全体組織からの細胞の小胞の抽出

要約

ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs を抽出する再現性のある手法を提供しています。

要約

循環と格子間原子小さな膜結合型細胞小胞 (Ev) 新規診断や予後バイオ マーカーのアッセイの開発のための有望なターゲットを表し、可能性の広大なスペクトルの進行での重要なプレーヤーとして病気。現在の研究は複数の細胞から分泌される小胞のキャラクタリゼーションに焦点を当ててより良い組織の種類は神経変性、炎症、癌などの条件の病因に EVs の役割を理解します。しかし、グローバルに一貫した、再現性のあるテクニックを分離し、小胞を浄化は進行中のまま。また前のヴィヴォ固体ティッシュから EVs の抽出方法、やっとのことで説明します。ここでは、さらに特性評価のための脳、腫瘍標本を含む全体の新鮮なまたは冷凍の組織から関心の小型 Ev を抽出するための詳しいプロトコルを提供します。この電子顕微鏡および小胞の肺浸潤特性だけでなく、EV 蛋白質の量的な質量を含む複数のダウン ストリーム解析法の適応性を示します。

概要

小さな細胞小胞 (Ev) は、エンドソーム派生エクソソームと広範な生物医学的関心のある小さな膜小屋ミクロベシクルに含まれます。小型 Ev は、生物活性タンパク、脂質、および病気プロセスの多数の重要な役割を果たすと考えられている総称して核酸を含む 50 250 nm 膜結合型ベシクルの異種集団で構成されます。神経変性疾患とプリオン疾患、感染プロセス、自己免疫・炎症性条件と腫瘍の増殖や転移^1,2,3にこれらの小胞を特に関与して研究を進めています。^{,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。 分離そしてこれらの小胞の浄化のための再現性・厳格な方法の開発に平行関心を生成している病因における EVs の意義に急速な生物医学研究。

EV の特性の歴史と現在の挑戦は、小型 EV のサブポピュレーションを完全に分離することができないことをされています。この課題は、異なる小胞の形成を支配する異なる分子メカニズムの私達の限られた理解の主因です。これらの区別を convolutes サイズ、密度、およびさらに集団間の生物学的製剤の貨物を重複します。このような課題の一部には広く濃縮技術を異なる所で隔離された小胞の下流における矛盾を提供する、カテゴリの EV 集団を照らすに世界的な努力を損なう使用もされました。

それは動物や人間の体液、血漿、尿を含む小胞を分離する技術を記述する生体内での最近の研究と in vitro における細胞培養上清、集から EV の特性の大半が実行されていることは注目に値する、と唾。一方、EVs が流通に大量に存在するこれらの小胞が細胞間コミュニケーション イベントで重要な役割を果たして、細胞組織の間質に存在をも認識します。癌の中では、間質性の EVs が癌細胞播種、転移性成長^14,15がん微小環境を調節する際に特に重要な可能性があります。したがって、開発と最適化の固体組織標本から小胞を抽出する手法で価値があります。これらのメソッドは、直接研究器官に手段を提供するまたは腫瘍由来の EVs 小さな生検と部分的または完全臓器切除を含む、臨床検体から収穫されます。

この研究と当社研究所¹⁶刊以前のレポートでは、EV 濃縮方法論のいくつかの主要な現在の懸念に対処を目指して: 1) を分離し、現在最高の基準に EVs を浄化する再現性のある手法について説明するにはフィールドで受け入れ2) 小型 EV subpopulations エンドソーム派生エクソソーム; 高濃縮を分離しようとする・ 3) さらに評価の目的のための固体組織標本からこれらの小胞の抽出のためのプロトコルを提供します。

