全组织细胞外囊的提取

摘要

在这里, 我们提供了一个详细的方案, 以分离细胞外囊泡 (ev) 从整个组织, 包括大脑和肿瘤标本。该方法提供了一种可重复的技术, 可从固体组织中提取 ev, 以便进一步进行下游分析。

摘要

循环和间质小膜结合囊泡 (ev) 是开发新的诊断或预后生物标志物检测的有希望的目标, 并可能成为在大量的进展的重要参与者疾病。目前的研究重点是从多种细胞和组织类型分泌的囊泡的特征, 以便更好地了解 ev 在神经退行性变、炎症和癌症等疾病的发病机制中的作用。然而, 全球一致和可重复的分离和纯化囊泡的技术仍在进行中。此外,从体内固体组织中提取 ev 的方法也很少被描述。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 从整个新鲜或冷冻组织, 包括大脑和肿瘤标本中提取感兴趣的小电动车, 以便进一步表征。我们证明了该方法在多个下游分析中的适应性, 包括电子显微镜和囊泡的免疫表型表征, 以及 ev 蛋白的定量质谱。

引言

小的细胞外囊泡 (ev) 包括内皮衍生的外周细胞和小膜脱落的微囊泡, 具有广泛的生物医学兴趣。小 ev 是由异质种群 50-250 nm 膜结合囊泡, 其中含有生物活性蛋白、脂质和核酸, 这些物质被共同认为在多种疾病过程中发挥着重要作用。推进的研究特别将这些囊泡与神经退行性疾病和 prion 疾病、感染过程、自身免疫性或炎症性疾病以及肿瘤生长和转移^{1, 2,3有关,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13}. 对 ev 在疾病发病机制中的重要性的生物医学研究迅速增加, 引起了人们对开发可重复和严格的分离和纯化这些囊泡的方法的平行兴趣。

电动汽车特性的历史和当前挑战是无法完全分离小型 ev 亚群。这一挑战主要是由于我们对不同囊泡的生物发生的不同分子机制的理解有限。亚群之间的重叠大小、密度和生物货物进一步控制了这些区别。这一挑战的部分原因还包括使用截然不同的浓缩技术, 在对实验室间孤立的囊泡进行下游分析方面存在不一致之处, 并破坏了全球为照亮分类电动车种群所做的努力。

值得注意的是, 大多数 ev 特性都是通过体外收集细胞培养上清液进行的, 最近的体内研究描述了从包括血浆、尿液在内的动物或人体体液中分离囊泡的技术, 和唾液。虽然在循环中大量存在的电动车, 但它也认识到, 这些囊泡在细胞间的通信事件中起着重要作用, 并存在于细胞组织的间质中。在癌症的背景下, 间质 ev 可能是特别重要的调节肿瘤微环境的癌细胞种子和转移生长 14^,15。因此, 从固体组织标本中提取囊泡的技术的发展和优化具有重要价值。这些方法将提供一种方法, 直接研究有机或肿瘤衍生的 ev 从临床标本, 包括小活检和部分或全部器官切除。

在这项研究中, 以及在我们实验室¹⁶发表的上一份报告中, 我们的目标是解决目前在 ev 浓缩方法中关注的几个主要问题: 1) 描述一种可重复的技术, 以分离和净化 ev, 达到目前的最高标准。在该领域被接受;2) 试图分离高富集于内骨源性外显体的小型 ev 亚群;3) 提供从固体组织标本中提取这些囊泡的协议, 以便进一步表征。

最近, kwal 和他的同事描述了一个相对小规模的碘沙诺密度梯度, 以更高的效率分离和纯化 ev 亚群, 比可比的蔗糖密度梯度¹⁷。在所引用的研究中, 树突状细胞衍生的 ev 在相对较轻的密度分数下捕获, 与 1.1 g/ml 的密度一致, 在被认为与本报告中存在的高比例外显体的内染色体蛋白中得到了高度丰富的。分数。根据作者的研究, 这些 "真正的" 体外蛋白包括肿瘤易感基因 101 (tsg101)、合成蛋白1、cd81、adam10、ehd4 和几种环素^{蛋白 17}。我们后来调整了这一技术, 以成功的组织离解方法描述的佩雷斯-冈萨雷斯等人18和随后的差分离心协议, 以分离整个脑源 evs¹⁶。我们还证明了这种方法在描述 ev 蛋白的效用, 结合顺序协议的下游定量和比较质谱的水泡蛋白, 以前在我们^{的实验室 19}描述。这项工作与希尔实验室的工作是一致的, 在那里, ev 从大脑的额叶皮层^{丰富了 20}。

