Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Résumé

Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.

Introduction

Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. essor de la recherche biomédicale dans la signification du SVE dans la pathogenèse de la maladie a suscité un intérêt parallèle à l’élaboration des méthodes reproductibles et rigoureux pour l’isolement et la purification de ces vésicules.

Un défi historique et actuel dans la caractérisation de l’EV a été l’incapacité de séparer entièrement petites sous-populations EV. Ce défi est en grande partie en raison de notre compréhension limitée des différents mécanismes moléculaires régissant la biogenèse des vésicules distinctes. Chevauchement de taille, densité et biologiques marchandises entre sous-populations plus matérielle de ces distinctions. Partie de ce défi a été également l’utilisation de différentes techniques d’enrichissement largement, offrant des incohérence dans l’analyse en aval de vésicules isolées dans les laboratoires et saper l’effort mondial visant à éclairer les populations EV catégoriques.

Il est à noter que la majorité des EV caractérisation a été effectuée de la collection in vitro de culture cellulaire surnageante, avec les plus récentes études in vivo, décrivant des techniques pour isoler les vésicules de sécrétions animales ou humaines, y compris plasma, urine et la salive. Alors que le serveur virtuel Exchange est présents en grande quantité en circulation, il est également reconnu que ces vésicules jouent un rôle important dans les événements de communication de cellule-cellule et sont présents dans l’interstitium des tissus cellulaires. Dans le contexte du cancer, EVs interstitielles peuvent être particulièrement importants dans la modulation du microenvironnement tumoral pour cellule cancéreuse semis et croissance métastatique^14,15. Par conséquent, il y a valeur dans le développement et l’optimisation des techniques pour extraire des vésicules d’échantillons de tissus solides. Ces méthodes fournira un moyen d’étudier directement orgue - ou tumeur dérivée EVs récoltées à partir des échantillons cliniques, y compris les petites biopsies et résection partielle ou totale des organes.

Dans cette étude et dans un précédent rapport, publié par notre laboratoire¹⁶, nous avons pour objectif d’aborder plusieurs grandes préoccupations actuelles dans la méthodologie d’enrichissement EV : 1) pour décrire une technique reproductible pour isoler et purifier les EVs au plus haut niveau actuellement acceptée dans le domaine ; 2) pour tenter d’isoler les petites sous-populations EV fortement enrichies en dérivés endosomale exosomes ; et 3) de fournir un protocole pour l’extraction de ces vésicules provenant d’échantillons de tissu solide aux fins de la caractérisation plus loin.

Récemment, Kowal et collègues ont décrit un gradient de densité relativement petits iodixanol pour séparer et purifier les sous-populations EV avec une plus grande efficacité que saccharose comparables densité dégradés¹⁷. Dans l’étude citée, les EVs de culture cellulaire dendritiques capturés en une fraction de densité relativement légers, compatible avec une densité de 1,1 g/mL, ont été fortement enrichis en protéines endosomale censés être plus compatible avec une forte proportion des exosomes présent dans cette fraction. Selon les auteurs, ces protéines exosomal « bona fide » incluent gène de susceptibilité tumeur 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 et plusieurs annexin protéines¹⁷. Plus tard, nous avons adapté cette technique pour réussir une méthode de dissociation tissulaire décrite par Perez-Gonzalez et al.¹⁸ et un protocole de centrifugation différentielle suivantes pour isoler ensemble encéphales EVs¹⁶. Nous avons aussi démontré l’utilité de cette méthode pour la caractérisation des protéomes EV en combinant un protocole séquentiel pour la spectrométrie de masse quantitative et comparative en aval de protéine vésiculaire, déjà décrite par notre laboratoire¹⁹. Ce travail est parallèle à celle du laboratoire Hill, où EVs ont été enrichies du cortex frontal du cerveau²⁰.

