Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Zusammenfassung

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Zusammenfassung

Organoide, die aus dem verdauten Gewebe gewonnen werden, sind mehrstufige dreidimensionale (3D) Konstrukte, die in vivo-Bedingungen besser rekapitulieren als Zellmonolayers. Obwohl sie nicht vollständig in vivo-Komplexität modellieren können, behalten sie eine gewisse Funktionalität der ursprünglichen Orgel. Bei Krebsmodellen werden Organoide häufig verwendet, um Tumorzelleinfälle zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Organoide aus dem normalen und bestrahlten Maus-Mammargewebe zu entwickeln und zu charakterisieren, um die Strahlenreaktion in normalen Geweben zu bewerten. Diese Organoide können in zukünftigen In-vitro-Krebs-Studien eingesetzt werden, um Tumorzellinteraktionen mit bestrahlten Organoiden zu bewerten. Die Brustdrüsen wurden resutiert, auf 20 Gy bestrahlt und in einer Kollagenase VIII Lösung verdaut. Epitheliale Organoide wurden durch Zentrifugaldifferenzierung getrennt, und 3D-Organoide wurden in 96-gut niedrig haftenden Mikroplatten entwickelt. Organoide drückten das charakteristische epitheliale Marker Cytokeratin 14 aus. Die Makrophage-Interaktion mit den Organoiden wurde in Ko-Kultur-Experimenten beobachtet. Dieses Modell kann nützlich sein, um Tumorstrominteraktionen, Infiltration von Immunzellen und Makrophage-Polarisation in einer bestrahlten Mikroumgebung zu untersuchen.

Einleitung

Etwa 60% der dreifachen negativen Brustkrebspatientinnen (TNBC) wählen^dieBrustkonservierungstherapie (BCT) als Behandlungsform 1. Bei dieser Behandlungsmodalität wird der Tumor, der einen Teil des Brustgewebes enthält, entfernt, und das umgebende normale Gewebe ist ionisierender Strahlung ausgesetzt, um alle verbleibenden Tumorzellen abzutöten. Die Behandlung reduziert die Wiederholung in weiten Teilen der Brustkrebspopulation; Allerdings sind etwa 13,5% der behandelten Patienten mit TNBC^Erfahrunglocoregional Wiederholungen 2. Daher wird die Untersuchung, wie Strahlung zirkulierende Tumorzellen rekrutieren kann (CTCs), zu wichtigen Einsichten in die lokale Wiederholung 3,4^führen.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Strahlung des normalen Gewebes die Rekrutierung verschiedenerZelltypen 5 erhöht. In präklinischen Modellen von TNBC erhöhte die Bestrahlung des normalen Gewebes die Makrophage und in der Folge dieRekrutierung von Tumorzellen auf das normale Gewebe 5. Der Immunstatus beeinflusste die Rekrutierung von Tumorzellen an bestrahlten Standorten, wobei die Tumorzellwanderung bei immunkompromitierten Probanden beobachtet wurde. Die Rekapitulation dieser Wechselwirkungen mit Organoiden aus Brustdrüsen wird die Beobachtung von Zellmigration und zellstromalen Wechselwirkungen in Echtzeit mit Mikroskopie und Live-Zell-Bildgebung ermöglichen, um die Rolle der Strahlenschäden bei der Veränderung zu bestimmen. Tumorzellverhalten.

Maus-Mammarorganoide haben dabei geholfen, wichtige Schritte in der Entwicklung der Brustdrüse aufzuklären. Ein Säugetierorganoid ist ein mehrstufiges, dreidimensionales Konstrukt des isolierten Säugetierepithels, das größer als50 μm6,7,8,9,10^ist. Mit Hilfe von primären epithelialen Organoiden bewertete Simian et al^.die notwendigen Faktoren für die Verzweigung in der Brustdrüse 7. Shamir et al. entdeckte, dass die Verbreitung ohne einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang erfolgen kann, was Einblick in die metastasierende Kaskade⁸gewährt. Die Methoden zur Erzeugung und Charakterisierung von Organoiden aus Brustdrüsengewebe sind6^,11^{,12, 13gut}etabliert. Unseres Wissens wurden jedoch keine Methoden für den Anbau von bestrahlten Organoiden aus Brustdrüsen gemeldet. Ein Protokoll zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Organoiden wäre ein entscheidender Schritt bei der Rekapitulation von strahleninduzierten Immun-und Tumorzellrekrutierungen.