在这项研究中, 我们详细阐述了这一技术, 并扩大了最近从我们的实验室公布的协议的应用, 以分离电动车从固体肺肿瘤。据我们所知, 这是首次描述从体内肿瘤标本中丰富 evs 的方案的研究。鉴于人们对电动车作为新的诊断生物标志物的广泛兴趣及其在肿瘤形成中的作用, 这种方法可能会对越来越多的科研人员有价值。从临床角度来看, 间质 ev 具有很大的诊断价值, 特别是在组织学评价有限的标本中。我们希望这里概述的方法将为从新鲜或冷冻动物或人类手术标本中获取 ev 的可重复技术提供基础, 为今后的工作铺平道路, 以揭示这些小疾病发病机制中的重要作用小泡可能会发挥。

研究方案

整个大脑都是在佛罗里达州立大学动物使用和护理机构委员会 (iacuc) 的批准下获得的。如前面所述, c57bl6 j 背景中共有12个老鼠大脑 (每个年龄组3个大脑: 2、4、6和 8个月) 用于电动车提取.经佛罗里达农业机械大学 iacuc 批准, mandip sachdeva 博士慷慨捐赠了肺肿瘤标本。肺肿瘤来源于在免疫缺陷的巴布内裸鼠中生长的人腺癌细胞系 h1975。本研究重点介绍了两个具有代表性的肿瘤复制的数据。

请注意:图 1提供了囊泡分离和纯化方法的示意图概述。

1. 组织分离和微分离心

1. 在 hibernate-e 培养基中, 每组织约 0.4-1.0 g, 制备10毫升的离解缓冲液 (10 毫克木瓜蛋白酶; 5.5 mm l-半胱氨酸; 67μm 2-硫醇; 1.1 mm edta)。请注意, 所有用于电动汽车浓缩和净化的溶液都应在超纯过滤水中稀释。
2. 将整个新鲜或冷冻组织加入50毫升锥形管的离解缓冲液中, 在37°c 的温水浴中孵育 20分钟. 如有需要, 可在孵育前将组织切割成较小的碎片。
3. 孵育后, 在含有组织的离解缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂, 以获得最后1x 的浓度。
4. 将含有该组织的溶液放入宽松的溶出均质机中, 并使用每个样品大约30次慢击轻轻分离组织。中风的数量可以根据组织的一致性进行调整。
5. 在4°c 下, 将缓冲液中的离解组织转移到50毫升锥形管和离心机上, 在4°c 下 5分钟, 以颗粒细胞和剩余的纤维或内聚组织碎片。
6. 将上清液转移到干净的50毫升锥形管和离心机上, 在4°c 下, 以 2, 000 x克的速度 10分钟, 以颗粒和丢弃较大的细胞碎片。
7. 将上清液再次转移到一个干净的50毫升锥形管和离心机在 10, 000 x克在4°c 下 40分钟, 以颗粒不想要的大囊泡或小凋亡体。
   请注意:如果需要, 可以保存这种颗粒, 以便对较大的囊泡进行额外的研究。
8. 通过0.45μm 过滤器将上清液分解成干净的 12 ml 超离心管。
   请注意:纤维化组织样本可能不易过滤。这些样品可以通过40μm 电池过滤器进行过滤, 然后通过连续较小的针头 (18 g、20 g、22 g), 然后通过0.45μm 过滤器进行过滤。
9. 在4°c 条件下, 以 100, 000 x克的速度将样品超离心为 2小时, 以子弹状小型 ev。
10. 分解上清液, 使超离心管倒置 5-10, 频繁敲击以去除管两侧的残留液体。残余液体也可以使用吸气真空移液器吸气。
11. 在 0.25 m 蔗糖缓冲液的 1.5 ml 中重新悬浮 ev 颗粒 (10 mm tris, ph 7.4)。重要的是要确保在这一步中的颗粒完全重新悬浮。要做到这一点, 覆盖与副膜管之前, 涡旋电动车到解决方案。在最后一次涡旋混合之前, 在室温下对超离心管进行15-20 的摇晃。
12. 以不超过 1, 000 x克的速度对管材进行简短的离心, 以回收管内底部的液体悬浮液。
13. 按照下面的梯度净化步骤, 或如果需要, 将 ev 悬浮液存放在4°c 过夜。

