전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

요약

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

초록

순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.

서문

작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이^1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. 빠르게 성장 하는 생물 의학 연구 질병 병 인에서 EVs의 중요성으로 재현 하 고 엄격한 격리와 이러한 vesicles의 정화에 대 한 방법을 개발에 병렬 관심을 생성 했다.

EV 특성에서 역사적이 고 현재 도전 못하는 작은 EV 모집단을 완전히 분리 되었습니다. 이 문제는 주로 통치 별개 소포 속 다른 분자 메커니즘의 우리의 제한 된 이해 예정 이다. 크기, 밀도, 그리고 생물 학적 화물 더 부분 모집단 사이 오버랩이 구분 convolutes. 이 과제의 일부 또한 널리 다른 농축 기술, 실험실, 걸쳐 격리 vesicles의 다운스트림 분석에 불일치를 제공 하 고 범주별 EV 인구를 밝히는 글로벌 노력을 훼손 사용 되었습니다.

그것은 대부분 EV 특성화의 플라스마, 소변을 포함 한 동물이 나 인간의 체액에서 소포를 분리 하는 기법을 설명 하는 더 최근의 vivo에서 연구 표면에 뜨는, 세포 배양의 생체 외에서 컬렉션에서 수행 되었습니다 협조할 그리고 타 액. EVs는 순환에 대량에서 존재, 그것은 또한 이러한 vesicles 셀 통신 이벤트에서 중요 한 역할을 하 고 세포 조직의 interstitium에 인식. 암의 맥락에서 중간 EVs는 특히 암 세포 시드 및 전이성 성장^14,15종양 microenvironment 변조에 중요 한 있을 수 있습니다. 따라서, 개발 및 단단한 조직 표본에서 소포를 추출 하는 기술의 최적화 값이입니다. 이러한 방법은 직접 연구 기관-수단을 제공할 것입니다 또는 종양에서 파생 된 EVs 작은 biopsies을 부분 또는 전체 기관 절제술을 포함 하 여 임상 표본에서 수확.

이 연구와 우리의 실험실¹⁶출판 이전 보고서 우리는 EV 농축 방법론에서 여러 주요 현재 문제를 해결 하고자: 1) 격리 하 고 현재 수준에 EVs를 정화 재현 기술을 설명 하 필드 확인 허용 작은 EV 모집단 endosomal에서 파생 된 exosomes;에 고도로 농축을 시도 2) 그리고 3) 더 특성을 위해 단단한 조직 표본에서 이러한 vesicles의 추출에 대 한 프로토콜을 제공 하.

최근, Kowal 및 동료 상대적으로 소규모 iodixanol 밀도 그라디언트 분리 및 정화 EV 모집단 비교 자당 밀도 기울기¹⁷보다 큰 효능을 설명 합니다. 매우 인용된 연구 수지상 세포 유래 EVs에 상대적으로 가벼운 밀도 분수, 1.1 g/mL의 조밀도와 일치 했다 endosomal 단백질이에 exosomes의 높은 비율로 가장 일관 된 것으로 농축 분수입니다. 저자에 따르면이 "진실한" exosomal 단백질 종양 민감성 유전자 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, 그리고 여러 annexin 단백질¹⁷포함. 우리는 나중에 성공 조직 분리 페레즈 곤잘레스 외¹⁸ 및 전체 두뇌 파생 EVs¹⁶을 후속 차등 원심 분리 프로토콜에서 설명 하는 방법에이 기술을 적응. 우리는 또한 우리의 실험실¹⁹설명한 기공을 단백질의 다운스트림 양적 및 비교 질량 분석에 대 한 순차적 프로토콜을 결합 하 여 EV proteomes 특성화에이 방법의 유틸리티를 설명 했다. 이 작품은 EVs 두뇌²⁰담당에서 농축 된 힐 연구소에서 그을 평행 시켰다.

