Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Resumo

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Resumo

Os organóides derivados do tecido digerido são construções tridimensionais multicelulares (3D) que melhor recapitulam as condições in vivo do que as monolayers celulares. Embora não possam modelar completamente a complexidade in vivo, mantêm alguma funcionalidade do órgão original. Em modelos de câncer, os organóides são comumente usados para estudar a invasão de células tumorais. Este protocolo tem como objetivo desenvolver e caracterizar organóides do tecido mamário do camundongo normal e irradiado para avaliar a resposta à radiação em tecidos normais. Estes organoids podem ser aplicados aos estudos in vitro futuros do cancro para avaliar interações da pilha do tumor com organoids irradiados. As glândulas mamárias resected, irradiadas a 20 GY e digeridas em uma solução do colagenase VIII. Os organoids epithelial foram separados através da diferenciação centrífuga, e os organoids 3D foram desenvolvidos em microplates da baixo-adesão do 96-well. Os organoids expressaram o marcador epithelial característico Cytokeratin 14. A interação dos macrófagos com os organóides foi observada em experimentos de cocultura. Este modelo pode ser útil para o estudo de interações tumor-estromal, infiltração de células imunes e polarização de macrófagos dentro de um microambiente irradiado.

Introdução

Aproximadamente 60% dos pacientes com câncer de mama triplo negativo (TNBC) escolhem a terapia conservadora da mama (BCT) como forma de tratamento¹. Nesta modalidade do tratamento, o tumor que contem a parte do tecido do peito é removido, e o tecido normal circunvizinho é exposto à radiação ionizante para matar todas as pilhas residuais do tumor. O tratamento reduz a recorrência em grande parte da população de câncer de mama; Entretanto, aproximadamente 13,5% dos pacientes tratados com TNBC experimentam recidivas locoregionais². Portanto, estudar como a radiação pode recrutar células tumorais circulantes (CTCs) levará a importantes insights sobre a recorrência local^3,4.

O trabalho precedente mostrou que a radiação do tecido normal aumenta o recrutamento de vários tipos da pilha⁵. Em modelos pré-clínicos de TNBC, a irradiação do tecido normal aumentou o macrófago e subseqüentemente o recrutamento da pilha do tumor aos tecidos normais⁵. O estado imunológico influenciou o recrutamento de células tumorais a sítios irradiados, com migração de células tumorais observada em indivíduos imunocomprometidos. Recapitulando essas interações usando organóides derivados de glândulas mamárias permitirá a observação da migração celular e interações célula-stromal em tempo real com microscopia e imagens de células vivas para determinar o papel de dano de radiação na alteração comportamento de células tumorais.

Os organóides mamários do camundongo ajudaram a elucidar passos importantes no desenvolvimento da glândula mamária. Um organóide mamário é um construto tridimensional multicelular de epitélio mamário isolado que é maior que 50 μm^6,7,^8,9,10. Usando organóides epiteliais primários, Simian et al. avaliaram os fatores necessários para a ramificação na glândula mamária⁷. Shamir et al. descobriram que a disseminação pode ocorrer sem uma transição epitelial para mesenquimal, proporcionando uma visão da cascata metastática⁸. Os métodos para a geração e caracterização de organóides do tecido da glândula mamária estão bemestabelecidos^6,11,^12,13. Entretanto, a nosso conhecimento, os métodos para crescer organoids irradiados das glândulas mamária não foram relatados. Um protocolo para o cultivo e a caracterização de organóides irradiados seria um passo crítico na recapitulação do recrutamento de células imunes e tumorais induzidas por radiação.

