JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להדביק את ראשי פיברובלסט עורי האנושי עם MCPyV. הפרוטוקול כולל בידוד של fibroblasts עורי, הכנה של MCPyV virions, זיהום בנגיף, immunofluorescence מכתים פלורסצנטיות הכלאה באתרו. פרוטוקול זה ניתן להאריך אפיון אינטראקציות MCPyV-מארח, גילוי סוגי תאים אחרים מרישי על-ידי MCPyV.

Abstract

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) זיהום יכול להוביל מרקל קרצינומה של תאים (MCC), טופס אגרסיבי ביותר של סרטן העור. מחקרים מכניסטית מחקירה מלאה של ביולוגיה מולקולרית MCPyV ומנגנונים oncogenic יש כבר הקשו על ידי חוסר מודלים תרבות תא נאותה. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים עבור ביצוע וכן זיהוי זיהום MCPyV של תאי העור האנושי העיקרי. הפרוטוקולים לתאר את ניתוקה של האדם fibroblasts עורי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, וזיהוי להידבקות בווירוס על ידי צביעת (אם) immunofluorescent והן באתרו DNA-הכלאה תגובת שרשרת (HCR), אשר הוא מאוד רגיש קרינה פלואורסצנטית בגישה הכלאה (דגים) באתרו. ניתן להתאים את הפרוטוקולים במסמך זה על ידי חוקרים מעוניין לזהות סוגי תאים או שורות תאים התומכים MCPyV זיהום אחרים. הגישה דגים שתואר יכול להתאים גם לגילוי רמות נמוכות של נגיפי DNAs המצויים בעור האדם הנגוע.

Introduction

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) הוא קטן, כפול גדילי DNA וירוס שויך סרטן העור נדירה אך אגרסיבי, מרקל תא קרצינומה (MCC)1,2. שיעור התמותה של מפקד צוות משימה, בסביבות 33%, חורג של מלנומה3,4. MCPyV יש גנום מעגלית של1,~ 5 kb5 נחצה על ידי אזור תקינה ללא קידוד (NCRR) לתוך מוקדם ולא מאוחר קידוד אזורים1. NCRR מכיל מקור ויראליות שכפול (אורי) ועל היזמים דו-כיווניים עבור שעתוק ויראלי6,7. האזור בתחילת מקודד הגידול אנטיגן חלבונים הנקראים T גדול (LT), T קטן (רח'), 57kT, ORF LT חלופי (ALTO), כמו גם של autoregulatory miRNA1,8,9,10. האזור מאוחר מקודד את החלבונים capsid VP1 ואת VP211,12,13. LT ו- sT החלבונים MCPyV ביותר למד, הוכחו תומכת שכפול ה-DNA ויראלי הנוצרות על-ידי MCPyV tumorigenesis5. שילוב המשובטים MCPyV DNA הגנום המארח, אשר נצפתה עד 80% של MCCs, הוא כנראה גורם סיבתי עבור גידול חיובי וירוס פיתוח14,15.

השכיחות של MCC שילש מעל ה-20 שנה האחרונות16. זיהום MCPyV אסימפטומטיים נפוצה גם האוכלוסייה הכללית17,18,19. עם הגדלת מספר אבחנות MCC, שכיחות גבוהה של זיהום MCPyV, יש צורך לשפר את ההבנה שלנו של הווירוס, פוטנציאל oncogenic שלו. עם זאת, היבטים רבים של ביולוגיה MCPyV ומנגנונים oncogenic נשארים ממעטים להבין20. זאת בעיקר משום MCPyV משכפל לקוי תא הוקמה קווים11,12,21,22,23 , עד לאחרונה, מסוגל לתמוך MCPyV תאי עור זיהום לא היה שהתגלו22. מחקרים מכניסטית לחקור באופן מלא MCPyV והאינטראקציה שלו עם התאים המארחים יש להיות הכבידו על ידי חוסר תא מערכת תרבות להפצת וירוסים5.

