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要約

ここでは、MCPyV とプライマリひと皮膚繊維芽細胞に感染するプロトコルを提案します。プロトコルには、in situ ハイブリダイゼーションの真皮線維芽細胞の単離、MCPyV ウイルス粒子やウイルス感染、免疫蛍光染色、蛍光の準備が含まれています。このプロトコルは、MCPyV によって MCPyV ホストの相互作用の特性や他の細胞型の感染の発見に拡張できます。

要約

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) の感染は、メルケル細胞腫 (MCC)、皮膚癌の非常に積極的なフォームにつながります。MCPyV 分子生物学と発癌のメカニズムを完全に調査する機械論的研究は、適切な細胞培養モデルの欠如によって妨げられています。ここでは、一連の実行および主要な人間の皮膚細胞の MCPyV 感染症を検出するためのプロトコルについて述べる。プロトコル (IF) な免疫蛍光染色、原の DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR)、非常に敏感である組換え MCPyV 粒子の作製とウイルス感染症の検出ひと真皮線維芽細胞の隔離を記述します。現場の交配 (魚) のアプローチで蛍光します。本プロトコルは、他のセルタイプまたはサポート MCPyV 感染細胞を識別するために興味がある研究者によって合わせることができます。説明魚アプローチは、また、ウイルス Dna 感染したひと皮膚に存在の低レベルを検出するため適応でした。

概要

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) は、稀だが攻撃的な皮膚癌、メルケル細胞癌 (MCC)1,2に関連付けられている小さな、二本鎖 DNA ウイルスです。クライアントは、約 33% の死亡率は、悪性黒色腫3,4を超えています。MCPyV は、初期および後期地域1のコーディングに非コーディングの規制地域 (傘下) によって二等分される 〜 5 kb1,5の円形ゲノム。傘下には、ウイルスの起源レプリケーション (Ori) とウイルスの転写6、7のための双方向性プロモーターが含まれています。初期の地域型 miRNA1,8,9,10と同様、大きい T (LT)、小さい T (sT)、57kT、代替 LT ORF (アルト) と呼ばれる腫瘍抗原タンパク質をエンコードします。後半の地域は、カプシド タンパク質 VP1 と VP211,12,13をエンコードします。LT、sT 最高研究 MCPyV 蛋白質は、ウイルスの DNA 複製と MCPyV 誘発消化管腫瘍5をサポートするために示されています。MCCs の 80% までで観察されている、ホストのゲノムに MCPyV DNA のクローンの統合可能性がウイルス陽性腫瘍開発14,15の原因因子です。

MCC の発生率は、過去 20 年16に三倍になった。MCPyV 感染の無症候性も一般的な人口17,18,19の普及です。クライアント診断数の増加と MCPyV 感染の高い有病率、ウィルスとその発癌性潜在性の私達の理解を改善する必要があります。ただし、MCPyV 生物学および発癌のメカニズムの多くの側面は、ほとんど理解20を保ちます。これは主な理由は MCPyV は悪い細胞ライン11,12,21,22,23複製し、最近まで、皮膚細胞の MCPyV をサポート感染症では、発見された22はされていませんでした。完全に MCPyV と宿主細胞との相互作用を調査する機構の研究は、ウイルス5を伝播するための細胞培養系の欠如によって妨げられています。