Neste trabalho, nós relatamos um método para crescer e caracterizar os organoids epithelial mamária irradiados em microplates baixos da adesão revestidos com um polímero hidrófilo que apoie a formação de spheroids. Esses organóides foram cocultivados com macrófagos para examinar a cinética de infiltração de células imunológicas. Este trabalho pode ser estendido para incluir os organoids coculturing com pilhas adiposas para recapitular características mamária, pilhas do cancro da mama para visualizar o recrutamento da pilha do tumor, e CD8 + pilhas de T para estudar interações tumor-imunes da pilha. Protocolos previamente estabelecidos podem ser utilizados para avaliar organóides irradiados. Os modelos mais adiantados que cocultivam organoids mamária e pilhas imunes derramaram a luz em mecanismos da metástase e da disseminação. DeNardo et al. verificaram que a regulação da célula T CD4 + de macrófagos associados ao tumor aumentou um fenótipo metastático de adenocarcinomas mamários¹⁴. Modelos de cocultura também têm sido utilizados para elucidar mecanismos de desenvolvimento biológico. Plaks et al. esclareceram o papel das células T CD4 + como reguladores da organogênese mamária¹⁵. Entretanto, nosso grupo é o primeiro a estabelecer um procedimento de Visualizar como a irradiação normal do tecido influencia o comportamento da pilha imune. Porque a irradiação normal do tecido foi mostrada para realçar o recrutamento da pilha do tumor⁵, este protocolo pode mais ser desenvolvido para analisar como o comportamento da pilha do tumor é alterado pela irradiação do tecido e das pilhas normais, conduzindo a uma compreensão maior de recorrência do cancro.

Protocolo

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade Vanderbilt.

1. preparação de camundongos e aquisição de células (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Sacrifique ratos de nu/nu atímicos (8-10 semanas velho) usando a asfixia de co₂ seguida pela deslocação cervical. Limpe a pele com 70% de etanol.
2. Resect glândulas mamárias abdominais e inguinais de camundongos usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps. Remover linfonodos antes da ressecção. Enxaguar em soro fisiológico com tampão 1x estéril (PBS) (Figura 1a).
3. Coloque-o em tubos de 15 mL com 10 mL de Dulbecco ' s Modified Eagle Media/nutriente mistura F12 (DMEM/F12) para transporte. As amostras podem ser mantidas durante a noite a 4 ° c ou processadas imediatamente. Mantenha no gelo.
4. Irradiam amostras a 20 GY utilizando uma fonte de césio (Figura 1b).
5. 45 min após a irradiação, coloque as glândulas mamárias em uma placa celular estéril de 35 mm e mince com bisturis (Figura 1C, D). Mince com aproximadamente 40 cursos até que o tecido relaxa e as partes são obtidas que não são maiores do que aproximadamente 1 milímetro² na área.
6. Transferir para a solução de colagenase num tubo centrífugo de 50 mL. A solução de colagenase consiste em 2 mg/ml de colagenase (ver tabela de materiais), 2 mg/ml de tripsina, 5% v/v de soro bovino fetal (FBS), 5 μg/ml de insulina e 50 μg/ml de gentamicina em meios DMEM/F12. Use solução de colagenase de 10 ml por rato.
7. Coloc em um banho de água em 37 ° c, vortexing cada 10 minutos para 30-60 min. a digestão está completa quando a solução de colagenase está turva (Figura 1e, F).
8. Gire para baixo a solução digerida em 450 x g por 10 minutos à temperatura ambiente (RT). Três camadas serão observadas. O sobrenadante é composto de gordura, a camada média é uma solução aquosa, e o fundo é um pellet. O pellet aparecerá vermelho, pois é uma mistura de células epiteliais, células estromais individuais e glóbulos vermelhos (Figura 1G).
9. Precoat todas as pipetas, pontas da pipeta, e tubos de centrifugação com a solução da albumina de soro bovina (BSA) antes do contato. A solução de BSA consiste em 2,5 w/v% BSA no fosfato tamponado salina de Dulbecco (DPBS). Para o pre-revestimento, adicione simplesmente então remova a solução de BSA ao interior da ponta e dos tubos da pipeta. A solução de BSA pode ser reutilizada, embora deva ser filtrada estéril antes de cada experimento.
10. Para recuperação adicional, transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mL revestido de BSA fresco. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente para dispersar a camada de gordura. Centrifugue a 450 x g durante 10 min a RT. Aspire o sobrenadante, deixando uma pequena quantidade de meios de comunicação no tubo para evitar aspirar o pellet celular.
11. Aspirar a camada aquosa do tubo com o pellet original.
12. Adicione 10 mL de DMEM/F12 ao tubo com o pellet original e transfira para o segundo tubo. Pipetar vigorosamente para combinar e suspender as duas Pelotas.
13. Centrifugue a 450 x g durante 10 min a RT. aspirar o sobrenadante e adicionar 4 ml de DMEM/F12 ao tubo.
14. Adicionar 40 μL de desoxirribonuclease (DNase) à suspensão e agitar suavemente à mão durante 2-5 min na solução RT. DNase consiste em 4 U/mL DNase em DMEM/F12.
15. Adicione 6 mL de DMEM/F12 e pipeta completamente. Centrifugue o tubo a 450 x g durante 10 min em RT.
16. Aspirar sobrenadante à marca de 0,5 mL. Resuspend em 10 mL de DMEM/F12 e pipeta completamente.
17. Pulse para 450 x g e Stop 4 s depois de atingir essa velocidade.
18. Repita as etapas 1.16-1.17 mais três vezes para purificar organóides através de diferenciação centrífuga. A pelota deve agora ser uma cor off-White consistindo apenas de organóides epiteliais (Figura 1h).
    Nota: os organóides também podem ser filtrados usando filtros estéreis de malha 40 μm. Após a etapa 1,16, os meios de pipetas contendo organóides através de um filtro em um tubo de centrífuga e, em seguida, enxaguar com 5 a 10 mL de mídia DMEM/F12. Vire o filtro sobre um novo tubo centrífugo 50 mL. Passe 10 mL de mídia DMEM/F12 através de, indo o caminho oposto para enxaguar qualquer retentado. O retentado deve consistir nos organoids, e o filtrado deve consistir principalmente das pilhas stromal, que podem ser descartadas ou mantidas se desejadas.