גילינו כי ראשי האדם עורי fibroblasts (HDFs) מבודד מן העורלה האנושי neonatal תמיכה איתנה MCPyV זיהום בשני במבחנה ו- ex-vivo24. ממחקר זה, הקמנו המודל זיהום התרבות התא הראשון עבור MCPyV24. בונים על מערכת זו מודל, הראנו תנאי הגיוס של מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) גנים מאת חגיגת/β-catenin איתות לשביל וגורמים אחרים הצמיחה מגרה זיהום MCPyV. יתר על כן, מצאנו trametinib אנטגוניסט MEK שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב ביעילות MCPyV זיהום5,25. ממחקרים אלה, גם הקמנו קבוצה של פרוטוקולים לבידוד fibroblasts עורי אנושי24,25, הכנת MCPyV virions11,12, ביצוע זיהום MCPyV על האדם fibroblasts עורי 24 , 25 וגילוי חלבונים MCPyV אם צביעת26. בנוסף, התאמנו באתרו DNA הכלאה תגובת שרשרת (HCR) טכנולוגיה27 לפתח טכניקה דגים רגישים (דגים HCR-DNA) לגילוי MCPyV DNA בתאים נגועים העור האנושי. שיטות חדשות אלה יהיה מועיל ללימוד מחזור זיהומית של MCPyV, כמו גם התגובה התאית זיהום MCPyV. התאים מאגר טבעי מארח לשמור על זיהום MCPyV והתאים להצמיח גידולים MCC נשאר לא ידוע. טכניקות שנתאר כתב יד זה יכול להיות מיושם לבחון סוגים שונים של תאים אנושיים כדי לזהות גם את המאגר התאים ואת המקור של גידולים MCC. השיטות שלנו הוקמה, כגון דגים HCR-DNA, יכול גם להיות מועסק זיהוי וירוסים גידול אחרים ה-DNA, אפיון אינטראקציות התא המארח.

Protocol

. אל תדאג neonatal האנושי התקבלו ממרכז המחקר של מחלת העור פן. למבוגרים fibroblasts אנושי, התקבלו שהושלכו עור רגיל לאחר הניתוח. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מוסדיים המנהלים.

1. בידוד של האדם fibroblasts עורי

  1. השתמש זוג מספריים כדי לקצץ את רקמת שומן ו התת-עורית מן הערלה neonatal אנושי. ולחתוך את דגימת עור חצאים או רבעים.
  2. דגירה הרקמה ב 5 מ של 10 מ"ג/מ"ל dispase II ב- PBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. בקערה סטרילי 10 ס מ, הפרד בזהירות את האפידרמיס מהשכבות עורי באמצעות מלקחיים microdissection.
  4. העברת רקמות עורי שייווצר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ של 2 מ"ג/מ"ל collagenase הקלד הרביעי במדיום נטול FBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic.
  5. דגירה המדגם-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 עבור 4-6 h ברעידות תקופתיות עד כמה רקמות מאקרוסקופית אגרגטים להישאר.
  6. שחרור תאים בודדים של הדרמיס על-ידי pipetting למעלה ולמטה (triturating) נמרצות 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל.
  7. צנטריפוגה ב x 180 גרם במשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע.
  8. צלחת התאים dissociated בינוני DMEM בתוספת סרום עגל עוברית 10%, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו ו- 1%-גלוטמין ב 37 ° C 5% CO2.