2. 密度梯度净化

1. 在含有 ev 的 1.5 ml 蔗糖-tris 缓冲液中加入 1.5 ml 60% 碘沙诺 (水中的库存溶液), 以创建含有30% 碘沙诺的最终溶液。移液器上下多次, 以彻底混合溶液。请注意, 避免失去液尖的溶液, 因为高碘沙诺浓度是相当粘稠的。
2. 将含有 ev 的30% 碘沙诺缓冲液转移到 5.5 ml 超离心管的底部。
3. 从60% 碘沙诺库存溶液中, 在超纯水中为每个样品制备至少 1.5 ml 的20% 和10% 碘醇溶液。
4. 测量1.3 毫升20% 碘沙诺, 并使用注射器和 18 g 针小心地在底部梯度层的顶部层。为了避免在密度界面处混合层, 保持针头的斜面与半月板上方的超离心管内部接触, 并向下添加溶液。
5. 使用与上述相同的技术, 在20% 碘化醇层的顶部的10% 碘醇溶液的 1.2 ml ml。
6. 在2.8000xg 的秋千桶转子中, 在 24000 x g的情况下, 小心地平衡和加载超离心管转子桶和离心机, 在4°c 下持续50分钟。将离心机的加速和减速速度设置为允许的最小速率, 以避免密度层中断。
7. 为每个样品标记 10个 1.5 ml 微离心管, 以对应于密度梯度的分数1到10。分数1被指定为将首先删除的最上面的分数, 而分数10是最后删除的底部分数。
8. 梯度超离心完成后, 轻轻地从转子桶中取出管, 放置在一个稳定的支架中。在兴趣的部分, 往往会看到一个可见的囊泡带。将40张水机的10个串行分数490μl 从梯度顶部进入相应的管中。在试管的底部会有少量的液体, 可能含有污染蛋白质。此示例可以被丢弃, 也可以保留为分数 11 (如果需要)。
9. 使用折射计测量分数的折射率。如果需要进行样本保存, 也可以在并行运行控制梯度的情况下执行此操作。将含有碘沙诺的每一组分移液器20-30μl 放在折射率仪表面, 并通过将折射率与已知的碘沙诺密度进行比较来估计密度。请注意, 在进行下一个超离心清洗步骤之前, 如果需要, 可以将分数隔夜存放在含碘合醇的溶液中。
10. 将每个分数转移到干净的12毫升超离心管。加入5毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs; 137 mm ncl, 2.7 mm kcl, 10 mL na 2 hpo 4, 2mL kh2 po 4, ph 7.4) 到管中, 通过缓慢向上和向下移液混合.
    请注意:样品中添加的 pbs 应无颗粒, 通过0.22μm 过滤过滤无菌 pbs 并在室温下储存以避免盐沉淀。
11. 添加额外的6毫升的 1x pbs 的顶部, 并再次仔细混合。
12. 在4°c 条件下, 以 100, 000 x克的速度将管材超离心为 2小时, 以重新颗粒小囊泡。在裂解囊泡之前, 将上清液分解并点击干燥管进行蛋白质分析 (第3步) 或重新悬浮电动车进行形态分析 (第5步)。

3. ev 蛋白的裂解和免疫印迹蛋白的测定

请注意:如果需要保存整个囊泡进行形态学表征或生物活性, 研究人员可以直接进入第5步。在初始实验中, 或在质谱分析之前, 所有回收的组分都应通过免疫印迹进行分析, 以确认与 ev 蛋白的组分。

1. 为了裂解 ev 进行蛋白质分析, 加入40μl 的强裂解缓冲液 (5% sds, 10 mm edta, 120 mm tris-hcl ph 6.8, 2.5% 2-甲氨基乙醇, 8 m 尿素), 并在超离心管中添加蛋白酶抑制剂。
   请注意:如果蛋白质抗体检测需要非还原条件, 则在强裂解缓冲液中用超纯水代替 2-硫代乙醇。
2. 确保颗粒的完全重新悬浮和在缓冲液中裂解的 ev, 方法是将副回绝液放在超离心管上, 用力旋涡, 然后在室温下摇晃 20分钟, 然后再进行最后的涡流。
3. 以 1, 000 x克的形式进行快速离心, 以恢复整个样品量, 为30-60 秒。将样品转移到新的 1.5 ml 微离心管, 并在-20°c 至-80°c 下存储, 直至进一步加工。
4. 为制备免疫印迹分析的纯化裂解物, 在样品中加入 5x laemmli 样品缓冲液 (10% sds、250 mm tris ph 6.8、1 mgml 溴酚蓝、0.5m dtt、50% 甘油、5% 2-硫醇), 最终浓度为1x。
   请注意:如果需要非还原条件, 请将 dtt 和 2-硫醇更换为超纯水。
5. 如果需要整个组织同质化控制, 用上文详述的蛋白酶抑制剂将含有尿素的强裂解缓冲液中的组织裂解, 然后在 10, 000 x g处离心 10分钟, 丢弃剩余的细胞外基质、整个细胞, 或完整的细胞碎片。在组织均质中加入 5倍 laemmli 样品缓冲液, 最终浓度为1x。
6. 将含有 ev 或组织同质样品的样品缓冲液在95°c 下煮沸 5-10, 然后将 1-1-10 的馏分中的相同体积 (从相当于 0.1-0.3 g 的起始组织材料; 1-2 微克纯化的 ev 蛋白) 装入 10% sds-page 凝胶。负载等量的组织均质。可能需要更多的样品才能被不太敏感的抗体检测出来。
7. 按照前面的详细介绍, 进行凝胶电泳和西方印迹分析, 以确认纯化裂解液中的 ev 蛋白, 并比较 ev 的相对丰度。
   请注意:一旦 ev 蛋白在一致的分数中被重现, 步骤2.12 中描述的最后的超离心清洗可能仅限于感兴趣的梯度分数。