Dans cette étude, nous avons des précisions sur cette technique et étendre l’application du protocole a récemment publié dans notre laboratoire à l’isolement du SVE de tumeurs pulmonaires solide. À notre connaissance, c’est la première étude pour décrire un protocole afin d’enrichir les EVs d’ex vivo les échantillons de tumeur. Compte tenu de l’intérêt général suscité par EVs comme nouveaux biomarqueurs diagnostiques et leur rôle dans la tumorigenèse, cette méthode s’avérera sans doute précieuse pour un nombre croissant de chercheurs scientifiques. D’un point de vue clinique, EVs interstitielles pourraient abriter grande valeur diagnostique, en particulier dans les échantillons où évaluation histologique l'est limitée. Notre espoir est que la méthode décrite ici constituera un fondement pour une technique reproductible pour récolter des EVs des échantillons frais ou congelés animales ou humaines chirurgicales, ouvrant la voie à des travaux futurs découvrir le rôle important dans la pathogenèse de la maladie ces petites les vésicules peuvent jouer.

Protocole

Cerveau entier ont été obtenus avec l’approbation de l’Institutional Animal Use et soin Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de Floride. Un total de douze cerveaux de souris (3 cerveaux de chaque groupe d’âge : 2, 4, 6 et 8 mois) d’un J C57BL/6 fond ont été utilisés pour l’extraction de EV, comme précédemment décrit¹⁶. Les échantillons de tumeur pulmonaire ont été généreusement donnés par Dr Mandip Sachdeva sous approbation de la Florida Agricultural and IACUC mécanique de l’université. Tumeurs pulmonaires ont été dérivées de la lignée de cellules d’adénocarcinome humain H1975 cultivé en Balb/c nu/nu nue des souris immunodéficientes. Données provenant de deux répétitions de tumeur représentatifs sont mises en évidence dans cette étude.

Remarque : Un aperçu schématique de la méthode d’isolement et de purification de vésicule est fourni à la Figure 1.

1. tissu Dissociation et Centrifugation différentielle

1. Préparer 10 mL de tampon de dissociation (10 mg de papaïne, 5,5 mM de L-cystéine, 67 µM 2-mercaptoéthanol ; 1,1 mM EDTA) dans un milieu Hibernate-E par environ 0,4 à 1,0 g de tissu. Notez que toutes les solutions utilisées pour la purification et l’enrichissement de l’EV doivent être diluées dans l’eau filtrée ultrapure.
2. Ajouter des tissus entiers frais ou congelés au tampon de dissociation dans un tube conique de 50 mL et incuber dans une eau chaude bain à 37 ° C pendant 20 min. de tissu peut être coupé en fragments plus petits avant incubation si nécessaire.
3. Après l’incubation, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x vers le tampon de dissociation contenant le tissu.
4. Versez la solution contenant le tissu dans un homogénéisateur de Dounce loose-fit et doucement se dissocient les tissus à l’aide d’environ 30 coups lents par exemple. Le nombre de traits peut-être être ajusté en fonction sur la cohérence du tissu.
5. Tissu de transfert dissocié dans le tampon d’un tube conique de 50 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules et les fragments restants de tissu fibreux ou cohésifs.
6. Transférer le surnageant dans un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C à pellet et jeter les gros débris cellulaires.
7. Transférer le surnageant à nouveau à un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 10 000 x g pendant 40 min à 4 ° C pour granuler indésirables plus grandes vésicules ou corps apoptotiques petit.
   Remarque : Cette pastille peut être enregistrée pour une étude supplémentaire de grandes vésicules si vous le souhaitez.
8. Éliminer le surnageant à travers un filtre de 0,45 µm dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL.
   Remarque : Échantillons de tissu fibreux dense ne peuvent être facilement été filtrés. Ces échantillons peuvent être filtrés à travers un tamis de cellule 40 µm, puis transmises en série de petites aiguilles (18 G, 20 G, 22 G) avant de filtrer à travers le filtre de 0,45 µm.
9. Ultracentrifugeuse l’échantillon à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour granuler petits EVs.
10. Éliminer le surnageant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant 5-10 min, taraudage fréquemment pour éliminer le liquide résiduel sur les côtés des tubes. Liquide résiduel peut aussi être aspiré à l’aide d’une pipette à aspiration sous vide.
11. Resuspendre le culot de EV en 1,5 mL de tampon de saccharose de 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). Il est important de s’assurer la complète remise en suspension de l’extrait concentré dans cette étape. Pour ce faire, couvrir les tubes avec parafilm avant vortex EVs en solution. Roche l’ultracentrifugeuse tubes pendant 15-20 min à température ambiante avant un mélange final vortex.
12. Brièvement centrifuger les tubes à une vitesse pas plus de 1 000 x g pour récupérer la liquide de la suspension au fond du tube.
13. Passez à la procédure de purification gradient ci-dessous, ou le cas échéant, Ranger EV suspension à 4 ° C durant la nuit.