2. רקומביננטי הכנה virion MCPyV

  1. µG 50 תקציר של פלסמיד pR17b (נושא הגנום MCPyV) עם 250 U של BamHI-HF באמצעי אחסון 200 µL (4 h ב 37 מעלות צלזיוס) כדי להפריד בין הגנום הנגיפי לבין עמוד השידרה וקטור (איור 2).
  2. להוסיף 1200 µL של המאגר PB (בתוספת 10 µL של 3 מ' NaAc, pH 5.2) ה-DNA מתעכל ולטהר miniprep-2 ספין עמודות (קיבולת DNA µg 20). Elute את פלסמיד מתעכל pR17b של כל עמודה עם 200 µL טה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl, pH8.0, 1 מ"מ EDTA).
  3. להכין את התגובה מצדו של שפופרת צנטרפוגה 50 מ. הוסף µL 400 של מטוהרים פלסמיד ה-DNA מ שלב 2.2, mL 8.6 1.05 מאגר ליגאז x T4 ו- µL 6 של ריכוז גבוה T4 ליגאז. דגירה ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. 45 מ של מאגר PB (בתוספת 10 µL של 3 מ' NaAc, pH 5.2) להוסיף מצדו ולהשתמש יריעה ואקום לטעון בין 2 עמודות ספין miniprep. Elute כל עמודה עם 50 µL טה המאגר. לצפות תשואה כ- 30 µg של ה-DNA.
  5. בשעות הערב/אחר הצהריים המאוחרות, זרע 6 x 106 293TT28 תאים לתוך 10 ס מ צלחת בינונית DMEM המכיל בתוספת 10% עגל עוברית סרום חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1%-גלוטמין ללא hygromycin B.
  6. למחרת בבוקר, ודא כי התאים נמצאים כ-50% confluent. Transfect באמצעות µL 66 של תרביות תאים ריאגנט (1.1 µL/cm2), µg 12 של MCPyV מחוברים מחדש לבודד דנ א R17b מ שלב 2.4, µg 8.4 של ST הביטוי פלסמיד pMtB ו- 9.6 µg זה ביטוי פלסמיד pADL *29.
  7. כאשר התאים transfected הם כמעט confluent, למחרת היום, trypsinize את התאים ומעבירים אותם אל צלחת 15 ס מ עבור המשך הרחבתה.
  8. אם תרצה לקחת מספר קטן של תאים 293TT על הרחבת ולבצע אם צביעת עבור זה MCPyV (CM2B4) ואת VP1 (MCV VP1 ארנב30) כדי לקבוע יעילות תרביות תאים. בשלב זה, גרעיני אות זה עשויים להיות גלויים אך הביטוי VP1 כנראה לא יהיה לזיהוי.
  9. כאשר המנה 15 ס מ הופך כמעט confluent (בדרך כלל 5-6 ימים לאחר תקנים הראשוני), להעביר את התאים לתוך שלוש מנות 15 ס מ. קציר תאים מן המנות 15 ס מ כאשר הם הופכים כמעט confluent, לפי התקנון הקציר וירוס להלן.
    הערה: לחלופין לבצע בקרת איכות אם כפי שמתואר בשלב 2.8. רוב התאים צריך להיות MCPyV זה והן VP1 חיובי בשלב זה.
  10. כדי לקצור את הווירוס, trypsinize תאים, ספין-x 180 גרם עבור 5 דקות ב RT ולהסיר את תגובת שיקוע. הוסף אמצעי אחסון צניפה תא אחד של DPBS-מ ג (DPBS עם 9.5 מ מ MgCl2 ו- 1 x אנטיביוטיקה-antimycotic). לאחר מכן להוסיף 25 מ מ. אמוניום סולפט (מתוך פתרון pH 9 1 מ' מניות) ואחריו 0.5% X-100 טריטון (מ 10% מניות פתרון), 0.1% Benzonase ו 0.1% של DNase תלוי-ATP. מערבבים היטב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  11. דגירה את התערובת למשך 15 דקות על קרח ולאחר מכן להוסיף נפח 0.17 5 M NaCl. לערבב, דגירה על קרח בשביל עוד 15 דקות ספין 10 דקות ב 12,000 x g ומפרידה 4 ° C. אם תגובת שיקוע אינו ברור, בעדינות היפוך הצינור, חזור על השלב ספינינג. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
  12. Resuspend בגדר שימוש באמצעי אחד של DPBS בתוספת 0.8 M NaCl, ומסתובב שוב, כפי שמתואר בשלב 2.11.
  13. לשלב את supernatants מהשלב 2.11 ו- 2.12, ספין פעם נוספת כפי שמתואר בשלב 2.11.
  14. יוצקים מעברי צבע של iodixanol קיר דק 5 מ"ל polyallomer צינורות מאת underlaying (27%, 33%, ואז 39%) ~0.7 mL השלבים באמצעות מזרק 3 מ ל מצויד עם מחט ארוכה או פיפטה של p1000.
  15. לטעון 3 מ"ל של מובהר תגובת המכיל וירוס שיקוע על המילוי ההדרגתי iodixanol מוכן.
  16. ספין על 3.5 h ב 234,000 x g ו- 16 מעלות צלזיוס רוטור SW55ti. הגדר את האצה והאטה להאט.
  17. לאחר ultracentrifugation, לאסוף את השברים 12 siliconized צינורות (כל שבר הוא µL ~ 400).
  18. לנתח את השברים לנוכחות של וירוס ריאגנט dsDNA ו/או תספיג עבור VP1 (MCV VP1 ארנב30). בריכה שברים מעבר צבע עם שיא dsDNA ו/או תוכן VP1 ולאפיין את המניה על-ידי PCR כמותי כדי לחשב גנום ויראלי המקביל31. חנות MCPyV virion מניות ב- 80 ° c

