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Resumo

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Resumo

Circulantes e intersticiais pequenas membrana-limite extracelulares vesículas (EVs) representam alvos promissores para o desenvolvimento de ensaios de romance biomarcador de diagnóstico ou prognóstico e provavelmente servem como jogadores importantes na progressão de um vasto espectro de doenças. A pesquisa atual está focada na caracterização das vesículas secretada de várias células e tipos de tecido para melhor entendem o papel do EVs na patogênese das condições incluindo neurodegeneração, inflamação e câncer. No entanto, técnicas globalmente consistentes e reproduzíveis para isolar e purificar vesículas permanecem em andamento. Além disso, métodos para extração de EVs de tecido sólido ex vivo são raramente descritos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para extrair pequenas EVs de interesse de tecidos inteiros frescos ou congelados, incluindo amostras de cérebro e tumor, para caracterização mais. Vamos demonstrar a capacidade de adaptação desse método para múltiplas análises a jusante, incluindo microscopia eletrônica e caracterização imunofenotípica das vesículas, bem como, a espectrometria de massa quantitativa de proteínas EV.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) incluem CDDP-derivado exosomes e pequenas aumentada de membrana-galpão de amplo interesse biomédico. EVs pequenas são compostas por uma população heterogénea das vesículas de membrana-limite nm 50-250 contendo proteínas biologicamente activas, lípidos e ácidos nucleicos que coletivamente são acreditados para desempenhar um papel importante em uma infinidade de processos da doença. Fazer avançar a pesquisa implicou particularmente essas vesículas em neurodegenerativas e doenças de príon, processos infecciosos, condições auto-imunes ou inflamatórias e crescimento do tumor e metástases1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. crescendo rapidamente a investigação biomédica para a importância do EVs na patogênese da doença gerou interesse paralelo no desenvolvimento de métodos reprodutíveis e rigorosos para o isolamento e purificação dessas vesículas.

Um desafio histórico e atual na caracterização de EV tem sido a incapacidade de se separar totalmente pequenas subpopulações de EV. Este desafio é em grande parte devido à nossa compreensão limitada dos diferentes mecanismos moleculares que regem a biogênese de vesículas distintas. Sobreposição de tamanho, densidade e carga biológica entre subpopulações mais convolutes essas distinções. Parte desse desafio também tem sido a utilização de diferentes técnicas de enriquecimento, fornecendo inconsistência na análise a jusante das vesículas isoladas em laboratórios e minar o esforço global para iluminar categórica EV populações amplamente.

É interessante notar que a maioria dos EV caracterização foi realizada de coleção in vitro de cultura celular sobrenadante, com os mais recentes estudos in vivo, descrevendo técnicas para isolar vesículas de fluidos do corpo humanos ou animais, incluindo plasma, urina e saliva. Enquanto EVs estão presentes em grandes quantidades em circulação, é também reconhecer que essas vesículas desempenham um papel importante em eventos de comunicação célula a célula e estão presentes no interstício dos tecidos celulares. No contexto do câncer, EVs intersticiais podem ser particularmente importantes na modulação do microambiente do tumor para a célula cancerosa semeadura e crescimento metastático14,15. Consequentemente, há valor no desenvolvimento e otimização de técnicas para extrair vesículas de amostras sólidas. Estes métodos irão fornecer um meio para estudar diretamente órgão - ou tumor derivado de EVs colhidas amostras clínicas, incluindo pequenas biópsias e ressecções parciais ou totais do órgão.

Neste estudo e em um relatório anterior, publicado pelo nosso laboratório16, pretendemos abordar vários grandes preocupações atuais na metodologia de enriquecimento de EV: 1) para descrever uma técnica reprodutível para isolar e purificar EVs para os mais altos padrões atualmente aceitos no campo; 2) a tentativa de isolar pequenas subpopulações de EV altamente enriquecidas em CDDP-derivado exosomes; e 3) para fornecer um protocolo para a extração destas vesículas de espécimes de tecido sólido com a finalidade de caracterização mais.