2. Purification de Gradient de densité

1. Ajouter 1,5 mL d’iodixanol de 60 % (solution dans l’eau) vers la mémoire tampon saccharose/Tris de 1,5 mL contenant des EVs pour créer une solution finale contenant 30 % iodixanol. Pipetter vers le haut et vers le bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution. Faire preuve de prudence pour éviter de perdre la solution dans l’embout de la pipette, comme la concentration élevée d’iodixanol est assez visqueuse.
2. Transférer la solution tampon d’iodixanol 30 % EVs au fond d’un tube d’ultracentrifugation 5,5 mL.
3. Préparer au moins 1,5 mL de 20 % et 10 % d’iodixanol solutions par échantillon dans de l’eau ultrapure de la solution mère d’iodixanol de 60 %.
4. Mesurer 1,3 mL d’iodixanol de 20 % et soigneusement calque au-dessus du calque de fond dégradé à l’aide d’une seringue et une aiguille 18 G. Pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité, garder le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube ultracentrifugation juste au-dessus du ménisque et ajouter la solution goutte à goutte.
5. Couche de 1,2 mL de solution d’iodixanol de 10 % sur le dessus de la couche d’iodixanol de 20 % en utilisant la même technique que ci-dessus.
6. Soigneusement équilibrer et charger les tubes d’ultracentrifugation dans les seaux de rotor et centrifuger à un rotor de swing-seau à 268 000 x g pendant 50 min à 4 ° C. Définir la vitesse d’accélération et de décélération de la centrifugeuse aux taux minimal autorisé pour éviter une désorganisation dans les couches de densité.
7. Dix tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour chaque échantillon afin de correspondre à des fractions de 1 à 10 de la gradient de densité de l’étiquette. Fraction 1 est désignée comme la fraction supérieure qui sera tout d’abord supprimée, tandis que la fraction 10 est la fraction de fond dernière retirée.
8. Une fois terminée l’ultracentrifugation dégradée, délicatement retirer les tubes des seaux de rotor et placer dans un support stable. On constatera souvent une bande visible des vésicules dans la fraction d’intérêt. Pipetter dix fractions séries de 490 µL du haut de la pente dans les tubes correspondants. Il y aura une petite quantité de liquide restant au fond du tube qui contient probablement des protéines contaminantes. Cet exemple peut être mis au rebut, ou conservé sous forme de fraction 11 si vous le souhaitez.
9. Mesurer les indices de réfraction des fractions à l’aide d’un réfractomètre. C’est possible aussi avec un dégradé de contrôle s’exécuter en parallèle si la conservation de l’échantillon est nécessaire. Distribuer 20-30 µL de chacune des fractions contenant iodixanol sur la surface du réfractomètre et d’estimer la densité en comparant les indices de réfraction à densités connues iodixanol. Notez que fractions peuvent être stockées pendant la nuit dans la solution contenant de l’iodixanol si nécessaire avant de passer à la prochaine étape de lavage d’ultracentrifugation.
10. Transférer chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL. Ajouter 5 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na₂HPO₄mM 2 KH₂PO₄, pH 7,4) au tube et mélanger en pipettant également lentement de haut en bas.
    Remarque : PBS ajoutés aux échantillons devrait être exempt de particules, assurée par filtrage de PBS stérile à travers un filtre de 0,22 µm et stocker à température ambiante pour éviter la précipitation de sel.
11. Ajoutez une autre 6 mL de solution 1 PBS x au début et à nouveau mélanger soigneusement.
12. Ultracentrifugeuse les tubes à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour re-granuler petites vésicules. Éliminer le surnageant et tapoter les tubes secs avant la lyse des vésicules pour l’analyse des protéines (étape 3) ou de la remise en suspension des véhicules électriques pour l’analyse morphologique (étape 5).

