Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Resumen

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Resumen

Intersticiales y circulantes unida a la membrana extracelulares vesículas pequeñas (EVs) representan un objetivo prometedor para el desarrollo de ensayos de nuevos biomarcadores diagnóstico o pronóstico y probablemente servir como actores importantes en la progresión de un vasto espectro de enfermedades. La investigación actual se centra en la caracterización de las vesículas segregadas de múltiples células y tipos de tejidos con el fin de mejor comprender el papel de EVs en la patogenia de condiciones incluyendo neurodegeneración, inflamación y cáncer. Sin embargo, globalmente consistente y reproducibles técnicas para aislar y purificar las vesículas permanecen en progreso. Por otra parte, apenas se describen los métodos de extracción de EVs de tejidos sólidos ex vivo . Presentamos un protocolo detallado para extraer pequeños EVs de interés de tejidos entero frescos o congelados, incluyendo a muestras de cerebro y tumor, para mayor caracterización. Demostramos la capacidad de adaptación de este método para múltiples análisis aguas abajo, incluyendo microscopía electrónica y caracterización de immunophenotypic de vesículas, así como cuantitativo spectrometry total de proteínas de EV.

Introducción

Pequeñas vesículas extracelulares (EVs) incluyen exosomas derivados de endosomal y microvesículas de membrana-arrojan pequeñas que son de amplio interés biomédico. EVs pequeño están compuestos por una heterogénea población de vesículas de membrana-limite 50-250 nm que contiene las proteínas biológicamente activas, lípidos y ácidos nucleicos que colectivamente se cree que desempeñan un papel importante en multitud de procesos de la enfermedad. Avance de la investigación ha implicado especialmente estas vesículas en neurodegenerativas y trastornos del prión, procesos infecciosos, condiciones autoinmunes o inflamatorias y el crecimiento del tumor y metástasis^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Investigación Biomédica de rápido crecimiento en la importancia de los vehículos eléctricos en la patogénesis de la enfermedad ha generado un interés paralelo en el desarrollo de métodos reproducibles y riguroso para el aislamiento y purificación de estas vesículas.

Un desafío histórico y actual en EV caracterización ha sido la imposibilidad de separar totalmente pequeñas subpoblaciones de EV. Este reto es en gran parte debido a nuestra limitada comprensión de los diferentes mecanismos moleculares que rigen la biogénesis de diferentes vesículas. Superposición de tamaño, densidad y carga biológica entre subpoblaciones más convolutes estas distinciones. Parte de este reto ha sido también el uso de ampliamente diferentes técnicas de enriquecimiento, proporciona inconsistencia en posteriores análisis de vesículas aisladas en laboratorios y socavando los esfuerzos mundiales para iluminar poblaciones EV categóricas.

Cabe destacar que la mayoría de los EV caracterización se ha realizado de la colección in vitro de cultivo celular sobrenadante, con estudios in vivo más recientes que describen técnicas para aislar las vesículas de fluidos corporales de animales o humanos, incluyendo plasma, orina y la saliva. Mientras que EVs están presente en grandes cantidades en circulación, también reconoció que estas vesículas desempeñan papeles importantes en eventos de comunicación célula a célula y están presentes en el intersticio de los tejidos celulares. En el contexto de cáncer, EVs intersticiales pueden ser particularmente importantes en la modulación del microambiente tumoral para el cáncer siembra y crecimiento metastático^14,15. Por lo tanto, es valor en el desarrollo y optimización de técnicas para extraer las vesículas de muestras de tejidos sólidos. Estos métodos proporcionarán un medio directamente estudiar órgano - o tumor derivado de EVs de muestras clínicas, incluyendo pequeñas biopsias y resecciones parcial o total del órgano.

En este estudio y en un informe anterior publicado por nuestro laboratorio¹⁶, apuntamos a las preocupaciones de varios principales actuales en la metodología del enriquecimiento de EV: 1) para describir una técnica reproducible para aislar y purificar EVs a los más altos estándares en la actualidad aceptado en el campo; 2) para intentar aislar pequeñas subpoblaciones EV altamente enriquecidas en exosomas derivados de endosomal; y 3) para proporcionar un protocolo para la extracción de estas vesículas de muestras de tejido sólido con el fin de más caracterización.