最近、Kowal と同僚は、分離し、匹敵するショ糖密度勾配¹⁷より大きい有効性によって EV subpopulations を浄化する比較的小規模な iodixanol の密度勾配を説明します。引用における密度 1.1 g/mL、一貫性のある比較的軽い密度分数でキャプチャされた樹状細胞由来 EVs 高エクソソームこの存在の割合が高いと最も一致する信じられるエンドソーム蛋白質で濃縮しました。割合です。作者によれば、これら「善意」exosomal 蛋白質はいくつかアネキシン タンパク質¹⁷、EHD4、ADAM10 CD81 腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) syntenin 1 を含まれています。我々 はその後ペレス ・ ゴンザレスら¹⁸と全く脳由来 EVs¹⁶を分離する続く差動遠心分離のプロトコルで記述された組織解離法を成功するためにこの手法を適応しました。また、下流定量的および比較私たちの研究所の¹⁹に記載された小胞タンパク質の質量分析のための連続したプロトコルを組み合わせることによって EV プロテオームの特性でこのメソッドの有用性を示した。この仕事²⁰脳の前頭葉から EVs が豊かな丘の研究室からあった。

本研究では、この手法に手の込んだ、EVs の固体腫瘍から分離に当研究室から最近公開されたプロトコルのアプリケーションを拡張します。私たちの知る限り、これは生体内の腫瘍の標本 ex から EVs を豊かにするためのプロトコルを記述する最初の研究です。このメソッドは、新規の診断バイオ マーカーとその腫瘍形成における役割として EVs で広範な関心を与え、科学研究者の数が増えている貴重なを可能性が高い証明します。臨床的観点から間質性 EVs は組織学的評価は限られた標本を中心に、素晴らしい診断的価値を抱くことが。私たちの希望は、ここで概説している方法は再現手法が新鮮なまたは冷凍動物または人間手術標本から、明らかに病気の発症に重要な役割これら小さな将来の仕事のための道を舗装 EVs を収穫するための基盤を提供小胞を再生可能性があります。

プロトコル

頭脳全体は、制度上の動物の使用およびフロリダの州立大学のケア委員会 (IACUC) から承認が得られました。12 マウス脳の合計 (各年齢別グループから 3 脳: 2、4、6、および 8 ヶ月) EV 抽出、上記¹⁶C57BL/6 J から背景が使用されました。肺の腫瘍の標本は、フロリダの農業および機械大学 IACUC の承認の下で博士 Mandip Sachdeva によって寛大に寄贈しました。肺腫瘍は、ひと癌細胞株 H1975 免疫不全 Balb/c nu/nu 裸マウスで栽培から派生しました。2 つの代表的な腫瘍複製からのデータは、本研究で強調表示されます。

注:小胞の分離精製法の概要は、図 1で提供されます。

1. 組織解離と差動遠心分離

1. 休止状態 E 中約 0.4 1.0 あたり 10 mL の解離バッファー (パパインの 10 mg; 5.5 mM L システイン; 67 μ M 2-メルカプトエタノール; 1.1 mM EDTA) の準備組織の g。フィルター処理された純水 EV 濃縮と精製に使用されるすべてのソリューションを薄めるべきことに注意してください。
2. 50 mL の円錐管にバッファーが解離に全く新鮮なまたは冷凍の組織を追加し、インキュベート暖かい水で 20 分組織の 37 ° C でバスがカットする孵化前に小さな断片に必要な場合。
3. 次の孵化、組織を含む解離バッファーに最終的な 1 倍の濃度のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を追加します。
4. ルーズ フィット Dounce ホモジナイザーに組織を含む溶液を注ぐし、優しくサンプルあたり約 30 遅いストロークを使用して組織を切り離します。ストローク数は、組織の整合性に基づいて調整することがあります。
5. 50 mL の円錐管とセルと残りの線維性または凝集の組織片をペレットへの 4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心するバッファーの転送解離組織。
6. きれいな 50 mL の円錐管、ペレットし、大細胞残骸を破棄する 4 ° C で 10 分間の 2,000 × gで遠心上清を転送します。
7. きれいな 50 mL の円錐管、10,000 × gで遠心する望ましくない大きい小胞または小さなアポトーシス小体をペレットへの 4 ° C で 40 分に再び上澄みを転送します。
   注:このペレットは、必要に応じてより大きい小胞の追加研究のため保存することができます。
8. 0.45 μ m のフィルターを通してきれいな 12 mL 遠心チューブに上清をデカントします。
   注:高密度線維化組織サンプルを簡単にフィルターされないことが。これらのサンプルを 40 μ m セル ストレーナー濾過し、0.45 μ m のフィルターを通してフィルタ リングする前に連続的に小さいサイズの針 (18 G、20 G、22 G) を通過できます。
9. 超小型 Ev をペレットへの 4 ° C で 2 時間 100,000 × gのサンプル。
10. 上清をデカントし、5-10 分、管の両側に残留液体を除去する頻繁にタップの逆遠心管を残します。残留液は、吸引真空ピペットを使用しても吸引することができます。
11. 再 0.25 M ショ糖バッファー (10 mM トリス、pH 7.4) の 1.5 mL で EV ペレットを中断します。この手順ではペレットの懸濁液における日時を確認することが重要です。これを行うには、ソリューションにボルテックス Ev 前にパラフィルムでチューブをカバーします。最終的な渦ミックス前に室温で 15 〜 20 分の超遠心機チューブをロックします。
12. 簡単に管の下で液体の懸濁液を回復する速度以上 1,000 x gでチューブを遠心分離機します。
13. グラデーション浄化手順に進むか、必要な場合は、一晩 4 ° C で EV を懸濁液を格納します。