プライマリひと真皮線維芽細胞 (HDFs) が両方生体外で人間の新生児包皮サポート堅牢な MCPyV 感染に由来がわかりましたと前のヴィヴォ24。本研究からは、MCPyV24の最初の細胞培養感染モデルを確立しました。このモデル システム上に構築された、WNT/β-カテニン シグナル伝達経路と他の成長因子によるマトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) 遺伝子の誘導が MCPyV 感染症を刺激することを示した.さらに、FDA 承認 MEK 拮抗薬 trametinib が MCPyV 感染症5,25を効果的に阻害することがわかった。これらの研究から我々 も策定してひと真皮線維芽細胞24,25を分離するためのプロトコルの準備 MCPyV 粒子11,12、ひと皮膚線維芽細胞の MCPyV 感染を実行します。24,25と場合染色26検出 MCPyV 蛋白質。さらに、我々 は、その場で DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR) 技術27感染したヒトの皮膚細胞の MCPyV DNA を検出する高感度の魚の技術 (HCR DNA 魚) を開発する適応。これらの新しいメソッドは MCPyV 感染に対する細胞の応答と同様、MCPyV の感染サイクルの勉強の役に立つでしょう。MCPyV 感染を維持する自然なホスト貯留層細胞と MCC 腫瘍を生じさせる細胞は不明のまま。本稿で述べる技術は、貯留層細胞を識別するためにひと細胞の様々 な種類と MCC 腫瘍の起源を調べるに適用でした。HCR DNA 魚など、方法を確立は、他の DNA の腫瘍ウイルスの検出、ホスト細胞相互作用の評価にも用いることが。

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プロトコル

人間の新生児の包皮は、ペン皮膚病研究センターから得られました。大人ひと線維芽細胞は、手術後破棄された正常な皮膚から得られました。すべてのプロトコルは、ペンシルベニア州制度検討委員会の大学によって承認されました。

1. ひと真皮線維芽細胞の単離

  1. 人間の新生児の包皮から脂肪と皮下組織を切り落とすし、半分または四半期に肌サンプルをカットするはさみのペアを使用します。
  2. 10 mg/mL 当期抗生物質抗真菌薬を添加した PBS で II の 5 mL の組織を孵化させなさい 4 ° C で一晩します。
  3. 滅菌 10 cm 皿に慎重に、レーザーマイクロダイ セクション鉗子を使用して真皮層から表皮を分離します。
  4. 転送 2 mg/mL コラゲナーゼの 5 mL を含む 15 mL の円錐管に生じる皮膚の組織が抗生物質抗真菌薬と FBS 無料培に IV を入力します。
  5. ちょうどいくつかのマクロ組織集計になるまで定期的な揺れで 4-6 時間 5% CO2の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  6. 10 mL のピペットで精力的に 10 回 (triturating) 上下ピペッティングによる単一細胞真皮からを解放します。
  7. 180 x gで 5 分で遠心し、上清を捨てます。
  8. 1%、1% 非本質的なアミノ酸、10% ウシ胎仔血清添加 DMEM 培地で解離細胞をプレート L-グルタミン 5% CO2の 37 ° C で。