Recentemente, Kowal e colegas descreveram um gradiente de densidade relativamente pequena escala iodixanol para separar e purificar EV subpopulações com maior eficácia do que a sacarose comparáveis de gradientes de densidade17. No estudo citado, EVs derivado de células dendríticas, capturados em uma fração de densidade relativamente leve, consistente com uma densidade de 1,1 g/mL, foram altamente enriquecidos em proteínas CDDP, acreditadas-se ser mais consistente com uma alta proporção de exosomes presentes neste fração. De acordo com os autores, estas proteínas "bona fide" exosomal incluíam gene de susceptibilidade de tumor 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e várias annexin proteínas17. Mais tarde, adaptamos essa técnica para conseguir um método de dissociação de tecido descrito por Perez-Gonzalez et al18 e um protocolo de centrifugação diferencial subsequente para isolar todo derivado do cérebro EVs16. Nós também demonstrou a utilidade desse método em caracterizando EV proteomes combinando um protocolo sequencial para jusante quantitativa e comparativa espectrometria de massa de proteína vesicular, anteriormente descrita por nosso laboratório19. Este trabalho que paralelo do laboratório da colina, em que EVs foram enriquecidos do córtex frontal do cérebro de20.

Neste estudo, podemos elaborar sobre esta técnica e alargar a aplicação do protocolo recentemente publicado de nosso laboratório ao isolamento de EVs de tumores de pulmão sólido. A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para descrever um protocolo para enriquecer EVs de ex vivo espécimes de tumor. Dado o interesse generalizado em EVs como novos biomarcadores de diagnósticos e seu papel na tumorigênese, esse método provavelmente irá ser valioso para um número crescente de pesquisadores científicos. Do ponto de vista clínica, EVs intersticiais poderiam abrigar grande valor diagnóstico, particularmente em espécimes onde a avaliação histológica é limitada. Nossa esperança é que o método descrito aqui irá fornecer uma base para uma técnica reprodutível a colheita EVs de frescos ou congelados humanas ou animais cirúrgicos espécimes, pavimentando o caminho para o futuro trabalho descobrir os papéis importantes na patogênese da doença estes pequenos vesículas podem jogar.

Protocolo

Todo cérebro foram obtido com a aprovação do uso institucional do Animal e cuidados Comissão (IACUC) da Universidade do estado da Flórida. Um total de doze cérebro de rato (3 cérebros de cada grupo de idade: 2, 4, 6 e 8 meses) de um J C57BL/6 fundo foram usadas para a extração de EV, como descrito anteriormente,16. Amostras de tumor de pulmão foram generosamente doadas pelo Dr. Mandip Sachdeva sob aprovação da Flórida agrícola e mecânica IACUC Universidade. Tumores de pulmão foram derivados a linhagem de células de adenocarcinoma humano H1975 cultivada em imunodeficientes Balb/c nu/nu camundongos. Dados de duas repetições de tumor representativos são destacados neste estudo.

Nota: Uma visão esquemática do método de isolamento e purificação de vesículas é fornecida na Figura 1.

1. tecido dissociação e centrifugação diferencial

  1. Prepare-se 10 mL de tampão de dissociação (10 mg de papaína 5,5 mM L-cisteína µM 67 2-Mercaptoetanol; 1,1 mM EDTA) médio e Hibernate-E por aproximadamente 0,4-1,0 g de tecido. Observe que todas as soluções utilizadas para purificação e enriquecimento de EV devem ser diluídas em água ultrapura filtrada.
  2. Adicione o tecido inteiro fresco ou congelado para buffer de dissociação em um tubo cónico de 50 mL e incubar em água morna e uma banho a 37 ° C por 20 min. de tecido pode ser cortado em fragmentos menores antes de incubação se necessário.
  3. Após a incubação, adicione inibidores de protease e fosfatase para uma concentração final de 1 x para o buffer de dissociação que contém o tecido.
  4. Despeje a solução contendo o tecido em um ajuste frouxo homogenizacao homogenizador e dissociar suavemente o tecido através de aproximadamente 30 movimentos lentos por amostra. O número de traços pode ser ajustado com base na consistência do tecido.
  5. Tecido de transferência dissociado em buffer para um tubo cônico de 50 mL e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para as células e fragmentos de tecido fibroso ou coesa restantes de Pelotas.
  6. Transferi o sobrenadante para um tubo cônico de 50ml limpo e centrifugar 2.000 x g por 10 min a 4 ° C, a pelota e descartar grandes restos celulares.
  7. Transferi novamente o sobrenadante para um tubo cônico de 50ml limpo e centrifugar 10.000 x g por 40 min a 4 ° C, a pelota indesejáveis vesículas maiores ou corpos apoptotic pequeno.
    Nota: Este sedimento pode ser salvos para estudo adicional das vesículas maiores se desejado.
  8. Decante o sobrenadante através de um filtro de 0,45 µm para um tubo de ultracentrifugação 12ml limpo.
    Nota: Amostras de tecido densamente fibróticas podem não ser facilmente filtradas. Estas amostras podem ser filtradas através de um filtro de célula 40 µm, então passadas através de agulhas serialmente menores (18 G, 20 G, 22 G) antes da filtragem através do filtro de 0,45 µm.
  9. Se a amostra a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C, a pelota pequenas EVs.
  10. Decante o sobrenadante e deixar os tubos de ultracentrifugação invertidos por 5-10 min, tocando frequentemente para remover o líquido residual nas laterais dos tubos. Líquido residual pode também ser aspirado usando uma pipeta de vácuo aspiração.
  11. Ressuspender o pellet EV em 1,5 mL de tampão de sacarose 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). É importante garantir a completa re-suspensão da pelota nesta etapa. Para fazer isso, cobrir os tubos com parafilm antes num Vortex EVs em solução. Agitar os tubos se por 15-20 min à temperatura ambiente antes de uma mistura de vórtice final.
  12. Brevemente centrifuga os tubos a uma velocidade não mais do que 1.000, x g para recuperar a suspensão líquida na parte inferior do tubo.
  13. Prossiga para as etapas de purificação gradiente abaixo, ou se necessário, armazenar EV suspensão a 4 ° C durante a noite.

