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  • Referencias
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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para infectar fibroblastos dérmicos humanos primarios con MCPyV. El protocolo incluye aislamiento de fibroblastos dérmicos, preparación de viriones MCPyV, infección por el virus, tinción de inmunofluorescencia y fluorescencia hibridación in situ. Este protocolo puede ampliarse para caracterizar las interacciones MCPyV-host y descubrir otros tipos de células infectables por MCPyV.

Resumen

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infección puede conducir al carcinoma de la célula de Merkel (MCC), una forma altamente agresiva de cáncer de piel. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV molecular biología y mecanismos oncogénicos ha visto obstaculizado por la falta de modelos de cultivo celular adecuado. Aquí, describimos un conjunto de protocolos para realizar y detectar MCPyV la infección de células de piel humana primaria. Los protocolos describen el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos, preparación de viriones recombinantes de MCPyV y la detección de infección por el virus por tinción de inmunofluorescencia (IF) y in situ hibridación de ADN reacción en cadena (HCR), que es muy sensible fluorescencia en el enfoque de situ del hibridación (pescado). Los protocolos en este documento pueden ser adaptados por los investigadores interesados a identificar otros tipos de células o líneas celulares compatibles con infección MCPyV. El enfoque descrito de pescado también podría adaptarse para detectar bajos niveles de ADN viral presente en la piel humana infectada.

Introducción

Polyomavirus de la célula de Merkel (MCPyV) es un virus ADN pequeño, doble hebra que se ha asociado con un cáncer de piel raro pero agresivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. La tasa de mortalidad de MCC, alrededor del 33%, supera la de melanoma3,4. MCPyV tiene un genoma circular de ~ 5 kb1,5 atravesada por una región reguladora no codificante (NCRR) en regiones1codificación de temprano y tarde. El NCRR contiene el origen viral de replicación (Ori) y de bidireccional promotores de transcripción viral6,7. La región temprana codifica proteínas de antígeno de tumor llamadas grandes T (LT), pequeño T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), así como una hay miRNA1,8,9,10. La región tardía codifica las proteínas de la cápside VP1 y VP211,12,13. LT y sT son las proteínas de MCPyV mejor estudiadas y han demostrado para apoyar la replicación de ADN viral y la tumorigénesis inducida por MCPyV5. Integración clonal de MCPyV ADN en el genoma del anfitrión, que se ha observado en hasta un 80% de la MCC, es probablemente un factor causal para tumor virus-positivo de desarrollo14,15.

La incidencia de CCM se ha triplicado en los últimos veinte años16. MCPyV la infección asintomática también es generalizada en la población general de18,17,19. Con el creciente número de diagnósticos MCC y la alta prevalencia de infección por MCPyV, hay una necesidad de mejorar nuestra comprensión del virus y su potencial oncogénico. Sin embargo, muchos aspectos de la biología MCPyV y mecanismos oncogénicos siguen siendo mal entendidos20. Esto es en gran parte porque MCPyV mal se replica en células establecidas líneas11,12,21,,,2223 y, hasta hace poco, la piel las células capaces de soportar MCPyV la infección no había sido descubierto22. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV y su interacción con las células huésped se ha visto obstaculizado por la falta de sistema de cultivo de células para propagar el virus5.

Hemos descubierto que fibroblastos dérmicos humanos primarios (HDFs) aislaron de prepucio humano neonatal soporte robusto MCPyV la infección tanto en vitro y ex vivo24. De este estudio, estableció el primer modelo de infección de cultura celular MCPyV24. Basándose en este modelo de sistema, demostró que la inducción de genes de matriz metaloproteinasa (MMP) por la WNT/β-catenina señalización de vía y otros factores de crecimiento estimula la infección MCPyV. Por otra parte, encontramos que el aprobado por la FDA MEK antagonista trametinib impide eficazmente la infección de MCPyV5,25. De estos estudios, también establecimos un conjunto de protocolos para el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparación MCPyV viriones11,12, realizar la infección MCPyV en fibroblastos dérmicos humanos 24 , detección de MCPyV de proteínas por tinción IF26y 25 . Además, adaptamos la in situ ADN hibridación la reacción en cadena (HCR) tecnología27 para desarrollar una técnica altamente sensible de pescado (HCR-DNA FISH) para la detección de ADN MCPyV en las células infectadas de la piel humana. Estos nuevos métodos serán útiles para estudiar el ciclo infeccioso de MCPyV, así como la respuesta celular a la infección por MCPyV. Las células de depósito de huéspedes naturales que mantienen la infección MCPyV y las células que dan origen a tumores MCC sigue siendo desconocidas. Las técnicas que describimos en este manuscrito podrían aplicarse para examinar varios tipos de células humanas para identificar tanto las células de depósito y el origen de tumores MCC. Nuestros métodos establecidos, tales como pescados de HCR-DNA, también podrían ser empleados en la detección de otros virus ADN de tumor y la caracterización de las interacciones de la célula huésped.