Recientemente, Kowal y colegas describieron un gradiente de densidad de iodixanol relativamente pequeños para separar y purificar EV subpoblaciones con mayor eficacia que el de gradientes de densidad de sacarosa comparable¹⁷. En el estudio citado, EVs derivados de células dendríticas capturadas en una fracción de densidad relativamente constante con una densidad de 1,1 g/mL, fueron altamente enriquecidos en proteínas endosomal creídas que es más consistente con una alta proporción de exosomas presente en este fracción. Según los autores, estas proteínas de "buena fe" exosomal incluyen el gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 y varias de las proteínas anexina¹⁷. Hemos adaptado más adelante esta técnica para tener éxito un método de la disociación del tejido descrito por Perez-Gonzalez et al¹⁸ y un protocolo posterior centrifugación diferencial para aislar todo derivado del cerebro EVs¹⁶. También hemos demostrado la utilidad de este método en la caracterización de proteomas EV combinando un protocolo secuencial descendente espectrometría cuantitativa y comparativa de proteína vesicular, descrita previamente por nuestro laboratorio¹⁹. Este trabajo en paralelo desde el laboratorio de Hill, en el cual se enriquecieron EVs de la corteza frontal del cerebro²⁰.

En este estudio, elaborar sobre esta técnica y ampliar la aplicación del protocolo recientemente publicado de nuestro laboratorio para el aislamiento de EVs de tumores sólidos de pulmón. A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio que describe un protocolo para enriquecer EVs de ex vivo especímenes de tumor. Dado el interés generalizado en EVs como nuevos biomarcadores diagnóstico y su papel en la tumorigénesis, este método probablemente resultará valioso para un número creciente de investigadores científicos. Desde una perspectiva clínica, EVs intersticiales podrían albergar gran valor diagnóstico, especialmente en muestras donde se limita la evaluación histologic. Nuestra esperanza es que el método descrito aquí proporcionará una base para una técnica reproducible cosecha EVs de frescos o congelados animales o humanos especímenes quirúrgicos, allanando el camino para el trabajo futuro a descubrir el importante papel en la patogénesis de la enfermedad estos pequeños las vesículas pueden jugar.

Protocolo

Cerebro entero se obtuvieron con la aprobación del uso Animal institucional y Comité de cuidado (IACUC) de la Universidad Estatal de Florida. Un total de doce cerebros de ratón (3 cerebros de cada grupo de edad: 2, 4, 6 y 8 meses) de un J C57BL/6 fondo fueron utilizados para la extracción de EV, como se describió anteriormente¹⁶. Especímenes de tumor de pulmón fueron generosamente donados por Dr. Mandip Sachdeva bajo aprobación de Florida agrícola y mecánica de la Universidad de IACUC. Tumores pulmonares se derivan de la línea celular de adenocarcinoma humano H1975 en ratones nude de inmunodeficientes Balb/c nu/nu. Datos de dos repeticiones de tumor representativas se destacan en este estudio.

Nota: Una descripción esquemática del método de aislamiento y purificación de vesícula se proporciona en la figura 1.