2. 密度勾配浄化

1. 30 %iodixanol を含む最終的なソリューションを作成する Ev を含む 1.5 mL のショ糖/Tris バッファーに 60 %iodixanol (水の原液) 1.5 mL を追加します。ピペットを上下のソリューションを徹底的にミックスを数回。高 iodixanol の濃度は非常に粘性、ピペット チップのソリューションを失うことを避けるために慎重になります。
2. 5.5 mL 遠心管の底に EVs を含む 30 %iodixanol の緩衝液を転送します。
3. 60 %iodixanol のストック溶液から純水のサンプルあたりの 20%、10% の iodixanol ソリューションの少なくとも 1.5 mL を準備します。
4. 1.3 mL 20 %iodixanol と慎重に注射器、18 G 針を使用して下部のグラデーションのレイヤーの上にレイヤーを測定します。密度界面層の混合を避けるため、半月板のすぐ上遠心チューブの内側との接触針の傾斜面を維持し、滴下ソリューションを追加します。
5. 上記と同じテクニックを使用して 20 %iodixanol のレイヤーの上に 10 %iodixanol 溶液 1.2 mL をレイヤーします。
6. 慎重にバランスし、ローター バケツと 4 ° C で 50 分間 268,000 x gでスイング バケツの回転子の遠心遠心チューブに読み込む密度層の破壊を回避できる最低料金に遠心分離機の加速と減速の速度を設定します。
7. 密度勾配の端数 10 を 1 に対応する各サンプルの 10 1.5 mL 遠心チューブにラベルを付けます。分数 1 は、最初は削除され、10 の分数は最後に削除された最終留分中最上位の割合として指定されます。
8. 勾配の遠心が完了すると、優しくローター バケツからチューブを取り外し、安定したホルダーに置きます。小胞の目に見えるバンドはしばしば関心の割合で見られます。対応する管にピペットのグラデーションの上から 490 μ L の 10 シリアル分数。可能性が高い汚染タンパク質を含まれている管の下部に残った液体の少量があります。このサンプルは、破棄、または必要な場合、分数 11 として保持できます。
9. 糖度計を使用して分数の屈折を測定します。これは、サンプルの保全が必要な場合は、並列で実行制御グラデーションで実行できます。糖度計サーフェイス iodixanol を含む各画分の 20-30 μ L をピペットし、知られている iodixanol の密度に屈折を比較することによって密度を推定します。分数に格納できる一晩 iodixanol を含むソリューション次の遠心洗浄手順に進む前に必要な場合に注意してください。
10. きれいな 12 mL 遠心チューブに各画分を転送します。上下にゆっくりとピペッティングによりチューブとミックスにリン酸緩衝食塩水 (PBS; 137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10 mM ナ₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、pH 7.4) x 1 の 5 mL を追加します。
    注:サンプルに追加 PBS は、0.22 μ m のフィルターを通して滅菌 PBS をフィルタ リングし、塩の沈殿物を避けるために常温で保存することを確認パーティクル フリーする必要があります。
11. トップに追加の 6 mL の 1x PBS を追加し、再度慎重に混ぜます。
12. 超遠心機チューブ再ペレット小胞への 4 ° C で 2 時間 100,000 × gで。上清をデカントし、小胞タンパク質の解析 (ステップ 3) を溶解または形態学的解析 (ステップ 5) の EVs の再停止前に乾燥管をタップします。