3. lyse et Immunoblot Confirmation des protéines EV

Remarque : Si la conservation des vésicules entières pour caractérisation morphologique ou activité biologique est souhaitée, chercheurs peuvent procéder directement à l’étape 5. Dans les premières expériences, ou avant l’analyse par spectrométrie de masse, toutes les fractions récupérées devraient être analysées par immunoblot pour confirmer des fractions avec des protéines de l’EV.

1. Pour lyser EVs pour analyse des protéines, ajouter 40 µL de tampon de lyse forte (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % de 2-mercaptoéthanol, urée 8 M) avec l’ajout de l’inhibiteur de protéase à pellet EV en tube ultracentrifugeuse.
   Remarque : Si non réductrice des conditions sont nécessaires pour la détection des anticorps des protéines, remplacer l’eau ultrapure pour le 2-mercaptoéthanol dans le tampon de lyse forte.
2. Assurer la complète remise en suspension des granulés et lyse des EVs dans le tampon en plaçant parafilm sur l’ultracentrifugation tube, vortex vigoureusement, puis bascule pendant 20 min à température ambiante avant un vortex final.
3. Centrifuger brièvement à 1 000 x g pendant 30-60 s pour récupérer le volume de l’échantillon entier. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et les conserver à-20 ° C à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
4. Pour préparer les lysates purifiés pour l’analyse par immunotransfert, ajouter 5 x Laemmli solution tampon (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL de bleu, de bromophénol 0,5 M DTT, glycérol à 50 %, 5 % de 2-mercaptoéthanol) pour les échantillons destinés à une concentration finale de 1 x.
   Remarque : Si vous désirez des conditions non réducteur, remplacer le DTT et le 2-mercaptoéthanol avec de l’eau ultrapure.
5. Si l’homogénat tissulaire tout contrôles sont souhaitées, lyse le tissu dans l’urée contenant fort tampon de lyse détaillés ci-dessus avec inhibiteur de protéase, puis centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à jeter le reste de la matrice extracellulaire, cellules entières, ou débris cellulaires intacts. Ajouter 5 x Laemmli solution tampon à l’homogénat tissulaire pour une concentration finale de 1 x.
6. Faire bouillir la solution tampon contenant des échantillons de l’homogénat EV ou tissulaires à 95 ° C pendant 5-10 min, puis charger le volume égal (de l’équivalent de 0,1 et 0,3 g de démarrage de matériel tissulaire ; 1 à 2 µg de protéine purifiée de EV) des fractions 1-10 en gel SDS-PAGE 10 %. Charger une masse égale d’homogénat tissulaire. Accroître le volume d’échantillons peut être nécessaire pour la détection par anticorps moins sensibles.
7. Procéder à l’électrophorèse sur gel et analyse par Western blot comme précédemment détaillées²¹ pour confirmer les protéines EV dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’EV dans les fractions.
   Remarque : Une fois que la protéine EV a été démontrée reproductible dans les fractions cohérentes, le lavage final ultracentrifugation décrit dans étape 2.12 peut être limité aux fractions gradients d’intérêt.