1. tejido disociación y centrifugación diferencial

1. Preparar 10 mL de tampón de disociación (10 mg de papaína 5,5 mM de L-cisteína 67 μm 2-Mercaptoetanol; 1,1 mM EDTA) en medio de Hibernate-E por aproximadamente 0.4-1.0 g de tejido. Tenga en cuenta que todas las soluciones utilizadas para la purificación y enriquecimiento de EV deben ser diluidas en agua ultrapura de filtrado.
2. Añadir tejido entero fresco o congelado a buffer de disociación en un tubo cónico de 50 mL e incubar en un agua caliente baño María a 37 ° C durante 20 min tejido se puede cortar en fragmentos más pequeños antes de la incubación si es necesario.
3. Después de la incubación, añadir inhibidores de proteasa y fosfatasa para una concentración final de 1 x en el búfer de disociación que contiene el tejido.
4. Vierta la solución que contiene el tejido en un homogeneizador de Dounce suelta de ajuste y disociar suavemente el tejido usando aproximadamente 30 movimientos lentos por muestra. El número de trazos puede ajustarse en base a la consistencia del tejido.
5. Tejido de transferencia disociada en tampón a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células y los restantes fragmentos de tejido fibroso o cohesivo.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL limpio y centrifugar a 2.000 x g por 10 min a 4 ° C de la pelotilla y desechar detritos celulares grandes.
7. Transferir nuevamente el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL limpio y centrifugar a 10.000 x g durante 40 min a 4 ° C para que sedimenten las vesículas más grandes no deseadas o cuerpos apoptóticos pequeño.
   Nota: Este pellet puede guardarse para un estudio adicional de vesículas más grandes si se desea.
8. Decantar el sobrenadante con filtro 0.45 μm en un tubo de 12 mL limpia ultracentrifugación.
   Nota: Las muestras de tejido denso fibrótico pueden no fácilmente filtradas. Estas muestras pueden ser filtradas a través de un tamiz de célula 40 μm, luego pasa a través de agujas pequeñas en serie (18 G, 20 G, 22 G) antes de pasar el filtro de 0.45 μm.
9. Ultracentrífuga la muestra a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para que sedimenten EVs pequeño.
10. Decantar el sobrenadante y dejar los tubos de ultracentrifugación invertidos durante 5-10 min., aprovechando con frecuencia para eliminar el líquido residual en los lados de los tubos. Líquido residual se puede aspirar con una aspiración vacío pipeta.
11. Vuelva a suspender los pellets de EV en 1,5 mL de tampón de sucrosa de 0.25 M (10 mM Tris, pH 7.4). Es importante asegurar la completa resuspensión de la pelotilla en este paso. Para ello, cubra los tubos con parafilm antes Vortex EVs en solución. Los tubos de la ultracentrífuga durante 15-20 min a temperatura ambiente antes de una mezcla final de vórtice de la roca.
12. Brevemente centrifugar los tubos a una velocidad no mayor de 1.000 x g para recuperar la suspensión líquida en la parte inferior del tubo.
13. Continúe con los pasos de purificación gradiente abajo, o si es necesario, almacenar EV suspensión a 4 ° C durante la noche.

2. purificación de gradiente de densidad

1. Añadir 1,5 mL de iodixanol 60% (solución stock en agua) en el búfer de sacarosa/Tris de 1,5 mL conteniendo EVs para crear una solución final que contiene 30% iodixanol. Pipeta para arriba y abajo varias veces para homogeneizar la solución. Tenga cuidado para evitar perder la solución en la punta de la pipeta, como el iodixanol alta concentración es bastante viscosa.
2. Transferir la solución de tampón 30% iodixanol con EVs para la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación de 5,5 mL.
3. Preparar por lo menos 1,5 mL de soluciones de iodixanol 20% y 10% por ejemplo en agua ultrapura de la 60% iodixanol solución.
4. Miden 1,3 mL de 20% iodixanol y cuidadosamente capa sobre la capa de degradado de fondo usando una jeringa y una aguja de 18 G. Para evitar mezclar las capas en la interfaz de densidad, mantener el bisel de la aguja en contacto con el interior del tubo de ultracentrifugación justo por encima del menisco y añadir la solución gota a gota.
5. Capa de 1,2 mL de solución 10% iodixanol encima de la capa de iodixanol 20% usando la misma técnica que el anterior.
6. Cuidadosamente el balance y cargar los tubos de ultracentrifugación en cubos de rotor y centrífuga de un rotor de columpio-cubo a 268.000 x g por 50 min a 4 ° C. Establecer las velocidades de aceleración y deceleración de la centrífuga en los tipos mínimos permitidos para evitar la interrupción de las capas de densidad.
7. Etiqueta de diez tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada muestra que corresponden a fracciones de 1 a 10 de la gradiente de densidad. Fracción 1 se designa como la fracción superior que primero desaparecerá, mientras que la fracción 10 es la fracción de fondo último eliminada.
8. Una vez terminada la ultracentrifugación en gradiente, suavemente Quite los tubos de los cubos de rotor y coloque en un soporte estable. A menudo se verá una visible banda de vesículas en la fracción de interés. Pipetear 10 fracciones seriales de 490 μl de la parte superior del gradiente en los tubos correspondientes. Habrá una pequeña cantidad de líquido restante en la parte inferior del tubo que contiene probablemente proteínas contaminantes. Esta muestra puede ser descarta, o conservada como fracción 11 si lo desea.
9. Medir los índices de refracción de fracciones utilizando un refractómetro. Esto también puede realizarse con un gradiente de control ejecutar en paralelo si es necesario la conservación de la muestra. Pipetear 20-30 μl de cada fracción contiene iodixanol sobre la superficie del refractómetro y estimar la densidad mediante la comparación de los índices de refracción para densidades de iodixanol conocido. Tenga en cuenta que fracciones se pueden almacenar durante la noche en la solución que contiene iodixanol si es necesario antes de proceder a la siguiente etapa de lavado de ultracentrifugación.
10. Transfiera cada fracción al tubo limpio 12 mL de ultracentrifugación. Añadir 5 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4) para el tubo y mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo.
    Nota: PBS ha añadido a las muestras debe estar libre de partículas, garantizada por filtrado de PBS estéril a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a temperatura ambiente para evitar la precipitación de sales.
11. Añadir un adicional 6 mL de 1 x PBS a la parte superior y otra vez la mezcla con cuidado.
12. Ultracentrífuga los tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para volver a pellets pequeñas vesículas. Decantar el sobrenadante y toque los tubos secos antes de lisis de vesículas para análisis de proteínas (paso 3) o re-suspensión de los vehículos eléctricos para análisis morfológico (paso 5).