In diesem Papier berichten wir über eine Methode zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Säugetierarchivorganoiden in Mikroplatten mit niedrigem Klebstoff-Polymer, das die Bildung von Spheroiden unterstützt. Diese Organoide wurden mit Makrophagen kokultiviert, um die Infiltrationskinetik der Immunzellen zu untersuchen. Diese Arbeit kann erweitert werden, um die Ko-Kulturierung von Organoiden mit Fettzellen zu umfassen, um Säugetiereigenschaften zu rekapitulieren, Brustkrebszellen zur Visualisierung von Tumorzellrekrutierungen und CD8+ T-Zellen, um Wechselwirkungen zwischen Tumorimmel zu untersuchen. Bereits etablierte Protokolle können zur Auswertung von bestrahlten Organoiden verwendet werden. Frühere Modelle, die Säugetierorganoide und Immunzellen mitkultivieren, haben Licht auf Mechanismen der Metastasen und der Verbreitung geworfen. DeNardo et al. fand heraus, dass die CD4+ T-Zellregulierung von tumorassoziierten Makrophagen einen metastasierenden Phenotyp^vonSäugetieren von Adenokarzinomen 14 verstärkte. Die Modelle der Ko-Kultur-Kultur wurden auch verwendet, um Mechanismen der biologischen Entwicklung zu erklären. Plaks et al. klärte die Rolle der CD4+ T-Zellen als Down-Regulatoren der Säugetierorganogenese¹⁵auf. Unsere Gruppe ist jedoch die erste, die ein Verfahren etabliert hat, um zu visualisieren, wie normale Gewebebestrahlung das Immunzellverhalten beeinflusst. Da sich gezeigt hat, dass normale Gewebebestrahlung dieRekrutierung von Tumorzellen verbessert hat. [5] Dieses Protokoll kann weiterentwickelt werden, um zu analysieren, wie das Verhalten der Tumorzellen durch die Bestrahlung von normalem Gewebe und Zellen verändert wird, was zu einem besseren Verständnis von Krebserkrankung wiederholt.