4. Quantification des protéines EV

1. Utiliser un test compatible détergent et urée fluorescence si sensible quantification des protéines EV est souhaitée pour une analyse plus approfondie (voir Table des matières). Notez que certains tests basés sur la fluorescence sont compatibles avec le bleu de bromophénol présent dans le tampon de Laemmli échantillon, facilitant lyse directe du culot EV (en étape 2.12) dans cette mémoire tampon si vous préférez.
2. Si le kit de quantification de ladite protéine basés sur la fluorescence est utilisé, spot 1 µL de l’échantillon ou de la norme au moins dupliquer sur du papier filtre fourni et continuer la quantification des protéines selon les instructions du fabricant.

5. caractérisation de la morphologie de l’EV

1. Pour examiner les vésicules entières après la centrifugation finale lavez dans étape 2.12, soigneusement resuspendre EV culot en particules libres 1 x PBS. Magasin EVs à 4 ° C pour pas plus d’une semaine avant le traitement pour éviter les cycles de gel-dégel.
   Remarque : Il est bénéfique pour ont déjà confirmé les fractions contenant constamment enrichi de protéines EV par immunobuvardage de limiter les analyses morphologiques aux fractions d’intérêt.
2. Effectuer des nanoparticules suivi d’analyse sur des échantillons de EV ensemble pour déterminer la concentration et la taille des vésicules dans les préparations, comme précédemment détaillées²².
3. Caractériser la morphologie EV et confirmer les mesures de taille par microscopie électronique des vésicules, si vous le souhaitez. EM grilles peuvent être préparés à partir de suspensions de vésicule suite 5.1 étape²³, ou alternativement, peuvent être traitées comme bloc préparations²⁴ de boulettes suivant étape 2.12.

6. en gel Purification et Digestion Trypsique pour analyse par spectrométrie de masse

1. Si vous souhaitez caractérisation des protéomes EV par spectrométrie de masse, charge masse égale (au moins 10 µg de protéines) des fractions contenant des EVs dans un préfabriqué sur gel de polyacrylamide pour séparer et purifier les protéines. Fabricant fourni préfabriquées gels sont préférables pour réduire les niveaux de potentiel contaminant des protéines (p. ex., kératine) introduits dans les échantillons.
2. Exécuter l’exemple au moins 0,5 pouces dans le gel de polyacrylamide pour la purification de la protéine, puis fixer et colorer avec un colorant bleu de Coomassie, comme décrit dans le détail,²⁵.
3. Couper les voies en 1 mm³ cubes pour la digestion trypsique, comme précédemment détaillées^19,26.
4. Charger 5 µL de l’échantillon digéré peptide en instrument de LC-MS/MS pour la séparation sur la colonne analytique et l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse selon les paramètres spécifiés dans le détail,¹⁶.

Résultats

Un aperçu schématique de la dissociation tissulaire, centrifugation différentielle et gradient purification des vésicules est affiché à la Figure 1. La confirmation morphologique et immunophénotypiques des EVs purifiés par gradient est mis en évidence dans la Figure 2. Un schéma des densités reproductibles après ultracentrifugation du gradient iodixanol 10 à 30 % est donné, avec deux populations distinctes de vésic...

Discussion

Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu'evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm filter	VWR	28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057
anti-Alix antibody	Santa Cruz	sc-7129
anti-Calnexin antibody	Santa Cruz	sc-11397
anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
anti-CD81 antibody	Santa Cruz	sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody	Santa Cruz	sc-25507
anti-HSC70 antibody	Santa Cruz	sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody	Santa Cruz	sc-100336
anti-TSG101 antibody	Santa Cruz	sc-7964
EZQ protein quantification kit	ThermoFisher Scientific	R33200
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf	5820715006
FEI CM120 Electron Microscope	TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)	Genetex	27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78420
HALT protease inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	367280
NanoSight LM10	Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG	Genetex	26741
rabbit anti-mouse IgG	Genetex	26728
Refracto 30PX (refractometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor	Beckman Coulter	333790
Tabletop 5804R centrifuge	Eppendorf	22623508