2. determinando a densidade e o chapeamento organoids

1. Resuspend pellet em 10 mL de DMEM/F12. Pipeta completamente para criar uma solução homogênea.
2. Transfira 50 μL para um prato de Petri de 30 mm e vista um microscópio de contraste de fase a 20x. Conte o número de organóides com um contador de contagem.
   Nota: aqui as pontas da pipeta foram usadas consistentemente com um diâmetro mínimo de 457 μm, que é 5-10 vezes o diâmetro dos organoids que são semeados. Para a transferência de volumes de 2 mL ou maiores (por exemplo, etapas 1,16 e 2,1), use Pipetas sorológicas com diâmetros de ponta superiores a 1.500 μm.
3. Calcule a densidade organóide usando a seguinte equação:
   
   A densidade desejada é 1.000 organóides/mL para simplificar a diluição. Se a densidade for muito baixa, centrifugue a 450 x g por 5 min e aspirar a mídia. Adicionar meios necessários para alcançar 1.000 organoids/mL, e pipeta completamente para criar uma mistura homogênea.
   1. Para cultivar organóides em uma matriz proteica, organóides de sementes em uma concentração de 1 organóide/L em colágeno tipo 1 diluído a 87% ou na membrana basal extraída do sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm mouse. Ao trabalhar com amostras, mantenha no gelo.
   2. Para congelar organóides, transfira o volume desejado para um tubo de centrífuga separado. Girar para baixo em 450 x g por 5 min. aspirar mídia e, em seguida, adicione o mesmo volume de 90% FBS/10% DMSO. Resuspend os organoids, e então alíquota em cryotubes. Transferência para-80 ° c, e depois para nitrogênio líquido dentro de uma semana.
   3. Para descongelar, aqueça em um banho de água de 37 ° c para um minuto. Centrifugue em 450 x g por 5 minutos, e então aspirar meios congelantes. Enxague com DPBS estéril e, em seguida, centrifugue novamente. Aspirar DPBS e adicionar meios organóides.
4. Pipetas 50 μL (50 organóides) em cada poço da placa de baixa aderência (Figura 1I).
5. Adicionar 150 μL de meios organóides para trazer o volume de trabalho total para 200 μL. a mídia Organóide consiste de 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS) em DMEM/F12 Media.
6. A cada 2 dias substitua a mídia com cuidado.
   Nota: as baixas placas da adesão não são cultura do tecido tratada; Portanto, as células podem ser facilmente separadas. Aspirar a mídia lentamente inclinando a placa e inserindo a ponta da pipeta na borda de cada poço. Deixe uma pequena quantidade de mídia no fundo do poço. Adicionar novas mídias lentamente para evitar a aplicação de forças de cisalhamento desnecessárias para organóides.

