乳腺辐照有机体的生长与表征

摘要

对小鼠乳腺发育的有机体进行辐照, 并对其进行评估, 以评估上皮特征和与免疫细胞的相互作用。辐照有机体可用于更好地评估细胞相互作用, 这可能导致肿瘤细胞在辐照正常组织中的招募。

摘要

从消化组织中提取的有机体是多细胞三维 (3D) 结构, 比细胞单层在体内条件下更有能力进行重述。虽然它们不能在体内完全模拟复杂性, 但它们保留了原始器官的一些功能。在癌症模型中, 有机体常用于研究肿瘤细胞的侵袭。该方案旨在开发和表征正常和辐照小鼠乳腺组织中的有机体, 以评估正常组织中的辐射反应。这些有机体可用于未来的体外癌症研究, 以评估肿瘤细胞与辐照有机体的相互作用。乳腺被切除, 照射到20戈, 并在胶原酶 VIII 溶液中消化。通过离心分化分离上皮性有机硅, 并在96好低粘附微板中制备三维有机生物。有机体表达了细胞角蛋白14的特征上皮标记。在共培养实验中观察到巨噬细胞与有机体的相互作用。该模型可用于研究肿瘤间质相互作用、免疫细胞浸润和在辐照微环境中巨噬细胞极化的研究。

引言

大约60% 的三重阴性乳腺癌 (TNBC) 患者选择保乳疗法 (BCT) 作为一种治疗形式 1。在这种治疗方式中, 含有部分乳房组织的肿瘤被切除, 周围的正常组织暴露在电离辐射下, 杀死任何残留的肿瘤细胞。治疗可减少大部分乳腺癌患者的复发;然而, 大约13.5% 的 TNBC 患者经历局部复发 2.因此, 研究辐射如何招募循环肿瘤细胞 (ctc) 将导致对局部复发^3,4的重要洞察。

先前的研究表明, 正常组织的辐射增加了不同类型^细胞的招募5。在 TNBC 的临床前模型中, 正常组织的照射增加了巨噬细胞, 随后肿瘤细胞被招募到正常组织⁵。免疫状态影响肿瘤细胞招募到辐照部位, 在免疫功能低下的受试者中观察到肿瘤细胞迁移。利用乳腺产生的有机体对这些相互作用进行复制, 可以通过显微镜和活细胞成像实时观察细胞迁移和细胞间质相互作用, 以确定辐射损伤在改变中的作用肿瘤细胞的行为。

小鼠乳腺组织已帮助阐明在乳腺发育的关键步骤。乳腺有机体是一种多细胞的三维结构, 是一种孤立的乳腺上皮, 大于 50μm^{6,7,8, 9},^10.使用原发上皮类固醇, Simian 等人评估了乳腺分枝的必要因素 7.Shamir 等人发现, 传播可以发生没有上皮间充质过渡, 提供了洞察转移级联⁸。从乳腺组织中生成和表征有机体的方法已确定 6,^11,12,13。然而, 据我们所知, 从乳腺中生长辐照有机体的方法还没有报道。一项生长和描述辐照有机体的协议将是重述辐射诱导的免疫和肿瘤细胞招募的关键一步。

本文报道了一种在低粘附微板中生长和表征辐照乳腺上皮细胞的方法, 这些微板上涂有一种支持球体形成的亲水性聚合物。这些有机体与巨噬细胞共同培养, 以检查免疫细胞浸润动力学。这项工作可以扩展到包括共培养有机体与脂肪细胞, 以重述乳房特征, 乳腺癌细胞可视化肿瘤细胞的招募, CD8 + T 细胞, 以研究肿瘤免疫细胞的相互作用。以前建立的协议可用于评估辐照有机体。早期的模型共同培养乳腺有机体和免疫细胞已经揭示了转移和传播的机制。德纳多等人发现, CD4 + T 细胞对肿瘤相关巨噬细胞的调节增强了乳腺腺癌^的转移表型14。共同文化模型也被用来阐明生物发展的机制。Plaks 等人阐明了 CD4 + T 细胞作为乳腺器官发生的下调节剂的作用¹⁵。然而, 我们的小组是第一个建立一个程序, 可视化正常的组织照射如何影响免疫细胞的行为。由于正常组织照射已被证明可以增强肿瘤细胞的吸收⁵, 这一方案可以进一步发展, 以分析肿瘤细胞行为如何被正常组织和细胞的照射改变, 从而使人们对肿瘤细胞的行为有了更大的了解。癌症复发。

研究方案

动物研究是根据范德比尔特大学动物护理和使用机构委员会批准的机构准则和议定书进行的。

1. 小鼠的制备和细胞采集 (改编自 Nguyen-ngkoc 等^人)