3. 溶解とイムノブロット EV タンパク質の確認

注:全体小胞形態学的研究や生物学的活動のための保全が必要な場合、研究者はステップ 5 に直接進むことができます。最初の実験、または質量分析する前に、回復のすべての分数が分数の EV 蛋白質を確認するイムノブロットによって分析必要があります。

1. タンパク質解析用 EVs を分離、遠心チューブに EV ペレットにプロテアーゼ阻害剤の添加で強力な換散バッファー (5 %sds、10 ミリメートルの EDTA、120 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2.5 %2-メルカプトエタノール、8 M 尿素) の 40 μ L を追加します。
   注:非還元条件蛋白質の抗体の検出の場合は、2-メルカプトエタノール強力な換散バッファー内の純水に置き換えてください。
2. 遠心上パラフィルムを置くことによってペレットの懸濁液完了日時とバッファー内の EVs の換散を確保するチューブ、ボルテックス積極的に最終的な渦前に室温で 20 分間、ロッキングします。
3. 簡単に 30-60 のサンプル全体ボリュームを回復するため 1,000 x gで遠心分離機します。さらに処理までサンプルを新しい 1.5 mL 遠心チューブ、-80 ° C に-20 ° C でストアに転送します。
4. イムノブロット分析精製 lysates を準備するには、1 x の最終濃度のサンプルを 5 x Laemmli サンプル バッファー (10 %sds、250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL ブロモフェノールの青、0.5 M の DTT、50% のグリセロール、5 %2-メルカプトエタノール) を追加します。
   注:非還元条件が必要な場合は、純水で DTT や 2-メルカプトエタノールを置き換えます。
5. 全体組織ホモジネートのコントロールが必要な溶解、尿素を含む強い組織プロテアーゼ阻害剤と上記の換散バッファーの詳細、残りの細胞外マトリックス、細胞全体を破棄する 10 分間 10,000 × gで遠心分離またはそのまま細胞の残骸。1 x の最終濃度の組織ホモジネートに 5 x Laemmli サンプル バッファーを追加します。
6. 95 ° C、5-10 分で EV または組織ホモジネート サンプルを含むサンプル バッファーを沸騰し、等しいボリュームをロード (0.1 0.3 に相当から開始組織材料の g; EV の浄化された蛋白質の 1-2 μ g) 10 %sds ページのゲルに分数 1 10 の。組織ホモジネートの等しい質量をロードします。敏感抗体による検出のためのサンプルの大きいボリュームは必要かもしれない。
7. 以前詳細²¹ EV タンパク質精製の lysates を確認し、分数で EV 個体を比較するとゲル電気泳動、ウエスタンブロット解析を続行します。
   注:EV のタンパク質は、一貫性のある分数で再現性をもって実証されています、一度手順 2.12 で説明した最終的な遠心洗浄が関心のグラデーションの一部分に限られるかもしれない。