Protokoll

Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den vom Vanderbilt der Institutional Animal Care and Use Committee der Vanderbilt Universität genehmigten Tierstudien durchgeführt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Zellaufnahme (angepasst von Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Opfere athymische Nu/Nu-Mäuse (8-10 Wochen alt) mit CO₂ Erstickung, gefolgt von Gebärmutterhalskrebs. Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.
2. Mit vorsterilisierter Schere und Zangen werden Bauch-und Leistenmischdrüsen von Mäusen entfernt. Lymphknoten vor dem Resektion entfernen. Spülen Sie in sterilen 1x Phosphat-gepufferten Salinen (PBS) (Abbildung 1A).
3. Platzieren Sie es in 15 ML-Rohren mit 10 ml von Dulbecco es Modified Eagle Media/Nutrient Mixtur F12 (DMEM/F12) für den Transport. Proben können über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt oder sofort verarbeitet werden. Auf Eis halten.
4. Bestrahlung von Proben bei 20 Gy mit einer Cäsiumquelle (Abbildung 1B).
5. 45 Minuten nach der Bestrahlung die Brustdrüsen in eine 35 mm sterile Zellplatte legen und mit Skalpellen absetzen (Abbildung 1c,D). Mit etwa 40 Schlägen abnehmen, bis sich das Gewebe entspannt und Stücke gewonnen werden, die nicht größer als ca. 1 mm 2 im Bereich sind.
6. Überführung auf die Kollagenase-Lösung in einem 50 mL Zentrifugenrohr. Collagenase-Lösung besteht aus 2 mg/mL Collagenase (siehe Materialtabelle), 2 mg/mL Trypsin, 5% v/v/fetales Rinderserum (FBS), 5 μg/mL Insulin und 50 μg/mL gentamicin in DMEM/F12-Medien. Verwenden Sie 10 mL Collagenase-Lösung pro Maus.
7. Legen Sie in ein Wasserbad bei 37 ° C und verhalen Sie alle 10 Minuten für 30-60 min. Verdauung ist abgeschlossen, wenn die Kollagenase-Lösung bewölkt ist (Abbildung 1E,F).
8. Die verdaute Lösung bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) untergeben. Drei Schichten werden beobachtet. Das Supernatant besteht aus Fett, die mittlere Schicht ist eine wässrige Lösung, und der Boden ist ein Pellet. Das Pellet erscheint rot, da es sich um eine Mischung aus Epithelzellen, einzelnen Stromalzellen und roten Blutkörperchen handelt (Abbildung 1G).
9. Vor dem Kontakt werden alle Pipetten, Pipette-Spitzen und Zentrifugenröhren mit Rinder-Serum Albumin (BSA) gelöst. Die BSA-Lösung besteht aus 2,5 w/v% BSA in Dulbecco es Phosphate Buffered Saline (DPBS). Für die Vorbeschichtung einfach die BSA-Lösung in die Innenseite der Pipette-Spitze und der Rohre entfernen. Die BSA-Lösung kann wiederverwendet werden, obwohl sie vor jedem Experiment steril gefiltert werden sollte.
10. Für die zusätzliche Erholung, übertragen Sie das Supernatant auf ein frisches BSA-beschichtetes 15-ML-Rohr. Pipette auf und ab kräftig auf-und ablegen, um Fettschicht zu zerstreuen. Zentrifuge bei 450 x g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Supernatant, so dass eine kleine Menge von Medien in der Röhre, um zu vermeiden, das Zellpellet zu saugen.
11. Die wässrige Schicht aus dem Rohr mit dem originalen Pellet aufsaugen.
12. Mit dem Original-Pellet 10 mL DMEM/F12 in die Röhre geben und auf das zweite Rohr übertragen. Pipette kräftig kombinieren und die beiden Pellets wieder aufspielen.
13. Zentrifuge bei 450 x g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Supernatant und fügen Sie 4 ml DMEM/F12 in die Röhre.
14. Fügen Sie 40 μL Deoxyribonuclease (DNase) in die Aufhängung ein und schütteln Sie bei RT ca. 5 Minuten von Hand. DNase-Lösung besteht aus 4 U/mL DNase in DMEM/F12.
15. 6 mL DMEM/F12 und Pipette gründlich hinzufügen. Zentrifuge das Rohr bei 450 x g für 10 min bei RT.
16. Aspirate supernatant auf die 0,5-ML-Marke. Resuspend in 10 mL von DMEM/F12 und Pipette gründlich.
17. Pulsieren Sie auf 450 x g und stoppen Sie 4 s, nachdem Sie diese Geschwindigkeit erreicht haben.
18. Wiederholen Sie die Schritte 1,16-1,17 dreimal mehr, um die Organoide durch die Zentrifugaldifferenzierung zu reinigen. Das Pellet sollte nun eine Off-White-Farbe sein, die nur aus epithelialen Organoiden besteht (Abbildung 1H).
    Achtung: Organoide können auch mit sterilen Netz-40 μm-Filtern gefiltert werden. Nach Schritt 1.16 werden Pipette-Medien mit Organoiden durch einen Filter in ein Zentrifugenrohr gespült und dann mit 5 bis 10 ml DMEM/F12-Medien abgespült. Drehen Sie den Filter über ein neues 50 mL-Zentrifugenrohr. Pass 10 mL von DMEM/F12 Medien durch, den umgekehrten Weg, um jede Retentate abzuspülen. Das Retentat sollte aus Organoiden bestehen, und das Filtrat sollte hauptsächlich aus strotzenden Zellen bestehen, die auf Wunsch weggeworfen oder aufbewahrt werden können.