2. 遺伝子組換え MCPyV ウイルス粒子の調製

  1. 250 pR17b プラスミド (MCPyV ゲノムを運ぶ) のダイジェスト 50 μ g 病原 U - 200 μ L のボリューム (37 ° C で 4 h) で HF ベクター バックボーン (図 2) からウイルスの遺伝子を分離します。
  2. 消化の dna (3 M NaAc、pH が 5.2 の 10 μ L を添加した) バッファー PB の 1200 μ l 添加し以上 2 miniprep スピン列 (20 μ g DNA 容量) を浄化します。TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA) の 200 μ L の各列から消化 pR17b プラスミドを溶出します。
  3. 50 mL の遠心管中の ligation の反作用を準備します。ステップ 2.2、1.05 x T4 リガーゼ バッファーの 8.6 mL と高濃度 T4 リガーゼの 6 μ L から精製プラスミド DNA の 400 μ L を追加します。16 ° C で一晩インキュベートします。
  4. 45 mL のバッファー (3 M NaAc、pH が 5.2 の 10 μ L を添加した) PB を結紮に追加し、2 miniprep スピン列を読み込む真空マニホールドを使用します。50 μ L の TE バッファーの各列を溶出します。約 30 μ g の DNA の収量を期待してください。
  5. 午後/夜、遅くにシード 6 x 106 293TT28セル 10 cm 皿 1%、1% 非必須アミノ酸, 10% 牛胎児血清を含む DMEM 培 hygromycin b. せず L-グルタミン
  6. 次の朝、セルが約 50% であることを確認合流。トランスフェクション試薬 (1.1 μ L/cm2) の 66 μ L を使用して transfect、結紮再 MCPyV の 12 μ g がステップ 2.4、ST 式プラスミド pMtB の 8.4 μ g と LT 発現プラスミド pADL *29の 9.6 μ g から R17b DNA を隔離します。
  7. Transfected セルが次の日ほぼ合流、セルを trypsinize し、継続的な拡大のために 15 cm 皿に転送。
  8. 必要に応じて拡張 293TT 細胞の数が少ないを取り出して MCPyV LT (CM2B4) の染色する場合実行と VP1 トランスフェクション効率を決定するのには、(MCV VP1 ウサギ30)。この段階で核の LT 信号表示がありますが、VP1 式おそらく検出されません。
  9. 約 15 センチメートルの皿が変わったら合流 (初期トランスフェクション後通常 5-6 日) 15 cm 3品にセルを転送します。ほぼ合流なり以下のウイルスの収穫のプロトコルに従うときは、15 cm のお皿から細胞を採取します。
    注: 必要に応じて 2.8 の手順で説明したよう場合品質管理を行います。MCPyV LT と VP1 のこの段階では肯定的な細胞のほとんどがする必要があります。
  10. ウイルスを収穫、細胞を trypsinize、常温 5 分 180 x gでスピン、上澄みを削除します。DPBS Mg (9.5 mM MgCl2と 1 x 抗生物質抗真菌薬 DPBS) の 1 つの細胞ペレット ボリュームを追加します。25 mM アンモニウムの硫酸塩 (1 M pH 9 原液) から続く 0.5% トリトン X-100 (から 10% 在庫ソリューション)、追加 0.1 %benzonase と ATP 依存した DNase の 0.1%。よく混合し、37 ° C で一晩インキュベートします。
  11. 氷で 15 分間混合物をインキュベートし、5 M の NaCl の 0.17 ボリュームを追加します。ミックスし、4 ° C、遠心分離機で 12,000 × gで 10 分別 15 分スピンの氷の上を孵化させなさい。上澄みが明確でない場合軽くチューブを反転し、回転の手順を繰り返します。上清を新しいチューブに転送します。
  12. 2.11 の手順で説明されているように DPBS 0.8 M の NaCl とスピンで再度、補足の 1 つのボリュームを使用してペレットを再懸濁します。
  13. 2.11、2.12 のステップから培養上清を組み合わせて、2.11 手順で説明した 1 つのより多くの時間をスピンします。
  14. アンダーレイ (27%、33%、39%) によって薄壁 5 mL polyallomer 管内 iodixanol の勾配を注ぐ ~0.7 mL 手順 3 mL シリンジを使用して長い針や p1000 ピペットを装備。
  15. 準備 iodixanol の勾配に明らかにウイルスを含む上清の 3 mL をロードします。
  16. 3.5 h 234,000 x gで SW55ti ローターに 16 ° C の回しなさい。加速と減速する減速を設定します。
  17. 遠心後、シリコーン チューブ (各画分は ~ 400 μ L) で 12 分画を収集します。
  18. DsDNA 試薬および/または VP1 の西部のしみのウイルスの存在の分数を分析 (MCV VP1 ウサギ30)。プール グラデーション画ピーク dsDNA や VP1 の内容し、ウイルスのゲノム等価31を計算する定量的 PCR による株式を特徴付けます。MCPyV ウイルス粒子株式-80 ° C で保存します。