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Protocolo

Prepucio neonatal humana fueron obtenido del centro de investigación de la enfermedad de la piel de Penn. Fibroblastos humanos adultos fueron obtenidos de piel normal desechada después de la cirugía. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Pennsylvania Junta de revisión institucional.

1. aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos

  1. Utilice un par de tijeras recorte el tejido subcutáneo y grasa de prepucio neonatal humano y cortar la muestra de piel en mitades o cuartos.
  2. Incubar el tejido en 5 mL de dispase II en PBS suplementado con antibiótico-antimicótico de 10 mg/mL a 4 ° C durante la noche.
  3. En un recipiente estéril de 10 cm, cuidadosamente separe la epidermis de las capas dérmicas con unas pinzas de microdissection.
  4. Transferencia el tejido cutáneo resultante a un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de colagenasa de 2 mg/mL tipo IV en FBS-libre suplementado con antibiótico-antimicótico.
  5. Incubar la muestra a 37 ° C en 5% CO2 para 4-6 h con agitación periódica hasta que queden pocos agregados macroscópicos del tejido.
  6. Liberar las células de la dermis mediante pipeteo arriba y abajo (trituración) enérgicamente diez veces con una pipeta de 10 mL.
  7. Centrifugue a 180 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
  8. Las células disociadas en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal 10%, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% de la placa L-glutamina a 37 ° C en 5% CO2.

2. recombinante MCPyV preparación de virion

  1. Recopilación de 50 μg de plásmido pR17b (llevar MCPyV genoma) con 250 U de BamHI-HF en un volumen de 200 μl (4 h a 37 ° C) para separar el genoma viral de la columna vertebral del vector (figura 2).
  2. Añadir 1200 μl de buffer PB (complementado con 10 μl de NaAc de 3 M, pH 5.2) a la DNA digerida y purificar más 2 columnas de spin miniprep (capacidad de ADN de 20 μg). Eluir el plásmido digerido pR17b de cada columna con 200 μL de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Preparar la reacción de la ligadura en un tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir 400 μL de ADN de plásmido purificado del paso 2.2, 8,6 mL de tampón de ligasa x T4 1.05 y 6 μl de ligasa de T4 de alta concentración. Incubar a 16 ° C durante la noche.
  4. Agregar 45 mL de solución de PB (complementado con 10 μl de NaAc de 3 M, pH 5.2) para la ligadura y un colector de vacío se utiliza para cargar a través de 2 columnas de miniprep spin. Eluir cada columna con 50 μl de tampón TE. Esperar un rendimiento de alrededor de 30 μg de DNA.
  5. En la tarde tarde, semilla 6 x 106 293TT28 células en 10 cm plato con medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de becerro, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% L-glutamina sin higromicina B.
  6. A la mañana siguiente, asegúrese de que las células son cerca de 50% confluente. Transfectar utilizando 66 μl de reactivo de transfección (1,1 μl/cm2), 12 μg de MCPyV ligado a aislar ADN R17b en el paso 2.4, 8.4 μg de TB pMtB de plásmido de expresión ST y 9,6 μg de LT expresión plásmido pADL *29.
  7. Cuando las células transfected casi confluentes, al día siguiente, trypsinize las células y transferirlos a un plato de 15 cm de continua expansión.
  8. Opcionalmente tomar una pequeña cantidad de células 293TT expansión y llevar a cabo si la coloración de MCPyV LT (CM2B4) y VP1 (MCV VP1 conejo30) para determinar la eficiencia de transfección. En esta etapa, señal nuclear de la LT puede ser visible pero VP1 expresión probablemente no será detectable.
  9. Cuando el plato de 15 cm se convierte en casi confluente (generalmente 5-6 días después de la inicial de la transfección), transferencia de las células en tres platos de 15 cm. Cosechar las células de los platos de 15 cm cuando se vuelven casi confluentes y seguir el protocolo de cosecha de virus a continuación.
    Nota: Opcionalmente realizar control de calidad si tal como se describe en el paso 2.8. La mayoría de las células debe ser MCPyV LT y VP1 positiva en esta etapa.
  10. Para recoger el virus, trypsinize células, girar en 180 x g durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Añadir un volumen de pellet celular de DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM de MgCl2 y 1 x de antibiótico-antimicótico). Luego agregar sulfato de amonio 25 mM (de una solución stock de 1 M pH 9) seguido por 0,5% Tritón X-100 (de una solución madre 10%), 0,1% Benzonase y 0.1% de una DNasa dependiente de ATP. Mezcla bien e incubar a 37 ° C durante la noche.
  11. Incubar la mezcla por 15 min en hielo y añadir volumen 0.17 de 5 M NaCl. Mezclar e incubar en hielo por 15 minutos otra vuelta por 10 min a 12.000 x g en una centrífuga de 4 ° C. Si el sobrenadante no es claro, suavemente invierta el tubo y repita el paso de hilado. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  12. Resuspender el precipitado con un volumen de DPBS complementado con 0,8 M de NaCl y vuelta otra vez, como se describe en el paso 2.11.
  13. Combine los sobrenadantes del paso 2.11 y 2.12 y girar una vez más como se describe en el paso 2.11.
  14. Pour gradientes de iodixanol en tubos de pared delgada 5 mL polyallomer de enfasis (27%, y 33% y 39%) ~0.7 pasos de mL mediante una jeringa de 3 mL provista de una aguja larga o una pipeta p1000.
  15. Coloque 3 mL de sobrenadante clarificado que contiene el virus en el gradiente de iodixanol preparado.
  16. Vuelta por 3,5 h a 234.000 x g y 16 ° C en un rotor de SW55ti. Ajustar la aceleración y desaceleración a lento.
  17. Después de la ultracentrifugación, recoge 12 fracciones en tubos siliconados (cada fracción es de ~ 400 μL).
  18. Analizar las fracciones de la presencia de virus dsDNA reactivo o Western blot para VP1 (MCV VP1 conejo30). Piscina fracciones gradiente pico dsDNA o contenido de VP1 y caracterizar la población por PCR cuantitativa para el cálculo de los equivalentes de genoma viral31. Almacenar valores de virión MCPyV a-80 ° C.