2. Bestimmung der Dichte und Beschichtung von Organoiden

1. Wiederbelebungs-Pellets in 10 mL von DMEM/F12. Pipette gründlich, um eine homogene Lösung zu schaffen.
2. 50 μL auf eine 30 mm Petrischale übertragen und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 20x anzeigen. Zählen Sie die Anzahl der Organoide mit einem Zählmesser.
   Hinweis: Hier wurden Pipette-Spitzen mit einem minimalen Durchmesser von 457 μm konsequent verwendet, was 5-10 mal so viel wie der Durchmesser der gesäten Organoide ist. Für die Übertragung von Volumina von 2 mL oder größer (z.B. Schritte 1.16 und 2,1) verwenden Sie serologische Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von über 1.500 μm.
3. Berechnen Sie die Organoiddichte mit folgender Gleichung:
   
   Die gewünschte Dichte beträgt 1.000 organoids/mL, um die weitere Verdünnung zu vereinfachen. Ist die Dichte zu niedrig, ist die Zentrifuge bei 450 x g für 5 min und Aspirat Medien. Fügen Sie Medien, die notwendig sind, um 1.000 organoids/mL zu erreichen, und Pipette gründlich, um eine homogene Mischung zu schaffen.
   1. Um Organoide in einer Proteinmatrix anzubauen, werden Organoide in einer Konzentration von 1 Organoid/L in Kollagen Typ 1 verdünnt auf 87% oder in Kellermembran aus Engelbreth-Holm-Swarm Maus-Sarkom gewonnen. Während der Arbeit mit Proben, halten Sie auf Eis.
   2. Um Organoide einzufrieren, übertragen Sie das gewünschte Volumen auf ein separates Zentrifugenrohr. Drehen Sie sich auf 450 x g für 5 min. Aspirate media, und dann fügen Sie das gleiche Volumen von 90% FBS/10% DMSO. Die Organoide wiederbeleben und dann in die Kryotubes. Innerhalb einer Woche auf-80 ° C und dann auf flüssigen Stickstoff.
   3. Zum Tauen in einem 37 ° C-Wasserbad für eine Minute warm. Zentrifuge bei 450 x g für 5 min, und dann Aspirat Gefriermittel. Mit sterilen DPBS abspülen und dann wieder Zentrifuge. Aspirate DPBS und fügen Sie organoide Medien.
4. Pipette 50 μL (50 Organoide) in jeden Brunnen der niedrigen Haftplatte (Abbildung 1I).
5. Fügen Sie 150 μL an Organoidmedien hinzu, um das gesamte Arbeitsvolumen auf 200 μL zu bringen. Organoid-Medien bestehen aus 1% Penicillin-Streptomycin und 1% Insulin-Transferrin-Selen (ITS) in DMEM/F12-Medien.
6. Alle 2 Tage ersetzen Medien vorsichtig.
   NOTE: Niedrige Klebeplatten werden nicht Gewebekultur behandelt; So lassen sich die Zellen leicht lösen. Aspirieren Sie die Medien langsam, indem Sie die Platte kippen und die Pipette-Spitze am Rand jedes Brunnens einfügen. Lassen Sie eine kleine Menge Medien in den Boden des Brunnens. Fügen Sie langsam neue Medien hinzu, um unnötige Scherkräfte auf Organoide auftragen zu können.