3. זיהום

  1. לשמור על ראשי fibroblasts עורי האנושי ב- DMEM עם סרום עגל עוברית 10%, 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות, 1%-גלוטמין. כשמגיעים הנהרות, לפצל fibroblasts 1:4 ללא ספינינג למטה.
    הערה: MCPyV זיהום להשגת יעילות מרבית, השתמש fibroblasts העיקרי בין קטעים 5 ו- 12 כי הם פעיל חלוקת הזמן של ציפוי.
  2. כדי להדביק את האדם fibroblasts עורי, תשאף המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS.
  3. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  4. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי התאים יורדות המנה.
  5. להוסיף 10 מ ל DMEM/F12 בינוני המכיל 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ומיקרומטר 3 CHIR99021, אשר כולם לעורר MCPyV זיהום24, למנה ולהעביר את הפתרון תא לתוך צינור 15 מ"ל.
  6. ספין למטה התאים ב x 180 גרם למשך 2 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend התאים DMEM/F12 בינוני המכיל 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ו 3µM CHIR99021 ב 2-4 x 10 תאי4 מ"ל.
  7. זרע µL 200 של התליה תא בתוספת 1 מ"ג/מ"ל collagenase סוג IV לבאר כל צלחת 96-ובכן. הפשרת MCPyV מניות virion על הקרח. הוסף מקבילות גנום ויראלי9 10 MCPyV virions (שלב מחושבים ב- 2.18) לכל 1 µL של iodixanol עבור כל התאים 2,500 ל- 5000 נגועה.   הקש על הצד של הצלחת בעדינות ומניחים את הצלחת בחממה.
  8. לאחר דגירה ב 37 ° C ב- 5% CO2 עבור 48-72 שעות, להוסיף 20% FBS כדי מכל קידוח.
  9. לאפשר את הזיהום להמשיך ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 h 72-96.

4. immunofluorescent מכתים

  1. לתקן תאים שהושג בשלב 3.9 עם paraformaldehyde 3% ב- PBS כעשרים דקות.
  2. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים.
  3. דגירה התאים במאגר חוסם/permeabilization (0.5% טריטון X-100, 3% BSA ב- PBS מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.22) ב RT לשעה.
  4. דגירה התאים עם נוגדנים העיקריים הבאים: העכבר LT monoclonal אנטי-MCPyV (CM2B4) (1:1000), ארנב polyclonal אנטי-MCPyV VP1 נוגדנים (1:2000), ב- RT במשך 3 שעות.
  5. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים משניים: 594 עבור חיל הים העז אנטי עכבר IgG (1:1000) וארנבת עבור חיל הים 488 עז אנטי איג (שבערך) ב RT לשעה.
  7. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
  8. Counterstain התאים עם 0.5 µg/mL דאפי (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. הר coverslips על זכוכית שקופיות ולנתח תוך שימוש במיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

5. אין סיטו DNA-HCR

הערה: טכניקה זו דורשת כי התאים להיות נזרע על coverslips. למטרה זו, זיהום בתנאים המתוארים לעיל (שלב 3) עשוי להיות יורה לתבנית 24-ובכן צלחת.

