Impostare l'accelerazione e la decelerazione per rallentare.
  17. Dopo ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in tubi siliconati (ogni frazione è ~ 400 µ l).
  18. Analizzare le frazioni per la presenza di virus dsDNA reagente e/o Western blot per VP1 (MCV VP1 coniglio30). Piscina gradiente frazioni con picco dsDNA e/o contenuti di VP1 e caratterizzano lo stock mediante PCR quantitativa per calcolare l' equivalente del genoma virale31. Negozio di stock di virion di MCPyV a-80 ° C.

3. infezione

  1. Mantenere i fibroblasti cutanei umani primari in DMEM con 10% siero fetale del vitello, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% L-glutammina. Una volta raggiunta la confluenza, split fibroblasti 1:4 senza rotazione verso il basso.
    Nota: Per la massima efficienza di infezione MCPyV, utilizzare fibroblasti primari tra passaggi 5 e 12 che si dividono attivamente al momento della placcatura.
  2. Per infettare i fibroblasti cutanei umani, il mezzo di aspirare e lavare le cellule con DPBS.
  3. Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA al piatto e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
  4. Verifica sotto il microscopio per assicurarsi che le celle sono venuta fuori il piatto.
  5. Aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12 contenente 20 ng/mL EGF, bFGF di 20 ng/mL e 3 µM CHIR99021, i quali stimolano l'infezione MCPyV24, al piatto e trasferire la soluzione di cella in una provetta da 15 mL.
  6. Rotazione verso il basso le cellule a 180 x g per 2 min e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in DMEM/F12 medium contenente 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF e 3 µm CHIR99021 a 2-4 x 104 cellule per mL.
  7. Semi di 200 µ l della sospensione delle cellule completata con tipo di 1mg/mL collagenasi IV in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Scongelare il magazzino virione MCPyV su ghiaccio. Aggiungere 109 equivalenti di genoma virale dei virions MCPyV (calcolato nel passaggio 2.18) a 1 µ l di iodixanol per ogni 2.500 a 5000 cellule essere infettati.   Toccare delicatamente il lato della piastra e posizionare la piastra nell'incubatore.
  8. Dopo incubazione a 37 ° C in 5% CO2 per 48-72 h, aggiungere 20% FBS in ciascun pozzetto.
  9. Permettere che l'infezione di procedere a 37 ° C in 5% CO2 per 72-96 h.

4. immunofluorescenza colorazione

  1. Difficoltà cellule ottenute nel passaggio 3.9 con paraformaldeide 3% in PBS per 20 min.
  2. Lavare le cellule con PBS due volte.
  3. Incubare le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,5% Triton X-100, 3% BSA in PBS filtrata attraverso 0,22 µm) a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari: mouse monoclonale anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) e anticorpo policlonale anti-MCPyV (1: 2000), VP1 di coniglio al RT per 3 h.
  5. Lavare le cellule con PBS tre volte.
  6. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari: 594 Fluor anti-topo di capra IgG (1: 1000) e Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.
  7. Lavare le cellule con PBS tre volte.
  8. Colorante di contrasto le cellule con 0,5 µ g/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato).
  9. Vetrini coprioggetto di montaggio su vetro scivola e analizzare utilizzando un microscopio di fluorescenza invertito.

5. In situ del DNA-HCR

Nota: Questa tecnica richiede che le cellule seminate su vetrini coprioggetti. Per questo scopo, le condizioni di infezione descritte sopra (passaggio 3) possono essere scalate al formato piastra a 24 pozzetti.