3. Ko-Kultivierung mit Makrophagen

1. Pflegen GFP oder dTomato-beschriftete RAW 264.7 Makrophagen in DMEM-Medien mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt. Samen 1 x 10 4,5 x 10⁴, oder1 x 10⁵ cells/ml in Organoid Medien.
2. Verwenden Sie Live-Zellphasenkontraste und fluoreszierende Bildgebung, um die Verunrohrompelinfiltration im Laufe der Zeit zu überwachen.

4. Immunfluoreszenzfärbung von Organoiden

NOTE: Organoide können in niedrigen Klebstoffen gebeizt oder auf Kammerrutschen übertragen werden. Zum Übertragen, sanft nach oben und unten piptieren, bis sich die Organoide von den Platten gelöst haben. Übertragen Sie Kammerrutschen und Inkubat für 4-8 h, damit Organoide an der Plattenoberfläche haften können.

1. Entfernen Sie das organoide Medium aus den Brunnen, indem Sie vorsichtig saugen. Fixproben mit 10% neutralem Puff-Formalin für 15 Minuten bei RT.
2. 3x 5 min in 1x PBS waschen. Auf Wunsch können feste Proben bei 4 ° C für eine Woche zur weiteren Färbung gelagert werden.
3. Durchlässigkeit mit 0,1% 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylen-Glykol für 5 min.
   NOTE: Um für F-actin zu flecken, Inkubatproben mit Phalloidin verdünnt 1:1000 und 1,67 nM bisbenzimid nuklearen Farbstoff in 1% PBS/BSA für 1 h bei RT. Dann gehen Sie zu Schritt 4.8.
4. Bermeabilize mit 0,5PBS. Proben können mit 4opy-Bildern und Immunfluoreszenzbildern gespeichert werden. Mechanismen, die zu CTC Rlock mit 5% normalen Ziegenserum in 0,1% PBS/Polyethylen-Glykol-Sorbitan Monolaurat (PBST) für 1 h bei RT beitragen.
5. Inkubation mit Anti-Cytokeratin 14 verdünnt 1:1000, E-Cadherin verdünnt 1:200, oder Tight Junction Protein One verdünnt 1:100 in 1% NGS in PBST für 1 h bei RT. Wash 3x 5 min in PBST.
6. Inkubieren Sie mit Ziege Anti-Rabbit sekundär verdünnt 1:200 mit 1% NGS/PBST für 1 h bei RT. Deckel mit Folie, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
7. 3x 5 min in PBS waschen. Verwenden Sie den Kernfarbstoff (siehe Materialtabelle), um die Kerne zu verfärben.
8. 3x 5 min in PBS waschen. Bei Verwendung von Kammerrutsche mit einem Kofenlip aufhängen. In Folie bei 4 ° C bis zu 2 Wochen aufbewahren.

Ergebnisse

Bestrahlte epitheliale Säugetierorganoide wurden erfolgreich aus mausischen Brustdrüsen gewonnen, verarbeitet und auf Low-adhesion-Platten kultiviert (Abbildung1). Die Organoid-Ausbeute wurde durch Aussaat in verschiedenen Wachstumsumgebungen getestet (Abbildung 2A-G). Die Nähzellen direkt auf der Gewebekultur behandelten 10 cm Zellplatten führten zu einem Überwuwachs an Fibroblastzellen. Fibroblasten wurden in Phasenkontrastmikroskopie in oder in der Nähe der gleichen...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine Methode für reproduzierbares Wachstum und Charakterisierung von bestrahlten Säugetierorganoiden entwickelt (Abbildung1). Eine Bestrahlungsdosis von 20 Gy wurde auf Spiegel früherer in vivo-Modellen der Tumorzellrekrutierung⁵angewendet. Die Bestrahlung der Brustdrüsen ex vivo vor der Organoidbildung ermöglichte die Isolierung von Strahlenschädefeffekten ohne eine entsprechende Infiltration von Immunzellen. Die Entwicklung eines ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokeratin 14	abcam	ab181595	Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagen Type I	Corning	354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Lot: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150077	green Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150080	red Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher	15140122
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)	Sigma	P1379-100ML