4. ev 蛋白定量

1. 如果需要对 ev 蛋白进行敏感定量以进行进一步分析, 请使用与洗涤剂和尿素兼容的荧光检测 (见材料表)。请注意, 某些基于荧光的检测与莱姆利样品缓冲液中存在的溴酚蓝兼容, 如果需要, 可帮助直接裂解此缓冲液中的 ev 颗粒 (步骤 2.12)。
2. 如果使用上述基于荧光的蛋白质定量试剂盒, 请在提供的滤纸上发现1μl 样品或标准, 并根据制造商的说明继续进行蛋白质定量。

5. 电动汽车形态的表征

1. 步骤2.12 中最后离心清洗后检查整个囊泡, 彻底重新悬浮无颗粒 1x pbs 中的 ev 颗粒。将电动车存放在4°c 下不超过一周, 直到处理, 以避免冻融循环。
   请注意:通过免疫印迹分析, 将形态分析限制在感兴趣的分数上, 确定了一致含有浓缩 ev 蛋白的分数是有益的。
2. 对整个 ev 样品进行纳米颗粒跟踪分析, 以确定制剂中囊泡的浓度和大小, 如前^所述22。
3. 如果需要, 通过囊泡的电子显微镜对 ev 形态进行表征, 并确认尺寸测量。在步骤 5.1^{23 之后}, 可以从囊泡悬浮液中制备 em 网格, 也可以在步骤2.12 之后从颗粒中处理24块状制剂^.

6. 用于质谱分析的凝胶纯化和胰蛋白酶消化

1. 如果需要用质谱对 ev 蛋白体进行表征, 将含有 ev 的分数等质量 (至少 10μg) 加载到预铸聚丙烯酰胺凝胶中, 以分离和纯化蛋白质。制造商提供的预铸凝胶是首选的, 以减少潜在的污染蛋白 (如角蛋白) 被引入样品的水平。
2. 运行样品至少0.5 英寸的聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质纯化, 然后修复和染色与库马西染料, 如前面^{详细描述 25}。
3. 按照先前详细说明的 19^,26 , 将车道切割成1毫米3立方体,^以促进胰蛋白酶消化.
4. 将5μl 的消化肽样品加载到 lc-msms 仪器中, 以便在分析柱上分离, 并根据详细指定的参数进行质谱分析16。

结果

图 1显示了囊泡的组织离解、差动离心和梯度纯化的示意图。图 2突出了梯度纯化 ev 的形态和免疫表型确认。显示了10-30 碘沙诺梯度超离心后的可重复密度图, 两个不同的囊泡种群向上迁移到分数 2 (轻 ev) 和分数 5 (密集 ev), 取决于组织类型。梯度分数的代表性免疫细胞表现出有效的分离和纯化小肿瘤衍生的 ev 在分数5。值得注意...

讨论

对于小电动车在肿瘤微环境中的作用, 以及在器官发育、成熟和功能中的作用, 已经产生了很多科学兴趣。总体而言, 这项研究为从整个大脑或肿瘤标本中提取完整的 ev 提供了优化的工作流程。虽然在这里我们简单地证明了这种技术在肺肿瘤衍生的 ev 中的适用性, 但这种方法可以很容易地适应其他固体组织的工作, 为进一步对小分泌的囊泡进行体内表征提供了机会。广泛的生物医学兴趣。虽然超出?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm filter	VWR	28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057
anti-Alix antibody	Santa Cruz	sc-7129
anti-Calnexin antibody	Santa Cruz	sc-11397
anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
anti-CD81 antibody	Santa Cruz	sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody	Santa Cruz	sc-25507
anti-HSC70 antibody	Santa Cruz	sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody	Santa Cruz	sc-100336
anti-TSG101 antibody	Santa Cruz	sc-7964
EZQ protein quantification kit	ThermoFisher Scientific	R33200
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf	5820715006
FEI CM120 Electron Microscope	TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)	Genetex	27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78420
HALT protease inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	367280
NanoSight LM10	Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG	Genetex	26741
rabbit anti-mouse IgG	Genetex	26728
Refracto 30PX (refractometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor	Beckman Coulter	333790
Tabletop 5804R centrifuge	Eppendorf	22623508