3. coculturação com macrófagos

1. Manter GFP ou dTomato-rotulados RAW 264,7 macrófagos em DMEM mídia suplementada com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Semente 1 x 10⁴, 5 x 10⁴, ou 1 x 10⁵ células/ml em meios organóides.
2. Use contraste de fase de células vivas e imagens fluorescentes para monitorar a infiltração de macrófagos ao longo do tempo.

4. coloração de imunofluorescência de organóides

Nota: os organóides podem ser manchados em poços de baixa aderência ou podem ser transferidos para lâminas de câmara. Para transferir, pipetar suavemente para cima e para baixo até que os organóides descolaram das placas. Transferência para lâminas de câmara e incubar para 4-8 h para permitir que organóides aderir à superfície da placa.

1. Retire o meio organóide dos poços cuidadosamente aspirando. Fixar amostras com formalina tamponada neutra a 10% por 15 min na RT.
2. Lave 3x 5 min em PBS 1x. Se desejado, as amostras fixas podem ser armazenadas em 4 ° c por uma semana para uma coloração mais adicional.
3. Permeabilize com 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetrametilbutilo) fenil-polietileno glicol por 5 min.
   Nota: para mancha de F-Actina, incubar amostras com faloidina diluído 1:1000 e 1,67 nm de corante nuclear bisbenzimide em PBS 1%/BSA para 1 h em RT. Em seguida, avance para o passo 4,8.
4. Bermeabilize com 0.5 PBS. As amostras podem ser armazenadas em imagens 4opy e imagens imunofluorescentes. mecanismos que contribuem para rlock CTC com soro de cabra normal de 5% em 0,1% PBS/polietileno glicol monolaurato de sorbitano (PBST) por 1 h em RT. Lave 3x 5 min com PBS.
5. Incubar com o anti-Cytokeratin 14 diluído 1:1000, E-cadherin diluiu 1:200, ou a proteína apertada da junção uma diluiu 1:100 em 1% NGS em PBST para 1 h no RT. Lave 3x 5 min em PBST.
6. Incubar com cabra anti-Rabbit secundário diluído 1:200 com 1% NGS/PBST para 1 h na RT. Cubra com folha para evitar a exposição à luz.
7. Lave 3x 5 min em PBS. Use o corante nuclear (ver tabela de materiais) para manchar os núcleos.
8. Lave 3x 5 min em PBS. Se estiver usando a corrediça da câmara, monte com uma lamínula. Armazene envolvido na folha em 4 ° c por até 2 semanas.

Resultados

Os organóides mamários epiteliais irradiados foram obtidos com sucesso de glândulas mamárias de camundongo, processadas e cultivadas em placas de baixa adesão (Figura 1). A produção de organóides foi testada por semeadura em diferentes ambientes de crescimento (Figura 2a-G). Semeando pilhas diretamente na cultura do tecido tratou 10 placas de pilha do cm rendeu um overgrowth de pilhas do fibroblasto. Fibroblastos foram identificados em microscopia de contraste de fas...

Discussão

Neste protocolo, desenvolvemos um método de crescimento reprodutível e caracterização de organóides mamários irradiados (Figura 1). Uma dose da irradiação de 20 GY foi aplicada para espelhar modelos in vivo precedentes do recrutamento da pilha do tumor⁵. A irradiação de glândulas mamárias ex vivo antes da formação organoide permitiu o isolamento de efeitos de dano de radiação sem uma infiltração correspondente de células imunes. O desenvolvimento de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokeratin 14	abcam	ab181595	Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagen Type I	Corning	354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Lot: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150077	green Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150080	red Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher	15140122
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)	Sigma	P1379-100ML