2. densidade gradiente purificação

  1. Adicione 1,5 mL de iodixanol 60% (solução em água) para o buffer de sacarose/Tris de 1,5 mL contendo EVs para criar uma solução final contendo iodixanol 30%. Pipetar acima e para baixo várias vezes para homogeneizar a solução. Ser cauteloso para evitar perder a solução na ponta da pipeta, como a concentração elevada de iodixanol é bastante viscosa.
  2. Transferi a solução de reserva de 30% iodixanol contendo EVs para o fundo de um tubo de ultracentrifugação 5,5 mL.
  3. Prepare pelo menos 1,5 mL das soluções de iodixanol 20% e 10% por amostra em água ultrapura a partir da solução estoque de iodixanol 60%.
  4. Medir 1,3 mL de iodixanol 20% e, cuidadosamente, camada sobre camada gradient inferior usando uma seringa e uma agulha de 18 G. Evite misturar as camadas na interface de densidade, manter o bisel da agulha em contacto com o interior do tubo de ultracentrifugação, logo acima do menisco e adicionar a solução gota a gota.
  5. 1,2 mL de solução 10% iodixanol acima da layer iodixanol 20% usando a mesma técnica acima da camada.
  6. Cuidadosamente, equilibrar e carregar os tubos de ultracentrifugação em baldes de rotor e centrifugar em um rotor de balanço-balde a 268.000 x g durante 50 min a 4 ° C. Defina as velocidades de aceleração e desaceleração do centrifugador para as taxas mínimas permitidas para evitar a interrupção das camadas densidade.
  7. Etiqueta de dez tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para cada amostra a correspondem às frações 1 a 10 do gradiente de densidade. Fração 1 é designada como a fração de nível superior que será primeiro removida, enquanto a fração 10 é a fração de fundo última removida.
  8. Uma vez concluída a ultracentrifugação em gradiente, delicadamente, retirar os tubos do rotor baldes e coloque em um suporte estável. Uma banda visível das vesículas será muitas vezes vista na fração de interesse. Pipete 10 fracções seriais de 490 µ l da parte superior do gradiente para os tubos correspondentes. Haverá uma pequena quantidade de fluido restante na parte inferior do tubo que provavelmente contém proteínas contaminantes. Este exemplo pode ser descartado, ou mantido como fração 11, se desejado.
  9. Medir os índices de refracção de frações usando um refratômetro. Isso também pode ser realizada com um gradiente de controle se a conservação da amostra é necessária ser executado em paralelo. Pipetar 20-30 µ l de cada fração contendo iodixanol para a superfície de refratômetro e estimar a densidade, comparando os índices de refracção para densidades iodixanol conhecido. Observe que frações podem ser armazenadas durante a noite na solução contendo iodixanol se necessário antes de prosseguir para a próxima etapa de lavagem de ultracentrifugação.
  10. Transferi cada fração para um tubo de ultracentrifugação 12ml limpo. Adicione 5 mL de tampão fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mm KH2PO4, pH 7,4) de 1x para o tubo e misture pipetando lentamente acima e para baixo.
    Nota: PBS adicionado com as amostras deve ser isento de partículas, assegurada pela filtragem de PBS estéril através de um filtro de 0,22 µm e armazenar à temperatura ambiente para evitar a precipitação de sal.
  11. Adicionar um adicional de 6 mL de 1X PBS na parte superior e outra vez misturar cuidadosamente.
  12. Se os tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para re-pequenas vesículas de Pelotas. Decante o sobrenadante e toque os tubos secos antes da lise das vesículas para análise de proteínas (etapa 3) ou re-suspensão de EVs para análise morfológica (passo 5).