이 연구에서 우리이 기술에 대해 자세히 설명 하 고 최근 우리의 실험실에서 고체 폐 종양에서 EVs의 격리에 게시 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 확장. 우리의 지식을 하려면이 ex vivo 종양 표본에서 EVs를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 설명 하기 위해 첫 번째 연구 이다. 새로운 진단 바이오 마커 및 tumorigenesis에서 그들의 역할 EVs에 광범위 한 관심을 감안할 때,이 방법은 가능성이 증명 과학 연구원의 성장 수에 중요 한. 임상의 관점에서 중간 EVs 더 평가 제한 됩니다 표본에서 특히 훌륭한 진단 가치를 항구 수 있습니다. 우리의 희망은 여기에 설명 된 방법 신선 또는 냉동 동물 또는 인간 수술 표본, 밝히기 위해서 질병 병 인에 중요 한 역할이 작은 미래의 일에 대 한 방법을 포장에서 EVs를 수확 하는 재현 기법에 대 한 기초를 제공할 것입니다. 소포를 재생할 수 있습니다.

프로토콜

전체 두뇌에서 기관 동물 사용 및 관리 위원회 (IACUC) 플로리다 주립 대학교의 승인을 획득 했다. 12 마우스 두뇌의 총 (각 연령 집단에서 두뇌를 3: 2, 4, 6, 및 8 개월) C57BL/6 J에서 배경 앞에서 설명한¹⁶EV 추출에 사용 되었다. 폐 종양 표본은 프로 리 다 농업과 기계적인 대학 IACUC의 승인 아래 박사 Mandip Sachdeva에 의해 아낌없이 기부 했다. 폐 종양은 인간의 선 암 세포 선 immunodeficient Balb/c 뉴/뉴 누드 쥐에서 성장 하는 H1975에서에서 파생 되었다. 2 대표적인 종양 복제에서 데이터는이 연구에는 강조 표시 됩니다.

참고: 기 격리 및 정화 방법의 개요 개요는 그림 1에 제공 됩니다.

1. 조직 분리 및 차등 원심 분리

1. 약 0.4-1.0 당 최대 절전 모드-전자 매체에서의 분리 버퍼 (papain 10 mg, 5.5 m m L-시스테인, 67 µ M 2-mercaptoethanol, 1.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 조직의 g. Note EV 농축 및 정화에 사용 되는 모든 솔루션 초순 필터링 된 물에 희석 한다.
2. 전체 신선 또는 냉동 조직 50 mL 원뿔 튜브에 분리 버퍼에 추가 하 고 품 어 따뜻한 물에 20 분 조직에 대 한 37 ° C에서 목욕 수 있습니다 잘라 부 화 하기 전에 작은 조각으로 필요한 경우.
3. 부 화, 따라 분리 버퍼를 포함 하는 조직에 최종 1 배 농도 대 한 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 합니다.
4. 느슨한 맞는 Dounce 균질 화기로는 조직 포함 된 솔루션을 부 어 하 고 부드럽게 샘플 당 약 30 느린 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리. 획 수 조직 일관성에 따라 조정할 수 있다.
5. 50 mL 원뿔 튜브 및 작은 세포와 나머지 섬유 또는 응집 조직 파편을 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기를 버퍼에 해리 전송 조직.
6. 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 작은 큰 세포질 파편 삭제 하 4 ° C에서 10 분 2000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 전송 합니다.
7. 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 원치 않는 큰 소포 또는 작은 apoptotic 몸 펠 렛을 4 ° C에서 40 분 10000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 다시 전송 합니다.
   참고: 원하는 경우 더 큰 소포의 추가 연구에 대 한이 펠 릿을 저장할 수 있습니다.
8. 0.45 μ m 필터를 통해 깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관으로는 상쾌한을 가만히 따르다.
   참고: 밀도가 거리 조직 샘플 쉽게 필터링 되지 않을 수 있습니다. 이러한 샘플 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 다음 0.45 μ m 필터를 통해 필터링 하기 전에 순차적으로 작은 바늘 (18g, 20g, 22 G) 통해 전달 될 수 있습니다.
9. Ultracentrifuge 작은 EVs를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에서 샘플.
10. 가만히 따르다는 상쾌한 고 5-10 분, 관의 측에 잔여 액체를 제거 하려면 자주 도청 거꾸로 ultracentrifugation 튜브를 둡니다. 또한 aspirating 진공 피 펫을 사용 하 여 잔여 액체를 발음 수 있습니다.
11. 다시 0.25 M 자당 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.4)의 1.5 ml EV 펠 릿을 일시 중단 합니다. 그것은이 단계에서 펠 릿의 전체 다시 정지를 보장 해야 합니다. 이렇게 하려면 솔루션에 EVs vortexing 전에 parafilm 튜브 커버. 바위 ultracentrifuge 관 최종 소용돌이 혼합 하기 전에 실 온에서 15-20 분.
12. 짧게 원심 관 튜브의 바닥에 액체 정지 복구 속도 이상의 1000 x g 에.
13. 다음, 그라데이션 정화 단계를 수행 하십시오 또는 필요한 경우, 저장 EV 정지 4 ° C에서 하룻밤.