1. 牺牲胸腺 Nu/Nu 小鼠 (8-10 大) 使用 co2 窒息, 然后颈椎脱位。使用70% 的乙醇清洁皮肤。
2. 使用预先消毒的剪刀和钳子切除小鼠的腹部和腹股沟乳腺。切除前切除淋巴结。在无菌1x 磷酸盐缓冲盐水中冲洗 (PBS) (图 1x)。
3. 将其放置在15毫升的管中, 其中含有10毫升的 dulbecco 的改进型 eagle Media! 营养混合物 F12 (DMEM/f12), 用于运输。样品可以在4°c 下保存一夜, 也可以立即处理。继续冰上。
4. 使用铯源在20戈瑞度对样品进行辐照 (图 1b)。
5. 照射45分钟后, 将乳腺放在35毫米无菌细胞板中, 并用手术刀切碎 (图 1C,D)。与大约40冲程的薄荷, 直到组织放松和片断获得不大于约1毫米²在面积。
6. 在50毫升离心管中转移到胶原酶溶液中。胶原酶溶液包括 2 mg/mL 胶原酶 (见材料表)、2 mgml 胰蛋白酶、5% v/v 胎儿牛血清 (fbs)、5μgml 胰岛素和50μgml 庆大霉素 dmemm2 f12 培养基。每只鼠标使用10毫升胶原酶溶液。
7. 在37°c 的水浴中放置, 每10分钟涡流 30-60, 当胶原酶溶液混浊时, 消化完成 (图 1E,F)。
8. 在室温 (RT) 下, 以 450 x g的速度将消化后的溶液向下旋转10分钟。将观察到三个图层。上清液由脂肪组成, 中间层为水溶液, 底部为颗粒。颗粒会出现红色, 因为它是上皮细胞、单个间质细胞和红血球的混合物 (图 1g)。
9. 接触前所有移液器、移液器吸头和离心管, 并含有牛血清白蛋白 (BSA) 溶液。BSA 溶液包括 2.5 w/v BSA 在 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)。对于预涂布, 只需将 BSA 溶液添加到移液器尖端和管的内部即可。BSA 溶液可以重复使用, 但在每次实验之前都应进行无菌过滤。
10. 为了进行额外的回收, 将上清液转移到新鲜的 BSA 涂层15毫升管。移液器上下大力分散脂肪层。在 rt 以 450 x克离心 10分钟, 吸入上清液, 在试管中留下少量介质, 以避免吸气细胞颗粒。
11. 用原来的颗粒从管子中吸水层。
12. 将 DMMM/F12 的10毫升加入管中, 然后转移到第二管中。将移液器大力组合并重新悬挂两个颗粒。
13. 在 rt 以 450 x克离心 10分钟, 吸入上清液, 并在管中加入4毫升的 DMMC/F12。
14. 在悬浮液中加入40μl 脱氧核糖核酸酶 (DNase), 并在 rt. dnase 溶液中用 4 uml dnase 在 DMM/F12 中轻轻摇晃2-5。
15. 加入6毫升的 dmmmw f12, 并彻底加入移液器。在 RT 以 450 x g离心管10分钟。
16. 将上清液吸至 0.5 mL 标记。在 dmemmcaf12 10 毫升中进行再采样, 并对移液器进行彻底的重新部署。
17. 脉冲到 450 x g,达到这个速度后停止4秒。
18. 重复步骤1.16-1.17 三次, 通过离心分化净化有机体。颗粒现在应该是一个离白色的颜色, 只包括上皮有机体 (图 1h)。
    注: 还可以使用40μm 的无菌网过滤器对有机生物进行过滤。步骤1.16 后, 将含有有机物质的移液剂介质通过过滤器放入离心管中, 然后用5至10毫升的 dmemmof f12 介质冲洗。将滤清器翻转到新的50毫升离心管上。通过10毫升的 DMM/F12 介质通过, 走相反的方式冲洗掉任何视网膜。甲酸应包括有机体, 滤液应主要由基质细胞组成, 如果需要, 可丢弃或保存。

2. 测定密度和电镀有机生物

1. 在 dmemm:f12 10 毫升中再利用颗粒。彻底的移液器, 以创建一个均匀的解决方案。
2. 将50μl 转移到30毫米的培养皿中, 并在20x 的相反显微镜下观察。用一个统计计数器数出有机体的数量。
   注: 这里的移液器吸头一直使用, 最小直径为 457μm, 是播种的有机体直径的5-10 倍。对于2毫升或更大的体积转移 (例如, 步骤1.16 和 2.1), 请使用直径超过 1, 500μm 的血清学移液器。
3. 使用以下公式计算有机体密度:
   