3. infección

  1. Mantener fibroblastos dérmicos humanos primarios en DMEM con suero de ternera fetal 10%, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% L-glutamina. Al llegar a la confluencia, split 1:4 de fibroblastos sin giro hacia abajo.
    Nota: Para mayor eficiencia de la infección de MCPyV, utilice fibroblastos primarios entre los pasos 5 y 12 que se están dividiendo activamente en el momento de la galjanoplastia.
  2. Para infectar fibroblastos dérmicos humanos, el medio de aspirar y lavar las células con DPBS.
  3. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina-EDTA al plato e incubar a 37 ° C durante 5-10 minutos.
  4. Ver bajo el microscopio para asegurarse de que las células se vienen del plato.
  5. Añadir 10 mL de medio DMEM/F12 con EGF, 20 ng/mL bFGF y 3 μm de 20 ng/mL CHIR99021, que estimulan MCPyV infección24, al plato y transfiera la solución de células en un tubo de 15 mL.
  6. Desactivación de las células a 180 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante. Resuspender las células en medio DMEM/F12 que contiene 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF y 3μm CHIR99021 en 2-4 x 104 células por mL.
  7. La semilla 200 μL de la suspensión de células complementada con el tipo de colagenasa 1 mg/mL IV en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Descongelar el MCPyV stock de virion en el hielo. Añadir 10 equivalentes de genoma viral9 de viriones MCPyV (calculado en el paso de 2.18) por 1 μl de iodixanol cada 2.500 a 5000 células infectadas.   Toque suavemente al lado de la placa y colocar la placa en la incubadora.
  8. Después de incubación a 37 ° C en 5% CO2 para 48-72 h, añadir 20% FBS a cada pocillo.
  9. Permiten la infección proceder a 37 ° C en 5% CO2 de 72-96 h.

4. inmunofluorescente de tinción

  1. Fijar las células obtenidas en el paso 3.9 con paraformaldehido 3% en PBS durante 20 minutos.
  2. Lavar las células con PBS dos veces.
  3. Incubar las células en buffer de bloqueo/permeabilización (0.5% Tritón X-100, 3% de BSA en PBS filtrada por filtro de 0,22 μm) a temperatura ambiente durante 1 hora.
  4. Incubar las células con los anticuerpos primarios siguientes: ratón monoclonal anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) y el anticuerpo de conejo policlonales anti-MCPyV VP1 (1: 2000), a temperatura ambiente durante 3 horas.
  5. Lavar las células con PBS tres veces.
  6. Incubar las células con anticuerpos secundarios: Fluor 594 cabra anti-ratón IgG (1: 1000) y Fluor 488 cabra anti-IgG de conejo (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora.
  7. Lavar las células con PBS tres veces.
  8. Contratinción las células con 0.5 μg/mL de DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, diclorhidrato).
  9. Montaje de cubreobjetos de vidrio se desliza y analizar utilizando un microscopio de fluorescencia invertido.

5. In situ de ADN-HCR

Nota: Esta técnica requiere que se siembran las células sobre cubreobjetos. Para ello, las condiciones de infección descritas anteriormente (paso 3) pueden ampliarse para el formato de la placa de 24 pozos.