2. 밀도 그라데이션 정화

1. 30 %iodixanol 포함 하는 최종 솔루션을 만드는 EVs를 들어 1.5 mL 자당/Tris 버퍼에 60 %iodixanol (재고 솔루션 물에서)의 1.5 mL를 추가 합니다. 최대 플라스틱 그리고 여러 번 솔루션을 철저 하 게 혼합. 높은 iodixanol 농도 아주 점성으로 피 펫 팁, 솔루션 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.
2. EVs는 5.5 mL ultracentrifugation 튜브의 하단에 포함 된 30 %iodixanol 버퍼 솔루션을 전송 합니다.
3. 적어도 1.5 mL 초순 물 60 %iodixanol 재고 솔루션에서 샘플 당 20%와 10 %iodixanol 솔루션의 준비.
4. 1.3 mL 20 %iodixanol 및 신중 하 게 18 G 바늘 주사기를 사용 하 여 그라디언트 레이어 위에 레이어를 측정 합니다. 혼합 밀도 인터페이스 레이어를 방지 하려면 바로 위에 초승달 모양 ultracentrifugation 튜브의 내부와 접촉 하 여 바늘의 경사를 유지 하 고 dropwise 솔루션을 추가 합니다.
5. 위와 같은 기법을 사용 하 여 20 %iodixanol 레이어 위에 10 %iodixanol 솔루션의 1.2 mL 레이어.
6. 신중 하 게 균형 및로 터 양동이 4 ° c.에 50 분 268,000 x g 에서 스윙 양동이 터 원심 분리기 ultracentrifugation 튜브 로드 최저 밀도 층의 혼란을 피하기 위해 허용 하는 원심 분리기의 가속 및 감속 속도 설정 합니다.
7. 밀도 기울기의 분수 1-10에 해당 하는 각 샘플에 대 한 10 1.5 mL microcentrifuge 튜브 라벨. 분수 1 먼저 제거 될, 분수 10 마지막 제거 바닥 분수는 최상위 부분으로 지정 됩니다.
8. 그라데이션 ultracentrifugation 완료 되 면로 터 양동이에서 튜브를 제거 하 고 안정적인 홀더에 부드럽게. 소포의 보이는 밴드는 종종 관심의 일부에서 볼 수 있습니다. 해당 튜브에 그라디언트 위쪽에서 490 µ L의 10 직렬 분수를 플라스틱. 적은 양의 단백질 오염 가능성이 있는 튜브의 하단에 남아 있는 유체 있을 것입니다. 이 샘플, 또는 원하는 경우 분수 11로 유지 될 수 있습니다.
9. 굴절 계를 사용 하 여 분수의 굴절율을 측정 합니다. 이 또한 샘플 보전이 필요한 경우 동시에 실행 제어 그라데이션으로 수행할 수 있습니다. 굴절 계 표면에 iodixanol를 포함 하는 각 분수의 20-30 µ L 플라스틱 고 굴절율 알려진된 iodixanol 밀도를 비교 하 여 밀도 추정. Note는 분수에에서 저장할 수 있습니다 하룻밤 iodixanol 포함 된 솔루션 다음 ultracentrifugation 세척 단계를 진행 하기 전에 필요한 경우.
10. 깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관에 각 분수를 전송 합니다. 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브를 혼합 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 137 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나₂HPO₄, 2mm KH₂포₄, pH 7.4 m) x 1의 5 mL를 추가 합니다.
    참고: PBS는 샘플에 추가 입자 무료 살 균 PBS 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 소금 강 수를 피하기 위해 실내 온도에 저장 하 여 보장 되어야 합니다.
11. 상단에 1 x PBS의 추가 6 mL을 추가 하 고 다시 신중 하 게 혼합.
12. Ultracentrifuge 다시 작은 소포를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에 튜브. 상쾌한 가만히 따르다 하 고 세포의 단백질 분석 (3 단계)에 대 한 소포 또는 형태 론 적 분석 (5 단계)에 대 한 EVs의 다시 정지 하기 전에 건조 튜브를 누릅니다.