3. 感染症

  1. 維持主真皮線維芽細胞 DMEM で 1%、1% 非必須アミノ酸 10% ウシ胎仔血清 L-グルタミン。合流点に達したら、線維芽細胞 1:4 ダウン スピンアップせずに分割します。
    注: 最高の MCPyV 感染効率通路 5 と 12 がメッキの時に積極的に分裂している間主要な線維芽細胞を使用します。
  2. ひと真皮線維芽細胞を感染するには、培地を吸引し、DPBS とセルを洗ってください。
  3. 0.05 %1 mL を加えてトリプシン-EDTA 皿に 5-10 分の 37 ° C で孵化させなさいと。
  4. セルが料理から来ていることを確認する顕微鏡下で確認してください。
  5. 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF と 3 μ M を含む DMEM/F12 培地 10 mL を追加 CHIR99021、すべての MCPyV 感染24、料理を刺激し、携帯ソリューションを 15 mL チューブに移します。
  6. スピン ・ ダウン、2 分間 180 x gでセルと上澄みを廃棄します。20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF 3 μ m を含む DMEM/F12 培地で細胞を再懸濁します 2-4 x の 1 mL あたり 10 の4セルで CHIR99021。
  7. 96 ウェル プレートの各ウェルに 1 mg/mL コラゲナーゼ タイプ IV を添加した細胞懸濁液 200 μ L をシードします。氷の上の MCPyV ウイルス粒子株式を解凍します。MCPyV ウイルス粒子 (2.18 で計算されるステップ) に感染する各 2,500 に 5000 セルの iodixanol の 1 μ L あたり 109ウイルスのゲノムに相当を追加します。 プレートの側面を軽くし、インキュベーターでプレートを配置。
  8. 48-72 時間 5% CO2の 37 ° C で培養後追加 20% 各ウェルに FBS。
  9. 72 96 h の 5% CO2の 37 ° C で続行する感染を許可します。

4. 蛍光抗体染色

  1. PBS で 20 分間 3% パラホルムアルデヒドで 3.9 の手順で得られたセルを修正します。
  2. PBS のセルを 2 回洗います。
  3. ブロック/透過バッファー内セルを孵化させなさい (0.5% トリトン X-100, 3 %bsa を PBS で 0.22 μ m のフィルターを介してフィルター) 1 h 常温。
  4. 次の一次抗体と細胞を孵化させなさい: マウス モノクローナル抗 MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) とウサギ ポリクローナル抗 MCPyV VP1 抗体 (配分)、常温で 3 時間。
  5. PBS のセルを 3 回洗浄します。
  6. 二次抗体と細胞を孵化させなさい: 蛍光 594 ヤギ抗マウス IgG (1: 1000) と Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG (1: 500) RT で 1 時間。
  7. PBS のセルを 3 回洗浄します。
  8. 0.5 μ g/ml の DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole、二塩酸塩) 細胞を counterstain します。
  9. ガラス マウント coverslips スライドし、倒立蛍光顕微鏡を用いて分析します。

5. その場で DNA HCR

注: この手法は、細胞が coverslips にシードする必要があります。この目的のため (ステップ 3) 上記の感染条件スケール 24 ウェル プレート形式にアップがあります。