4. EV プロテインの定量

1. EV 蛋白質の定量法がさらに分析が必要な場合、洗剤と尿素対応の蛍光アッセイを使用 (材料の表を参照してください)。いくつかの蛍光アッセイが好ましい場合、このバッファーに (手順 2.12) の EV ペレットの直接溶解を促進する塩化物イオン サンプル バッファーに存在ブロモフェノールの青と互換性があるに注意してください。
2. 前述の蛍光を用いたタンパク質定量キットを使用すると、サンプルまたは標準の 1 μ L スポットが、少なくとも提供のフィルター紙の上を複製し、製造元の指示に従ってタンパク質定量を続けます。

5 EV 形態の特性

1. 手順 2.12 の最終的なの遠心分離を洗浄後全体小胞を調べるも、徹底的に再停止 EV ペレット粒子無料 1x PBS で。もはや処理するまで一週間以上のための 4 ° C で凍結融解サイクルを避けるために EVs をストアします。
   注:一貫して興味の一部分に形態学的解析を制限するイムノブロット解析による豊かな EV の蛋白質を含有する画分を確認している以前に有益です。
2. ナノ粒子の濃度と以前詳細²²として準備、小胞のサイズを決定するための全体の EV サンプルの分析を追跡を実行します。
3. EV の形態を評価し、必要な場合小胞の電子顕微鏡によるサイズ測定を確認します。EM グリッドは次のステップ 5.1²³, 小胞懸濁液から調製することができます。 または代わりに次の手順 2.12 ペレットからブロック準備²⁴として処理されます。

6. ゲルのトリプシンの消化力の精製と質量分析のため

1. 質量分析法による EV プロテオームの解析が必要な場合は、別の蛋白質を浄化しプレキャスト ポリアクリルアミドゲルに EVs を含む分数の等しい質量 (蛋白質の少なくとも 10 μ g) をロードします。メーカー供給の既製ゲル サンプルに導入されているタンパク質 (ケラチンなど) の汚染の可能性のレベルを減らすことが推奨されます。
2. ポリアクリルアミド ゲル蛋白質の浄化のために少なくとも 0.5 インチ サンプルを実行し、修正し、詳細²⁵で前述した Coomassie 染料で染色します。
3. トリプシンの消化力、以前詳細^19,26として³キューブ 1 mm にレーンをカットします。
4. 詳細¹⁶で指定されたパラメーターに従って質量分析法によるクロマトグラフィー-タンデム質量分析カラムとその後の分析の分離器に消化ペプチド試料の 5 μ L を読み込みます。

結果

組織解離、差動遠心分離および小胞のグラデーションの浄化の概要は、図 1に表示されます。グラデーション精製 EVs の形態学的及び肺浸潤の確認は、図 2でハイライトされます。再現可能な密度の 10-30 %iodixanol の勾配超遠心法を次の図が表示されます、上方に移行する 2 (光 Ev) の分数と割合 5 (密な Ev)、2 つの異なる小胞集...

ディスカッション

小型 Ev における器官形成、成熟と機能だけでなく、腫瘍微小環境におけるの役割に関して多くの科学的関心が生成されました。全体的にみて、この研究では、脳全体または腫瘍の標本からそのまま EVs の抽出最適化されたワークフローを提供します。このメソッドが簡単に適応のある小さな分泌小胞の ex vivo 評価さらに機会を提供する他の固体組織の仕事のためかもしれないここで肺腫瘍由?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm filter	VWR	28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057
anti-Alix antibody	Santa Cruz	sc-7129
anti-Calnexin antibody	Santa Cruz	sc-11397
anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
anti-CD81 antibody	Santa Cruz	sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody	Santa Cruz	sc-25507
anti-HSC70 antibody	Santa Cruz	sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody	Santa Cruz	sc-100336
anti-TSG101 antibody	Santa Cruz	sc-7964
EZQ protein quantification kit	ThermoFisher Scientific	R33200
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf	5820715006
FEI CM120 Electron Microscope	TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)	Genetex	27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78420
HALT protease inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	367280
NanoSight LM10	Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG	Genetex	26741
rabbit anti-mouse IgG	Genetex	26728
Refracto 30PX (refractometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor	Beckman Coulter	333790
Tabletop 5804R centrifuge	Eppendorf	22623508