3. 세포와 EV 단백질의 Immunoblot 확인

참고: Morphologic 특성 또는 생물 학적 활동에 대 한 전체 소포의 보존을 원하는 경우 연구자 5 단계로 바로 진행할 수 있습니다. 초기 실험, 또는 질량 분석 분석 하기 전에 복구 하는 모든 분수 immunoblot EV 단백질 분수를 확인 하 여 분석 합니다.

1. 단백질 분석에 대 한 EVs를 lyse, ultracentrifuge 튜브 펠 릿 EV protease 억제제의 추가 함께 강한 세포의 용 해 버퍼 (5 %SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris HCl pH 6.8, 2.5 %2-mercaptoethanol, 8 M 요소)의 40 µ L을 추가 합니다.
   참고: 경우 비 감소 상태는 단백질의 항 체 검출, 초순 2-mercaptoethanol 강한 세포의 용 해 버퍼에 대 한 대체 합니다.
2. 완전 한 다시-펠 릿의 펜션과 버퍼에 EVs의 세포는 ultracentrifugation 이상의 parafilm를 배치 하 여 보장 튜브, vortexing 적극적으로, 다음 마지막 소용돌이 전에 실 온에서 20 분 동안 락.
3. 짧게 30-60 s 전체 샘플 볼륨을 복구를 위한 1000 x g 에서 원심. 추가 처리까지 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를-20 ° C ~-80 ° C에 게 샘플을 전송 합니다.
4. 순화 lysates immunoblot 분석에 대 한 준비, 1 x의 최종 농도 대 한 샘플을 5 x Laemmli 샘플 버퍼 (10 %SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol 블루, 0.5 M DTT, 50% 글리세롤, 5 %2-mercaptoethanol)을 추가 합니다.
   참고: 비 감소 조건 바란다면 바꿉니다 DTT와 2-mercaptoethanol 초순.
5. 경우 전체 조직 homogenate 컨트롤은 원하는 lyse는 우 레 아-들어에 강한 조직 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제와 위에 상세한, 다음 10 분 남은 기질, 전체 셀 삭제에 대 한 10000 x g 에서 원심 또는 그대로 세포질 파편입니다. 1 x의 최종 농도 대 한 조직 homogenate를 5 x Laemmli 견본 버퍼를 추가 합니다.
6. EV 또는 조직 homogenate 샘플 5-10 분 동안 95 ° C에 포함 된 샘플 버퍼를 끓인 다음 동일한 볼륨 로드 (0.1-0.3의 상응에서 시작 조직 물자의 g; 순화 EV 단백질의 1-2 µ g) 10 %SDS-PAGE 젤으로 분수 1-10의. 조직 homogenate의 동등한 질량을 로드 합니다. 샘플의 큰 볼륨 덜 민감한 항 체에 의해 감지에 대 한 필요할 수 있습니다.
7. 젤 전기 이동 법 및 서쪽 오 점 분석 이전 상세한²¹ 순화 lysates의 EV 단백질을 확인 하 고 분수에 상대 EV 풍부 비교로 진행 합니다.
   참고: EV 단백질은 일관 된 분수에 reproducibly 입증 되었습니다, 일단 최종 ultracentrifugation 세척 단계 2.12에 설명 된 관심의 그라데이션 분수 제한 수 있습니다.