3. Lise e Immunoblot confirmação das proteínas EV

Nota: Se a preservação das vesículas toda para caracterização morfológica ou actividade biológica é desejada, pesquisadores podem prosseguir diretamente para o passo 5. Em experimentos iniciais, ou antes da análise de espectrometria de massa, todas as frações recuperadas devem ser analisadas por immunoblot para confirmar fracções com proteínas de EV.

  1. Para lyse EVs para análise de proteínas, adicione 40 µ l de tampão de Lise forte (5% SDS, 10 mM de EDTA, pH de 120 mM Tris-HCl 6,8, 2,5% 2-Mercaptoetanol, ureia 8m) com a adição de inibidor de protease para EV pelota em tubo se.
    Nota: Se as condições não-redução são desejadas para detecção do anticorpo de proteínas, substitua água ultrapura para 2-Mercaptoetanol no buffer de Lise forte.
  2. Garantir a re-suspensão completa da pelota e lise de EVs no buffer colocando parafilm sobre a ultracentrifugação do tubo, num Vortex vigorosamente, então balançando por 20 min em temperatura ambiente antes de um vórtice final.
  3. Brevemente, centrifugar a 1.000 x g durante 30-60 s para recuperar o volume da amostra inteira. Transferi a amostra para um tubo novo de microcentrifuga de 1,5 mL e loja a-20 ° C a-80 ° C até o processamento adicional.
  4. Para preparar lysates purificada para análise de immunoblot, adicione 5 x Laemmli tampão de amostra (10% SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL de bromofenol, 0,5 M DTT, glicerol 50%, 5% 2-Mercaptoetanol) para as amostras para uma concentração final de 1 x.
    Nota: Se as condições não-redução são desejadas, substitua a TDT e 2-Mercaptoetanol com água ultrapura.
  5. Se todo tecido homogeneizado controles são desejadas, lyse o tecido no ureia contendo forte do lysis detalhados acima com inibidor de protease, centrifugar a 10.000 x g por 10 min descartar o restante da matriz extracelular, células de toda, ou restos celulares intacto. Adicione o homogeneizado de tecido para uma concentração final de 1 x 5 amortecedor da amostra x Laemmli.
  6. Ferva o amortecedor da amostra contendo amostras de EV ou tecido homogeneizado a 95 ° C por 5-10 min, em seguida, carregar o volume igual (do equivalente a 0,1-0,3 g de tecido material começar; 1-2 µ g da proteína purificada do EV) de frações de 1-10 em um gel de SDS-PAGE 10%. Carregar uma massa igual de homogeneizado de tecido. Maior volume de amostras pode ser necessária para a deteção por anticorpos menos sensíveis.
  7. Proceda com a eletroforese em gel e análise ocidental do borrão anteriormente detalhada21 para confirmar o EV proteínas nos lysates purificados e comparar a abundância relativa de EV em frações.
    Nota: Uma vez EV proteína demonstrada reproducibly em frações consistentes, a lavagem de ultracentrifugação final descrita no passo 2.12 poderá ser limitada gradientes fracções de interesse.

4. quantificação de proteína EV

  1. Use um ensaio baseado em fluorescência de detergente e ureia-compatível com se sensível quantificação das proteínas EV é desejada para posterior análise (ver Tabela de materiais). Observe que alguns ensaios baseados em fluorescência são compatíveis com o azul de bromofenol presente na Laemmli sample buffer, facilitando a Lise direta da pelota de EV (em passo 2.12) nesse buffer se preferirem.
  2. Se for usado o kit de quantificação de proteína baseada em fluorescência acima mencionados, ponto 1 µ l de amostra ou padrão pelo menos duplicar o papel de filtro fornecido e continuar a quantificação da proteína de acordo com as instruções do fabricante.