  1. Difficoltà cellule coltivate sulle lamelle con 4% PFA in PBS per 10 min. lavare i vetrini coprioggetti due volte con PBS, poi trattarli con etanolo al 70% per permeabilize le cellule a 4 ° C durante la notte.
    Nota: I campioni fissati possono rimanere in questo stato per diversi giorni.
  2. Pre-ibridare campioni sostituendo l'etanolo con tampone di ibridazione della sonda e incubare per 60 minuti a TA.
  3. Diluire il sonde (1 µM) (tabella 1) ibridazione della sonda in soluzione tampone diluizione 1: 500 30 min prima della fine della fase di pre-ibridazione e incubare a 45 ° C.
  4. Alla fine delle incubazioni, Pipettare ~ 10 μL del mix di sonde diluito per coprire i vetrini su vetrini da microscopio. Posto i coprioggetti, cella-lato verso il basso, il loro rispettive goccioline della sonda di ibridazione mescolare. Sigillare i bordi e le parti posteriori delle lamelle per le diapositive con una quantità generosa di cemento di gomma.
  5. Impostando le diapositive sul lato piatto di un blocco di calore di calore le diapositive con le sonde aggiunto a 94 ° C per 3 min. Trasferire i vetrini in una camera umidificata e incubare a 45 ° C durante la notte. Per rendere una semplice camera umidificata, inumidire leggermente i tovaglioli di carta sterile con dH2O e posto nella parte inferiore di un contenitore di plastica che sigilla con una guarnizione in gomma.
    Nota: Durante il riscaldamento il cemento di gomma può bolla brevemente. Tuttavia, assicurarsi che la guarnizione non si rompe.
  6. Attentamente staccarsi il cemento di gomma con il forcipe e posizionare il coprioggetti cella-lato posteriore nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Lavare i vetrini coprioggetti con tampone di lavaggio di sonda a RT tre volte.
  7. Incubare il vetrino coprioggetto nel buffer da amplificazione (200 µ l in piastre da 24 pozzetti) RT 30-60 min.
  8. Nel frattempo, tempri ciascuno dei due tornanti del oligonucleotide con etichetta riconoscendo le sonde (tabella 1) in provette PCR separate da riscaldamento a 94 ° C per 90 s e raffreddamento a RT per 30 min, proteggendo dalla luce. Mescolare le due forcine nel buffer di amplificazione, ciascuno ad una diluizione di 01:50.
  9. Fare una superficie per la reazione di amplificazione da stretching paraffina pellicola sopra il viso aperto di un coperchio piastra a 24 pozzetti. Pipettare 50-100 µ l gocce della miscela tampone tornante/amplificazione sulla pellicola paraffina per ogni vetrino coprioggetti. Utilizzare pinze per rimuovere con attenzione il coprioggetto dalla soluzione di pre-amplificazione. Asciugare il vetrino coprioggetto toccando il bordo di un panno monouso poroso e fissarlo cella-lato giù alla goccia di amplificazione.
  10. Posizionare il coperchio della piastra che tiene i coprioggetti in una camera umidificata e incubare per una notte a temperatura ambiente al buio.
  11. Tornare i coprioggetti pozzi ancora una volta. Incubare i campioni con 5 x SSCT [5x di cloruro di sodio citrato di sodio (SSC) 0.1% Tween 20 filtrata attraverso un filtro da 0,22 µm] contenente 0,5 µ g/mL DAPI per 1 h a TA. lavare due volte con 5 i campioni x SSCT a TA.
  12. Montare i vetrini coprioggetti su vetrini da microscopio. Analizzare le cellule e i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito di immagine.

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Risultati

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha permesso l'isolamento di una popolazione quasi omogenea di HDFs (Figura 1). Come dimostrato dalla macchiatura immunofluorescente, quasi il 100% di cellule cutanee umane isolate utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo sono state positivamente macchiato per gli indicatori dei fibroblasti cutanei, il vimentin e collagene sono24, ma la negazione per l'essere umano marcatore ...

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Discussione

I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione27. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) e Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) per la fornitura di reagenti e supporto tecnico. Ringraziamo anche i membri dei nostri laboratori di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato dalle borse di studio del National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), il NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) e il premio di Penn CFAR (P30 AI 045008).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

Riferimenti

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