  1. Fijar las células cultivadas en el cubreobjetos con el 4% PFA en PBS durante 10 minutos lavar los cubreobjetos dos veces con PBS, entonces tratarlos con etanol al 70% para permeabilizar las células a 4 ° C durante la noche.
    Nota: Muestras fijadas pueden permanecer en este estado durante varios días.
  2. Hibridar las muestras reemplazando el etanol con tampón de hibridación de la sonda y incubar por 60 min a TA.
  3. Diluir la sonda (1 μm) (tabla 1) en el hibridación de la sonda solución tampón en dilución 1: 500 30 min antes de finalizar el paso de la hibridación e incubar a 45 ° C.
  4. Al final de las incubaciones, pipetee ~ 10 μL de la mezcla de sonda diluido por cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Lugar el cubreobjetos, celda hacia abajo, en sus respectivas gotas de sonda de hibridación mezcla. Sellar los bordes y las partes posterioras de los cubreobjetos para las diapositivas con una cantidad abundante de pegamento de caucho.
  5. Calentar los portaobjetos con puntas de prueba mayor a 94 ° C por 3 min estableciendo las diapositivas sobre la parte plana de un bloque de calor. Transfiera los portaobjetos a una cámara humidificada e incubar a 45 ° C durante la noche. Para hacer una simple cámara humidificada, ligeramente humedezca toallas de papel estéril con dH2O y el lugar en el fondo de un recipiente de plástico que sella con una Junta de goma.
    Nota: Durante el calentamiento el cemento de goma puede burbujear brevemente. Sin embargo, asegúrese de que el sello no se rompe.
  6. Con cuidado retire el cemento de goma con pinzas y coloque el cubreobjetos celular-lado para arriba detrás en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lavar los cubreobjetos con tampón de lavado de la sonda a temperatura ambiente tres veces.
  7. Incubar el cubreobjetos en el tampón de amplificación (200 μL en placas de 24 pocillos) a temperatura ambiente 30-60 min.
  8. Mientras tanto, cocer cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos marcados reconociendo las puntas de prueba (cuadro 1) en tubos PCR separados calentando a 94 ° C por 90 s y enfriamiento a RT 30 min mientras que la protección de la luz. Mezclar las dos horquillas en tampón de amplificación, cada uno a una dilución de 1:50.
  9. Hacer una superficie para la reacción de amplificación por estirar la película de parafina sobre la cara de una tapa de placa de 24 pozos. Pipetee gotas de 50-100 μl de la mezcla de buffer de horquilla/amplificación en la película de parafina para cada cubreobjetos. Utilice pinzas para extraer cuidadosamente el cubreobjetos de la solución de amplificación previa. Seco el cubreobjetos tocando el borde de una toallita desechable porosa y coloque el lado del celular hacia abajo sobre la gota de amplificación.
  10. Coloque la tapa de la placa con el cubre-objetos en una cámara humidificada e incubar durante una noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
  11. Regresar una vez más el cubreobjetos a pozos. Incubar las muestras con 5 x SSCT [5 x cloruro de sodio citrato de sodio (SSC) 0,1% Tween 20 filtrada a través de un filtro de 0,22 μm] que contiene 0,5 μg/mL DAPI por 1 h a RT lavar las muestras dos veces con 5 x SSCT a TA.
  12. Monte el cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Analizar las células y las muestras con un microscopio de fluorescencia invertido de la imagen.

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Resultados

El protocolo descrito en este manuscrito permitieron el aislamiento de una población casi homogénea de HDFs (figura 1). Según lo demostrado por la coloración inmunofluorescente, casi el 100% de los aislados de las células cutáneas humanas usando las condiciones descritas en este protocolo fueron positivamente mancharon para el colágeno, el vimentin y marcadores de fibroblastos dérmicos yo24, pero negativo para el ser humano mar...

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Discusión

Los métodos descritos arriba, incluyendo el aislamiento de fibroblastos dérmicos de tejido de la piel humana, preparación de viriones recombinantes de MCPyV, infección de las células cultivadas, coloración inmunofluorescente y un método sensible de peces adaptado de tecnología HCR, que debe permitir a los investigadores a analizar MCPyV infección27. Uno de los pasos más críticos para lograr MCPyV infección in vitro es la producción de preparaciones de virus de alto título. Utilizando...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) y el Dr. M. Celeste Simón (Universidad de Pennsylvania) reactivos y apoyo técnico. También agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios de discusión útil. Este trabajo fue apoyado por las donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 y R01CA142723), la beca de apoyo de centro NCI cáncer (NCI P30 CA016520) y el premio Penn CFAR (P30 AI 045008).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

Referencias

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