  1. セルを修復する 4 %coverslips に培養、PBS で 2 回 10 分洗浄、coverslips PBS で PFA とそれらを扱う一晩 4 ° C でセルを permeabilize 70% エタノール。
    注: 固定サンプルは数日間この状態のまますることができます。
  2. 事前サンプルを交配させるエタノールをプローブの交配バッファーに置き換え、室温 60 分インキュベート
  3. 渦 (1 μ M) を希釈 (表 1) プローブの交配でバッファー溶液 1: 500 希釈前の交配のステップの終わりの前に 30 分でそして 45 ° c. で孵化させなさい
  4. 孵化の終わりには、顕微鏡のスライド coverslip あたり希釈プローブ ミックスの ~ 10 μ L をピペットします。場所 coverslips、ダウン、細胞側交配のプローブの彼らのそれぞれの滴を混ぜます。エッジとゴム系のリベラルな量とスライドに、coverslips の背中をシールします。
  5. ヒート ブロックの平らな面にスライドを設定することによって、94 ° C で 3 分間のプローブ追加スライドを熱します。加湿チャンバーにスライドをコピーして、45 ° C で一晩インキュベートします。シンプルな加湿チャンバーをするためには、dH2O とゴムのガスケットでシール プラスチック容器の底で滅菌ペーパー タオルで軽く湿らせてください。
    注: ゴム セメントを加熱中に簡単にバブルすることができます。ただし、シールが壊れないことを確認します。
  6. 慎重にピンセットでゴム セメントをはがす、24 ウェル プレートのウェルにバックアップ coverslips セル側に配置。3 回 RT でプローブ洗浄バッファーで coverslips を洗浄します。
  7. RT 増幅バッファー (24 ウェル プレートで 200 μ L) の coverslip を孵化させなさい 30-60 分。
  8. 一方、各 90 94 ° C の加熱により個別 PCR チューブにプローブ (表 1) を認識し 2 つの分類されたオリゴヌクレオチド ヘアピンをアニール s と 30 分の RT に冷却効果を光から保護している間。1:50 の希釈でそれぞれ増幅バッファーの 2 つのヘアピンをミックスします。
  9. 24 ウェル プレートの蓋の開いている顔にパラフィン膜の伸張によって増幅反応の表面を作る。各 coverslip のパラフィン フィルム上にヘアピン/増幅バッファー混合物の 50-100 μ L 液滴をピペットします。中古増幅ソリューションから、coverslips を慎重に削除するのに鉗子を使用します。多孔性の使い捨て可能なワイプに端に触れることによって、coverslip を乾燥し、増幅液滴にセル側面を置きなさい。
  10. 加湿チャンバーに、coverslips を保持しているプレートの蓋を置き、暗闇の中 RT 一晩インキュベートします。
  11. 井戸に、coverslips をもう一度戻ります。5 サンプルをインキュベート x SSCT [塩化ナトリウム クエン酸ナトリウム (SSC) 0.1 %0.22 μ m フィルターでろ過しトゥイーン 20 × 5] 5 で 2 回サンプルを洗って室温 1 時間 0.5 μ g/mL DAPI を含む室温 x SSCT
  12. 顕微鏡のスライド、coverslips をマウントします。細胞を分析し、倒立蛍光顕微鏡によるサンプル画像します。

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結果

本稿で説明されたプロトコルは、HDFs (図 1) のほぼ同種の人口の分離を許可しました。蛍光抗体染色で示されているようにこのプロトコルに記述されている条件が積極的に人間の皮膚細胞分離使用のほぼ 100% ステンド真皮線維芽細胞マーカー、ビメンチン、コラーゲンに私24、しかし人間の負包皮表皮細胞マーカー K14 (

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ディスカッション

人間の皮膚組織から真皮線維芽細胞の単離、遺伝子組換え MCPyV 粒子の作製、培養細胞、免疫蛍光染色、HCR 技術から適応魚法の感染など、上記の方法をMCPyV 感染症27を分析する研究者を有効にする必要があります。MCPyV 感染症体外を達成するために最も重要な手順の 1 つは高力価ウイルス粒子製剤の生産です。ここで説明した組換え MCPyV ウイルス粒子の準備のためのプロト?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、試薬およびテクニカル サポートを提供するため、博士 Meenhard Herlyn (ウィスター研究所) とサイモン ・ m ・ セレステ (ペンシルベニア大学) を感謝したいです。私たちはまた役に立つ議論のため私たちの研究所のメンバーに感謝します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) 助成金 (R01CA187718、R01CA148768、R01CA142723)、NCI 癌センター助成金 (NCI P30 CA016520)、およびペン CFAR 賞 (P30 AI 045008) によって支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

参考文献

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