5. Caracterização da morfologia de EV

  1. Para examinar toda vesículas após a centrifugação final Lave na etapa 2.12, completamente re-suspenda EV pelota em partícula livre 1X PBS. Loja EVs a 4 ° C, para não mais de uma semana até o processamento para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
    Nota: É benéfico para anteriormente confirmaram frações consistentemente proteicos enriquecido EV por immunoblot análise para limitar as análises morfológicas de fracções de interesse.
  2. Realize análise de rastreamento em toda EV amostras para determinar a concentração e tamanho das vesículas em preparações, como anteriormente detalhada22de nanopartículas.
  3. Caracterizar a morfologia EV e confirmar as medições de tamanho por microscopia electrónica de vesículas, se desejado. Grades EM podem ser preparados de suspensões de vesículas seguindo passo 5.123, ou alternativamente, podem ser processados como bloco preparações24 de pelotas 2.12 passo a seguir.

6. em-gel de purificação e digestão do Trypsin para análise de espectrometria de massa

  1. Se for desejada a caracterização de EV proteomes por espectrometria de massa, carrega massa igual (pelo menos 10 µ g de proteína) de frações contendo EVs em um gel de polyacrylamide pré-moldado para separar e purificar as proteínas. Geles de pré-moldado fornecidos pelo fabricante são preferidos para reduzir os níveis de potencial contaminar proteínas (por exemplo, a queratina) sendo introduzidas as amostras.
  2. Executar a amostra de pelo menos 0,5 polegadas para o gel de poliacrilamida para purificação de proteínas, em seguida, corrigir e mancha com corante Coomassie, conforme descrito em detalhe25.
  3. Corte as pistas em 1 mm3 cubos para a digestão de tripsina, como anteriormente detalhada19,26.
  4. Carrega 5 µ l de amostra digerida peptídeo em instrumento de LC-MS/MS para a separação na coluna analítica e posterior análise por espectrometria de massa de acordo com os parâmetros especificados em detalhe16.

Resultados

Uma visão esquemática da dissociação de tecido, centrifugação diferencial e gradiente purificação das vesículas é exibida na Figura 1. Morfológica e imunofenotípica confirmação da gradiente-purificado EVs é destacada na Figura 2. Um diagrama de densidades pode ser reproduzidos após ultracentrifugação do gradiente iodixanol 10-30% é mostrado, com duas populações distintas de vesículas migrando para cima a fra...

Discussão

Gerou-se interesse muito científico com relação os papéis que pequenos EVs jogar o microambiente do tumor, bem como na função, maturação e desenvolvimento do órgão. Em geral, este estudo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a extração de EVs intactas de todo o cérebro ou espécimes do tumor. Enquanto aqui estamos simplesmente demonstrar a aplicabilidade desta técnica para EVs derivado de tumor de pulmão, esse método poderia facilmente ser adaptado para trabalhar em outros tecidos sólidos, proporci...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores Obrigado Dr. Richard Nowakowski e os recursos da Flórida estado Universidade laboratório Animal para fornecer e cuidando de animais utilizados para desenvolver este protocolo, respeitosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e o Florida estado Universidade translacional Science Laboratory para assistência com o trabalho de espectrometria de massa utilizado para caracterização de vesículas a jusante, bem como a facilidade de FSU biológica ciência Imaging Resource para o uso do microscópio eletrônico de transmissão neste estudo. Finalmente, agradecemos o Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pela doação dos espécimes tumor utilizada no desenvolvimento deste método. Este estudo foi suportado por concessões do departamento de Florida de saúde Ed e Ethel Moore Alzheimer programa de pesquisa de doença atribuído a D.G.M. e J.M.O (6AZ11) e o National Cancer Institute dos National Institutes of Health, sob número de prêmio R01CA204621 atribuído a D.G.M.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm filterVWR28145-505
12 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter331372
5.5 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter344057
anti-Alix antibodySanta Cruzsc-7129
anti-Calnexin antibodySanta Cruzsc-11397
anti-CD63 antibodyAbcamab59479
anti-CD81 antibodySanta Cruzsc-9158
anti-Flotillin 2 antibodySanta Cruzsc-25507
anti-HSC70 antibodySanta Cruzsc-7298
anti-Syntenin-1 antibodySanta Cruzsc-100336
anti-TSG101 antibodySanta Cruzsc-7964
EZQ protein quantification kitThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 rotor Eppendorf5820715006
FEI CM120 Electron MicroscopeTSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)Genetex27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78420
HALT protease inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 swinging-bucket rotorBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge Beckman Coulter393315
Optima XE-100 ultracentrifugeBeckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass SpectrometerThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgGGenetex26741
rabbit anti-mouse IgGGenetex26728
Refracto 30PX (refractometer)Mettler Toledo51324650
S-4-104 rotorEppendorf5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket RotorBeckman Coulter333790
Tabletop 5804R centrifugeEppendorf22623508

Referências

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