3. lisis y confirmación del Immunoblot de proteínas EV

Nota: Si se desea la preservación de todas vesículas para la caracterización morfológica o actividad biológica, los investigadores pueden proceder directamente al paso 5. En los experimentos iniciales, o antes de análisis de espectrometría de masas, deben analizarse todas aquellas fracciones recuperadas por el immunoblot para confirmar fracciones con proteínas de la EV.

1. Para lyse EVs para análisis de proteínas, añadir 40 μl de tampón de lisis fuerte (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2.5% 2-Mercaptoetanol, urea de 8 M) con la adición de inhibidor de la proteasa a pellet de EV en tubo de ultracentrífuga.
   Nota: Si las condiciones no reductoras se desean para la detección de anticuerpos de proteínas, sustituir agua ultrapura para el 2-Mercaptoetanol en el buffer de lisis fuerte.
2. Asegurar la completa resuspensión del pellet y lisis de EVs en tampón colocando parafilm sobre la ultracentrifugación tubo Vortex vigorosamente, luego mecer por 20 min a temperatura ambiente antes de un vórtice final.
3. Centrifugar brevemente a 1.000 x g durante 30-60 s para recuperar el volumen de la muestra entera. Transferir la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL y conservar a-20 ° C a-80 ° C hasta el procesamiento posterior.
4. Preparación purificada lisados para el análisis de immunoblot, añadir 5 x Laemmli el tampón de muestra (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, azul de bromofenol de 1 mg/mL 0,5 M TDT, glicerol 50%, 5% 2-Mercaptoetanol) para las muestras a una concentración final de 1 x.
   Nota: Si se desean que las condiciones no reductoras, reemplace la TDT y 2-Mercaptoetanol con agua ultrapura.
5. Si todo tejido homogeneizado se desean que los controles, lisar el tejido en la urea que contiene fuerte tampón de lisis detallado arriba con inhibidor de la proteasa, luego centrifugar a 10.000 x g por 10 min, descartar el resto matriz extracelular, las células enteras, o detritos celulares intactas. Añadir 5 x Laemmli tampón para el homogeneizado de tejido para una concentración final de 1 x.
6. Hervir el tampón de muestra que contiene muestras de homogeneizado de tejido o EV a 95 ° C durante 5-10 min., luego un volumen igual de la carga (desde el equivalente de 0,1 a 0,3 g de a partir de material tejido, 1-2 μg de la proteína purificada de EV) de fracciones 1-10 en un gel de SDS-PAGE 10%. Carga igual masa de tejido homogeneizado. Mayor volumen de muestras puede ser necesaria para la detección de anticuerpos menos sensibles.
7. Proceda con el análisis de Western blot y electroforesis en gel de anteriormente detallada²¹ para confirmar las proteínas de la EV en los lisados purificadas y comparar la abundancia relativa de la EV en fracciones.
   Nota: Una vez que la proteína EV ha demostrado reproducible en fracciones constantes, el lavado de ultracentrifugación final descrito en paso 2.12 puede limitarse a gradiente fracciones de interés.