   所需的密度为 1, 000个有机硅/, 以简化进一步稀释。如果密度太低, 离心机在 450 x g处 5分钟, 吸气介质。添加必要的培养基, 达到 1, 000个有机, 并彻底移液器, 以创建一个均匀的混合物。
   1. 为了在蛋白质基质中生长有机体, 在1型胶原蛋白中, 或在从恩格尔伯-霍尔姆-群鼠肉瘤中提取的基底膜中, 以1有机的浓度生长的种子有机体。在处理样品时, 要保持在冰上。
   2. 要冻结有机化合物, 请将所需的体积转移到单独的离心管中。以 450 x g的速度向下旋转 5分钟, 然后添加相同体积的 90% fbsse% DMSO。将有机生物重新注射, 然后再将其注入冰袋。转移到-80°c, 然后在一周内转移到液氮。
   3. 要解冻, 在37°c 的水浴中加热 1分钟, 以 450 x 克离心 5分钟, 然后吸吸冷冻介质。用无菌 DPBS 冲洗, 然后再离心。吸动 DPBS 并添加有机体培养基。
4. 将移液器 50μl (50份有机体) 放入低粘附板的每口井中 (图 1i)。
5. 加入150Μl 的有机介质, 使总工作体积达到 200μl. 有机介质由 DMM/F12 培养基中1% 的青霉素链状霉素和1% 的胰岛素-转铁素硒 (ITS) 组成。
6. 每2天小心更换一次媒体。
   注: 低附着力板不进行组织培养治疗;因此, 细胞可以很容易地分离。通过倾斜板并将移液器尖端插入每口井的边缘, 慢慢地吸引介质。在井底留下少量的介质。慢慢添加新介质, 以避免对有机化合物施加不必要的剪切力。

3. 与巨噬细胞共培养

1. 在 DMEM 介质中保持 GFP 或 dtomato 标记为 RAW 264.7 巨噬细胞, 辅以10% 的 FBS 和1% 的青霉素链霉素。种子 1 x^{10 4,}5 x^{10 4,}或 1 x 10^{5 细胞}/培养基进入有机体介质。
2. 使用活细胞相对比和荧光成像来监测巨噬细胞随着时间的推移浸润。

4. 有机生物的免疫荧光染色

注: 有机体可以在低粘附井中染色, 也可以转移到室内滑块中。要转移, 轻轻地向上和向下移液器, 直到有机体已从板分离。转移到室内滑块和孵育 4-8, 以允许有机体粘附在板表面。

1. 通过小心吸气从井中去除有机介质。用10% 中性缓冲福尔拉林修复样品15分钟。
2. 在 1次 PBS 中清洗 3x 5分钟。如果需要, 固定样品可以在4°c 下保存一周, 以便进一步染色。
3. 与 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-四甲基丁基) 苯基-聚乙二醇渗透5分钟。
   注: 要对 f-肌动蛋白进行染色, 用丁醇稀释的 phalloidin 样品在 1% pbs\ bsa 中, 在 RT 中使用1% 的 pbs\ bsa 进行孵育。然后, 继续执行步骤4.8。
4. 与 0.5 pbs 的贝美米比化。样品可以存储在4层图像和免疫荧光图像中。在 0.1% pbs\ 聚乙二醇单色酯 (PBST) 中, 用5% 的正常山羊血清对 CTC 锁有影响的机制, 在 RLOCK. 用 PBS 清洗 3x 5分钟。
5. 用抗细胞角蛋白14稀释 1:1000, E-Cadherin 稀释 1:200, 或紧密连接蛋白1稀释1:200 在 1% NSS 在 PBST 1 h 在 rt. 3 x 5分钟在 PBST。
6. 用山羊抗兔二次稀释1:200 与 1% ngscpbst 在 RT. 盖子用铝箔进行 1小时, 以避免光线照射。
7. 在 PBS 中清洗 3x 5分钟。使用核染料 (见材料表) 来染色核。
8. 在 PBS 中清洗 3x 5分钟。如果使用室内滑动, 则安装盖板。在4°c 下用铝箔包裹2周。

结果

从小鼠乳腺成功地获得辐照上皮乳腺有机体, 并在低粘附板上进行处理和培养 (图 1)。在不同生长环境下通过播种测试了有机产量 (图 2A-G)。将细胞直接播种到经过10厘米的细胞板上, 导致成纤维细胞过度生长。在与有机体相同的病灶平面内或附近的相对照显微镜下, 对成纤维细胞进行了鉴定, 并在几天内迅速从镀金有机体中生长出来。在基底膜和胶原蛋白基质中播...

讨论

在该协议中, 我们开发了一种用于辐照乳腺有机体的可重复生长和表征的方法 (图 1)。应用20戈的辐照剂量来反映以前肿瘤细胞招募⁵的体内模型。在有机体形成之前的体内乳腺照射允许分离辐射损伤效应, 而不会相应的免疫细胞浸润。体外辐照正常组织模型的开发使人们能够实时观察可能导致辐射诱导的 ctc 招募^11,12

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokeratin 14	abcam	ab181595	Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagen Type I	Corning	354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Lot: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150077	green Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150080	red Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher	15140122
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)	Sigma	P1379-100ML