4. EV 단백질 정량화

1. EV 단백질의 중요 한 부 량 추가 분석을 위해 원하는 경우 세제 및 요소 호환 형광 기반 분석 결과 사용 하 여 ( 재료의 표참조). Note 일부 형광 기반 분석 Laemmli 샘플 버퍼, 선호 하는 경우이 버퍼에서 (에서 단계 2.12) EV 펠 릿의 직접 세포의 용 해를 촉진에 bromophenol 블루와 호환 됩니다.
2. 상기 형광 기반 단백질 정량화 키트를 사용 하는 경우 샘플 또는에 표준의 자리 1 µ L 적어도 제공된 필터 종이에 복제 그리고 단백질 정량화 제조업체의 지침에 따라 계속.

5입니다. EV 형태의 특성

1. 최종 원심 분리 단계 2.12에서 세척 후 전체 소포를 검사, 철저 하 게 다시 일시 중단 EV 펠 릿 1 입자 무료 x PBS에. 4 ° C에서 처리까지 1 주 보다는 더 이상 저장소 EVs freeze-thaw 주기를 피하기 위해
   참고: 지속적으로 관심의 분수 형태소 분석을 제한 하려면 immunoblot 분석에 의해 농축된 EV 단백질을 포함 하는 분수 확인 이전에 유리 하다.
2. 나노 입자 농도 이전 상세한²²로 준비, 소포의 크기를 결정 하기 위해 전체 EV 샘플 분석 추적을 수행 합니다.
3. EV 형태 특성화 고 크기 측정의 소포, 전자 현미경 필요한 경우 합니다. EM 격자 소포 정지 단계 5.1²³, 다음에서 준비 될 수 있다 또는 또는 블록 준비²⁴ 단계 2.12 따라 펠 릿에서 처리할 수 있습니다.

6.에서-정화와 트립 신 소화를 위한 젤 질량 분석 분석

1. 질량 분석에 의해 EV proteomes의 특성을 원하는 경우 분리 하 여 단백질 정화 프리 카스트 polyacrylamide 젤에 EVs를 포함 하는 분수의 동등한 질량 (단백질의 적어도 10 µ g)을 로드 합니다. 프리 카스트 젤 제조 업체 제공 샘플으로 소개 되 고 단백질 (예를 들어, 각 질) 오염 가능성의 수준을 줄이기 위해 선호 됩니다.
2. 단백질 정화의 polyacrylamide 젤으로 0.5 인치 이상 샘플을 실행 다음 수정 하 고 세부 사항²⁵에 앞에서 설명한 Coomassie 염료와 얼룩.
3. 잘라 레인 1 m m³ 큐브 이전 상세한^19,26으로 트립 신 소화에 대 한.
4. 세부¹⁶에 지정 된 매개 변수에 따라 질량 분석에 의해 분리 분석 및 이후 분석에 대 한 LC-MS/MS 계기를 소화 펩 티 드 샘플의 5 µ L를 로드 합니다.

결과

조직 분리, 차등 원심 분리 및 소포의 그라데이션 정화의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그라데이션 정화 EVs의 형태 론 적과 immunophenotypic 확인은 그림 2에 강조 표시 됩니다. 재현할 수 밀도의 10-30 %iodixanol 그라데이션 ultracentrifugation 다음 다이어그램 표시 됩니다, 분수 2 (빛 EVs) 및 분수 5 (밀도 EVs), 위쪽으로 마이그레이션 ?...

토론

많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm filter	VWR	28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057
anti-Alix antibody	Santa Cruz	sc-7129
anti-Calnexin antibody	Santa Cruz	sc-11397
anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
anti-CD81 antibody	Santa Cruz	sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody	Santa Cruz	sc-25507
anti-HSC70 antibody	Santa Cruz	sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody	Santa Cruz	sc-100336
anti-TSG101 antibody	Santa Cruz	sc-7964
EZQ protein quantification kit	ThermoFisher Scientific	R33200
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf	5820715006
FEI CM120 Electron Microscope	TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)	Genetex	27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78420
HALT protease inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	367280
NanoSight LM10	Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG	Genetex	26741
rabbit anti-mouse IgG	Genetex	26728
Refracto 30PX (refractometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor	Beckman Coulter	333790
Tabletop 5804R centrifuge	Eppendorf	22623508