4. EV cuantificación de proteína

1. Utilizar un análisis basado en la fluorescencia compatibles con detergente y urea si sensible cuantificación de proteínas de EV es deseada para su posterior análisis (véase Tabla de materiales). Tenga en cuenta que algunos ensayos de fluorescencia son compatibles con el azul de bromofenol en Tampón Laemmli, facilitando la lisis directa de la pelotilla de EV (en paso 2.12) en este tampón si se prefiere.
2. Si se utiliza el kit de cuantificación de dicha proteína de fluorescencia, punto 1 μl de muestra o estándar en por lo menos duplicar en el papel filtro siempre y seguir cuantificación de proteína según las instrucciones del fabricante.

5. Caracterización de la morfología de EV

1. Para examinar todo vesículas después de la centrifugación final lavado en paso 2.12, cuidadosamente vuelva a suspender EV sedimento en partícula-libre 1 x PBS. Tienda de EVs a 4 ° C durante no más de una semana hasta el procesamiento para evitar ciclos de congelación-descongelación.
   Nota: Es beneficioso que previamente han confirmado constantemente que contiene proteína EV enriquecida por el análisis de immunoblot para limitar el análisis morfológicos a fracciones de interés fracciones.
2. Realizar nanopartículas seguimiento análisis sobre todo muestras de EV para determinar la concentración y tamaño de las vesículas en preparaciones, como anteriormente detallada²².
3. Caracterizar la morfología de EV y confirmar las mediciones de tamaño por microscopia electrónica de las vesículas, si lo desea. Rejillas de EM se pueden preparar de suspensiones de vesícula después paso 5.1²³, o alternativamente pueden procesarse como bloque preparados²⁴ de pellets siguiendo paso 2.12.

6. en gel de purificación y digestión de la tripsina para el análisis de espectrometría de masas

1. Si se desea caracterización de proteomas de EV por espectrometría de masa, carga igual masa (por lo menos 10 μg de proteína) de las fracciones que contienen EVs en un gel de poliacrilamida prefabricado para separar y purificar las proteínas. Geles premoldeados suministrado fabricante son las preferidas para reducir los niveles de proteínas (por ejemplo, queratina) en las muestras de contaminantes potenciales.
2. Ejecutar la muestra por lo menos 0,5 pulgadas en el gel de poliacrilamida para la purificación de la proteína, luego fijar y tinción con Coomassie tinte, como se ha descrito en detalle²⁵.
3. Cortar los carriles en 1 mm³ cubos para la digestión de tripsina, como anteriormente detallada^19,26.
4. Carga 5 μl de la muestra de péptido digerido en instrumento de LC-MS/MS para la separación en la columna analítica y análisis posterior por espectrometría de masas según los parámetros especificados en detalle¹⁶.

Resultados

Un Resumen esquemático de la disociación del tejido, centrifugación diferencial y gradiente purificación de vesículas se muestra en la figura 1. La confirmación morfológica e immunophenotypic de EVs purificada de gradiente se destaca en la figura 2. Muestra un diagrama de densidades reproducibles después de ultracentrifugación de la gradiente de iodixanol 10-30%, con dos poblaciones distintas vesículas migran hacia arri...

Discusión

Interés tanto científico se ha generado con respecto a los roles que EVS pequeño jugar en el microambiente del tumor, así como en función, maduración y desarrollo del órgano. En general, este estudio proporciona un flujo de trabajo optimizado para la extracción de EVs intactos de todo el cerebro o las muestras de tumor. Mientras que aquí simplemente se demuestra la aplicabilidad de esta técnica a pulmón tumor derivado de EVs, este método podría ser adaptado para el trabajo en otros tejidos sólidos, proporci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm filter	VWR	28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	344057
anti-Alix antibody	Santa Cruz	sc-7129
anti-Calnexin antibody	Santa Cruz	sc-11397
anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
anti-CD81 antibody	Santa Cruz	sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody	Santa Cruz	sc-25507
anti-HSC70 antibody	Santa Cruz	sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody	Santa Cruz	sc-100336
anti-TSG101 antibody	Santa Cruz	sc-7964
EZQ protein quantification kit	ThermoFisher Scientific	R33200
FA-45-6-30 rotor	Eppendorf	5820715006
FEI CM120 Electron Microscope	TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)	Genetex	27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78420
HALT protease inhibitor (100x solution)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernate E medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	367280
NanoSight LM10	Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	Sigma	D1556	60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG	Genetex	26741
rabbit anti-mouse IgG	Genetex	26728
Refracto 30PX (refractometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor	Beckman Coulter	333790
Tabletop 5804R centrifuge	Eppendorf	22623508