  1. לתקן תאים בתרבית על coverslips עם 4% מחברים ב- PBS במשך 10 דקות לשטוף coverslips פעמיים עם PBS, ואחר כך להתייחס אליהם עם 70% אתנול כדי permeabilize את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: דגימות קבוע יכול להישאר במצב זה במשך מספר ימים.
  2. מראש hybridize דוגמאות על ידי החלפת האתנול עם בדיקה הכלאה מאגר המקננת עבור 60 דקות ב- RT.
  3. לדלל את probe(s) (1 מיקרומטר) (טבלה 1) בבדיקה הכלאה מאגר פתרון-דילול שבערך 30 דקות לפני סוף השלב הקדם הכלאה, דגירה ב 45 º C.
  4. בסוף incubations, פיפטה ~ 10 μL של המיקס מדולל בדיקה לכל coverslip על שקופיות מיקרוסקופ. המקום coverslips, תא-בצד למטה, על טיפות שלהם בהתאמה הכלאה בדיקה מערבבים. לאטום את הקצוות ואת גב coverslips על השקופיות עם כמות הליברלית של דבק גומי.
  5. מחממים את השקופיות עם הגששים נוספה ב 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות על ידי הגדרת את השקופיות על הצד השטוח של גוש חום. להעביר את השקופיות תא humidified, דגירה ב 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להפוך תא humidified פשוטים, לחלח מגבות נייר סטרילי עם dH2O והמקום בתחתית מיכל פלסטיק שמשמר עם אטם גומי.
    הערה: במהלך חימום הבטון גומי יכול בועה בקצרה. עם זאת, ודא כי החותם לא לשבור.
  6. בזהירות הקילוף הבטון גומי עם מלקחיים ומניחים coverslips התא-הצד לאחור לתוך בארות של צלחת 24-. טוב. לשטוף את coverslips עם מאגר רחיצת רכב הגישוש-RT שלוש פעמים.
  7. דגירה של coverslip במאגר הגברה (200 µL ב- 24-ובכן צלחות) ב RT 30-60 דקות.
  8. בינתיים, anneal כל אחד סיכות oligonucleotide שכותרתו שני לזהות את הגששים (טבלה 1) בנפרד המבחנות על ידי חימום עד 94 ° C עבור 90 s וקירור כדי RT למשך 30 דקות, תוך הגנה על האור. מערבבים את שתי סיכות במאגר הגברה, כל אחד בלדילול של 1:50.
  9. לבצע משטח עבור התגובה הגברה על ידי מתיחת פרפין סרט על הפנים פתוח של מכסה צלחת 24-. טוב. Pipette µL 50-100 טיפות התערובת מאגר הגברה/סיכת ראש על הסרט פרפין עבור כל coverslip. להשתמש מלקחיים כדי להסיר בקפידה על coverslips הפתרון קדם הגברה. יבש את coverslip על-ידי נגיעה לקצה מחיקה חד פעמית נקבובי, ומניחים בצד תא למטה על גבי ה-droplet הגברה.
  10. מקם את המכסה צלחת מחזיק את coverslips לתא humidified, דגירה ללון במלון RT בחושך.
  11. להחזיר את coverslips בארות פעם נוספת. דגירה בדגימות עם 5 x SSCT [5 x נתרן כלוריד סודיום ציטרט (האס) 0.1% Tween 20 מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.22] המכילה 0.5 µg/mL דאפי עבור 1 h RT. לרחוץ את הדגימות פעמיים עם 5 x SSCT-RT.
  12. הר על coverslips על שקופיות מיקרוסקופ. לנתח את התאים, תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מותר בידוד של אוכלוסיה הומוגנית כמעט של HDFs (איור 1). כפי שמתואר על ידי צביעת immunofluorescent, כמעט 100% של תאים אנושיים עורי מבודדים באמצעות התנאים המתוארים פרוטוקול זה היו באופן חיובי צבעונית פיברובלסט עורי סמנים, vimentin של קולגן אני

Discussion

השיטות המתוארות לעיל, לרבות בידוד של עורי fibroblasts מרקמות העור האנושי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, זיהום של תאים בתרבית, צביעת immunofluorescent, שיטה דגים רגישים הותאם מהטכנולוגיה נציבות האו ם לפליטים, אשר צריך לאפשר לחוקרים לנתח זיהום MCPyV27. אחד השלבים הקריטיים ביותר להשגת MCPyV זיהום במבחנה ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות ד ר Meenhard Herlyn (מכון Wistar), ד ר מ. סלסט סימון (אוניברסיטת פנסילבניה) לאספקת ריאגנטים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם אנשי מעבדות שלנו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 ו- R01CA142723), המענק תמיכה במרכז לסרטן (NCI P30 CA016520) NCI, ופרס וכפר פן (P30 AI 045008).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fetal calf serumHyCloneSH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190136
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG-200Store at -80 degree celsius
CHIR99021Cayman Chemical13122Store at -80 degree celsius
CHIR99021SigmaSML1046Store at -80 degree celsius
Collagenase type IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240-062Protect from light
DMEM mediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgGThermo Fisher ScientificA11032Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA11034Protect from light
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Protect from light
ParaformaldehydeSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Lot # B2717
MCV VP1 rabbitRabbit polyclonal serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human RecombinantCorning354060Store at -80 degree celsius
Benzonase NucleaseSigmaE8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseEPICENTREE3101K
Probe hybridization bufferMolecular technologies
Probe wash bufferMolecular technologies
Amplification bufferMolecular technologies
Alexa 594-labeled hairpinsMolecular technologiesB4Protect from light
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentThermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
blue miniprep spin columnQiagen27104
50mL Conical Centrifuge TubesCorning352070
T4 ligaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144polyomavirusfibroblastscollagenaseCHIR99021immunofluorescentDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved