Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Riepilogo

Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.

Abstract

Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell'organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l'invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L'interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all'interno di un microambiente irradiato.

Introduzione

Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento¹. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive². Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porterà a importanti approfondimenti sulla ricorrenza locale^3,4.

Il lavoro precedente ha dimostrato che la radiazione del tessuto normale aumenta il reclutamento di vari tipi di cellule⁵. Nei modelli preclinici di TNBC, l'irradiazione del tessuto normale ha aumentato il macrofago e successivamente il reclutamento delle cellule tumorali nei tessuti normali⁵. Stato immunitario influenzato il reclutamento delle cellule tumorali nei siti irradiati, con la migrazione delle cellule tumorali osservata in soggetti immunocompromessi. Ricapitolando queste interazioni utilizzando organoidi derivati da ghiandole mammarie permetterà l'osservazione della migrazione cellulare e interazioni cellulare-stromali in tempo reale con microscopia e imaging cellulare vivo per determinare il ruolo del danno da radiazioni in alterare comportamento delle cellule tumorali.

Gli organoidi mammari del topo hanno aiutato a chiarire i passi chiave nello sviluppo della ghiandola mammaria. Un organoide mammario è un costrutto tridimensionale multicellulare di epitelio mammario isolato che è più grande di 50 μm^6,7,8,9,10. Usando organoidi epiteliali primari, Simian et al. ha valutato i fattori necessari per la ramificazione nella ghiandola mammaria⁷. Ha scoperto che la diffusione può avvenire senza una transizione epiteliale a mesenchimale, fornendo informazioni sulla cascata metastatica⁸. I metodi per la generazione e la caratterizzazione di organoidi dal tessuto della ghiandola mammaria sono ben consolidati^6,11,12,13. Tuttavia, a nostra conoscenza, non sono stati segnalati metodi per la coltivazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie. Un protocollo per la coltivazione e la caratterizzazione di organoidi irradiati sarebbe un passo critico nella ricapitolazione del reclutamento di cellule immunitarie e tumorali indotta da radiazioni.

In questo articolo riportiamo un metodo per coltivare e caratterizzare organoidi epiteliali mammari irradiati in micropiastre a bassa adesione rivestite con un polimero idrofilo che supporta la formazione di sferoidi. Questi organoidi sono stati co-coltivati con macrofagi per esaminare la cinetica di infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo lavoro può essere esteso per includere organoidi co-coltura con cellule adiposo per ricapitolare caratteristiche mammarie, cellule di cancro al seno per visualizzare il reclutamento delle cellule tumorali, e CD8 + cellule T per studiare le interazioni del tumore-immunitarie. I protocolli precedentemente stabiliti possono essere utilizzati per valutare gli organoidi irradiati. I modelli precedenti che cocoltivano organoidi mammari e cellule immunitarie hanno fatto luce sui meccanismi di metastasi e diffusione. Ha riscontrato che la regolazione delle cellule T CD4 + dei macrofagi associati al tumore ha migliorato un fenotipo metastatico di adenocarcinomi mammari¹⁴. I modelli di co-coltura sono stati utilizzati anche per chiarire i meccanismi di sviluppo biologico. Chiarito il ruolo delle cellule T CD4 + come down-regolatori di organogenesi mammaria¹⁵. Tuttavia, il nostro gruppo è il primo a stabilire una procedura per visualizzare come l'irraggiamento del tessuto normale influenza il comportamento delle cellule immunitarie. Poiché l'irraggiamento tissutale normale è stato dimostrato per migliorare il reclutamento delle cellule tumorali⁵, questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per analizzare come il comportamento delle cellule tumorali è alterato dall'irradiazione di tessuti e cellule normali, portando ad una maggiore comprensione del recidiva di cancro.

Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i protocolli istituzionali approvati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali Vanderbilt University.

1. preparazione di topi e l'acquisizione di cellule (adattato da Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Sacrificio atimici nu/nu topi (8-10 settimane di età) utilizzando Co₂ asfissia seguita da lussazione cervicale. Pulire la pelle utilizzando 70% etanolo.
2. Reinviare le ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze. Rimuovere i linfonodi prima della resezione. Risciacquare in sterile 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Figura 1a).
3. Posizionarlo in provette da 15 mL con 10 mL di Dulbecco ' s Modified Eagle media/miscela nutriente F12 (DMEM/F12) per il trasporto. I campioni possono essere conservati durante la notte a 4 ° c o trasformati immediatamente. Continuate a ghiaccio.
4. Irradiare campioni a 20 GY utilizzando una fonte di cesio (Figura 1B).
5. 45 minuti dopo l'irradiazione, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile da 35 mm e tritare con scalpelli (Figura 1C, D). Mince con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa 1 mm² in zona.
6. Trasferire alla soluzione di collagenasi in una provetta da centrifuga da 50 mL. La soluzione di collagenasi è costituita da 2 mg/mL di collagenasi (vedere tabella dei materiali), 2 mg/ml di tripsina, 5% v/v di siero bovino fetale (FBS), 5 μg/ml di insulina e 50 μg/ml di gentamicina nei media DMEM/F12. Utilizzare 10 mL di soluzione di collagenasi per mouse.
7. Mettere in un bagno d'acqua a 37 ° c, Vortex ogni 10 min per 30-60 min. la digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbida (Figura 1e, F).
8. Ruotare la soluzione digerita a 450 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Saranno osservati tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa, e il fondo è un pellet. Il pellet apparirà rosso in quanto è una miscela di cellule epiteliali, cellule stromali individuali e globuli rossi (Figura 1g).
9. Prima del contatto, precoat tutte le pipette, puntali per pipette e provette centrifughe con soluzione di albumina bovina (BSA). La soluzione BSA è costituita da 2,5 w/v% BSA in salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Per il pre-rivestimento, semplicemente aggiungere quindi rimuovere la soluzione BSA all'interno della punta della pipetta e tubi. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterile prima di ogni esperimento.
10. Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante ad un nuovo tubo da 15 mL rivestito con BSA. Pipettare su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di media nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.
11. Aspirare lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale.
12. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferire al secondo tubo. Pipettare vigorosamente per combinare e risospendere i due pellet.
13. Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante e aggiungere 4 ml di DMEM/F12 al tubo.
14. Aggiungere 40 μl di deossiribonucleasi (DNAse) alla sospensione e agitare delicatamente a mano per 2-5 min alla soluzione RT. DNAse è costituito da 4 U/ml di dnasi in DMEM/F12.
15. Aggiungere 6 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente. Centrifugare il tubo a 450 x g per 10 min a RT.
16. Aspirare il supernatante al marchio 0,5 mL. Risospendere in 10 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente.
17. Impulso a 450 x g e Stop 4 s dopo aver raggiunto quella velocità.
18. Ripetere i passaggi 1.16-1.17 altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore Biancaneve costituito solo da organoidi epiteliali (Figura 1h).
    Nota: gli organoidi possono anche essere filtrati utilizzando filtri a rete sterile da 40 μm. Dopo il passo 1,16, pipettare i supporti contenenti organoidi attraverso un filtro in una provetta da centrifuga, quindi risciacquare con 5 o 10 mL di supporti DMEM/F12. Capovolgere il filtro su una nuova provetta centrifuga da 50 mL. Passare 10 mL di media DMEM/F12 attraverso, andando il modo opposto per risciacquare qualsiasi retentate. Il retentato deve consistere in organoidi, e il filtrato deve consistere principalmente di cellule stromali, che possono essere scartate o mantenute se lo si desidera.

2. determinare la densità e placcatura organoidi

1. Risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12. Pipettare accuratamente per creare una soluzione omogenea.
2. Trasferire 50 μL in una capsula di Petri da 30 mm e visualizzarla sotto un microscopio a contrasto di fase a 20x. Contare il numero di organoidi con un contatore tally.
   Nota: qui i puntali per pipette sono stati costantemente utilizzati con un diametro minimo di 457 μm, che è 5-10 volte il diametro degli organoidi che vengono seminati. Per il trasferimento di volumi di 2 mL o più grandi (ad es. passi 1,16 e 2,1), utilizzare pipette sierologiche con diametri della punta superiori a 1.500 μm.
3. Calcola la densità organoide utilizzando la seguente equazione:
   
   La densità desiderata è 1.000 organoidi/mL per semplificare ulteriormente la diluizione. Se la densità è troppo bassa, centrifugare a 450 x g per 5 min e aspirare media. Aggiungere i supporti necessari per raggiungere 1.000 organoidi/mL e pipettare accuratamente per creare una miscela omogenea.
   1. Per coltivare organoidi in una matrice proteica, i semi organoidi ad una concentrazione di 1 organoide/L in collagene di tipo 1 diluito a 87% o nella membrana seminterrato estratta dal sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm. Mentre si lavora con i campioni, tenere il ghiaccio.
   2. Per congelare gli organoidi, trasferire il volume desiderato in una provetta centrifuga separata. Girare verso il basso a 450 x g per 5 min. aspirate media, e quindi aggiungere lo stesso volume di 90% FBS/10% DMSO. Risospendere gli organoidi e poi l'aliquota in criotubi. Trasferire a-80 ° c e poi all'azoto liquido entro una settimana.
   3. Per scongelare, riscaldare in un bagnomaria a 37 ° c per un min. Centrifugare a 450 x g per 5 min, quindi aspirare i mezzi di congelamento. Risciacquare con DPBS sterile, quindi centrifugare nuovamente. Aspirate DPBS e aggiungete un supporto organoide.
4. Pipettare 50 μL (50 organoidi) in ciascun pozzetto della piastra di adesione bassa (Figura 1I).
5. Aggiungere 150 μL di supporto organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 μL. il supporto organoide è composto da 1% di penicillina-streptomicina e 1% di insulina-transferrina-selenio (ITS) nei media DMEM/F12.
6. Ogni 2 giorni sostituire i supporti con attenzione.
   Nota: le piastre a bassa adesione non sono trattate con colture tissutali; Pertanto, le cellule possono essere facilmente staccate. Aspirare lentamente il supporto inclinando la piastra e inserendo la punta della pipetta sul bordo di ogni pozzetto. Lasciare una piccola quantità di media nella parte inferiore del pozzo. Aggiungere lentamente nuovi supporti per evitare di applicare forze di taglio inutili agli organoidi.

3. co-coltura con i macrofagi

1. Mantenere GFP o i macrofagi RAW 264,7 etichettati con dTomato nei supporti DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Seme 1 x 10⁴,5 x 10⁴, o 1 x 10⁵ cellule/ml in media organoide.
2. Utilizzare il contrasto di fase in tempo reale delle cellule e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione dei macrofiti.

4. colorazione immunofluorescenza degli organoidi

Nota: gli organoidi possono essere macchiati in pozzi a bassa adesione o possono essere trasferiti a vetrini a camera. Per il trasferimento, pipettare delicatamente su e giù fino a quando gli organoidi si sono staccati dalle piastre. Trasferire ai vetrini della camera e incubare per 4-8 h per consentire agli organoidi di aderire alla superficie della piastra.

1. Rimuovere il fluido organoide dai pozzetti aspirando con cautela. Fissare i campioni con il 10% di formalina tamponata neutra per 15 minuti in RT.
2. Lavare 3X 5 min in 1X PBS. Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a 4 ° c per una settimana per ulteriori macchie.
3. Permeabilizzare con 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicole per 5 min.
   Nota: per macchiarsi di F-actina, incubare i campioni con colorante nucleare di bisbenzimide diluito 1:1000 e 1,67 nM in 1% in PBS/BSA per 1 h a RT. Quindi, procedere al passaggio 4,8.
4. Bermeabilize con 0.5 PBS. I campioni possono essere conservati in immagini 4opy e immagini immunofluorescenti. meccanismi che contribuiscono alla RLOCK CTC con il 5% di siero di capra normale in 0,1% PBS/polietilenglicole sorbitan monolaurato (PBST) per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min con PBS.
5. Incubare con anti-cytokeratin 14 diluito 1:1000, E-cadherin diluito 1:200 o stretto Junction protein One diluito 1:100 in 1% NGS in PBST per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min in PBST.
6. Incubare con capra anti-coniglio secondario diluito 1:200 con 1% NGS/PBST per 1 h a RT. coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
7. Lavare 3X 5 min in PBS. Utilizzare il colorante nucleare (vedere tabella dei materiali) per macchiare i nuclei.
8. Lavare 3X 5 min in PBS. Se si utilizza la slitta a camera, montare con un coprioggetti. Conservare avvolto in lamina a 4 ° c per un massimo di 2 settimane.

Risultati

Gli organoidi mammari epiteliali irradiati sono stati ottenuti con successo dalle ghiandole mammarie del topo, elaborati e coltivati su piastre a bassa adesione (Figura 1). La resa organoide è stata testata dalla semina in diversi ambienti di crescita (Figura 2a-G). La semina delle cellule direttamente sulla coltura tissutale trattata di piastre cellulari da 10 cm ha prodotto una crescita eccessiva delle cellule fibroblasti. I fibroblasti sono stati identificati sotto micro...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali⁵. L'irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokeratin 14	abcam	ab181595	Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagen Type I	Corning	354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Lot: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150077	green Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150080	red Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher	15140122
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)	Sigma	P1379-100ML