乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

要約

マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。

要約

消化された組織に由来するオルガノイドは、多細胞三次元 (3D) 構成要素であり、細胞単層よりもインビボ条件においてより良い不在を有する。これらは、生体内の複雑さを完全にモデル化できませんが、元の臓器のいくつかの機能を保持します。がんモデルでは、オルガノイドは、腫瘍細胞の浸潤を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは正常な、照射されたマウス乳腺組織からのオルガノイドを発達させることを特徴とし、正常組織における放射線応答を評価することを目的とする。これらのオルガノイドは、放射線照射されたオルガノイドとの腫瘍細胞相互作用を評価するために将来のインビトロ癌研究に適用することができる。乳腺を切除し、20 Gy に照射し、コラゲナーゼ VIII 溶液で消化した。上皮のオルガノイドは遠心分化によって分離され、3D オルガノイドは96の低付着性マイクロプレートで開発しました。オルガノイドは、特徴的な上皮マーカーサイトケラチン14を発現した。オルガノイドとのマクロファージ相互作用は、共培養実験で観察された。このモデルは、腫瘍間質相互作用、免疫細胞の浸潤、および照射された微小環境内のマクロファージ偏波を研究するのに有用である可能性がある。

概要

3つの否定的な乳癌 (TNBC) の患者のおよそ 60% は処置¹の形態として乳房温存療法 (BCT) を選ぶ。この治療モダリティでは、乳房組織の一部を含む腫瘍を除去し、周囲の正常組織を電離放射線に曝露して、任意の残留腫瘍細胞を死滅させる。治療は、乳癌集団の多くで再発を減少させます;しかし、TNBC 経験を持つ治療された患者の約 13.5% が²を再発局所領域的。したがって、放射線がどのように循環腫瘍細胞 (CTCs) を募集するかを研究することは、局所再発^3,4における重要な洞察につながります。

従来の研究は、正常組織の放射線が様々な細胞型⁵の動員を増加させることを示している。TNBC の前臨床モデルにおいて、正常組織の照射はマクロファージを増加させ、続いて正常組織⁵に腫瘍細胞を動員する。免疫状態は、照射部位への腫瘍細胞の動員に影響を与え、腫瘍細胞の遊走は免疫不全の被験者で観察された。乳腺に由来するオルガノイドを用いてこれらの相互作用を概説することで、細胞遊走と細胞間相互作用を顕微鏡検査と生細胞イメージングでリアルタイムに観察し、変化による放射線損傷の役割を決定することができます。腫瘍細胞の挙動。

マウス乳腺オルガノイドは、乳腺の発達における主要なステップを解明するのに役立った。乳腺オルガノイドは50μ m^6,7,8,9,10よりも大きい単離された乳腺上皮の多細胞性、三次元構造体である。原発性上皮オルガノイドを用いて、サル et al. は、乳腺⁷における分枝について必要な因子を評価した。シャミル et al. は上皮間葉転移を伴わない伝播が起こり得ることを発見し、転移性カスケード⁸に対する洞察を提供する。乳腺組織からのオルガノイドの生成および特徴づけの方法は、^{6、11、12、13}で十分に確立されている。しかし、我々の知る限りでは、乳腺から照射されたオルガノイドが増殖するための方法は報告していない。照射されたオルガノイドの増殖および特性評価のためのプロトコルは、放射線誘導免疫および腫瘍細胞の概説において重要なステップである。

本論文では、スフェロイドの形成をサポートする親水性高分子を被覆した低接着マイクロプレートにおいて、照射された乳腺上皮オルガノイドを増殖・特性評価する方法を報告する。これらのオルガノイドは、免疫細胞浸潤動態を調べるためにマクロファージと共培養した。この作業は、脂肪細胞との共培養オルガノイドを乳房特性に不在し、腫瘍細胞の動員を可視化する乳癌細胞、および CD8 + T 細胞が腫瘍・免疫細胞相互作用を研究するように拡張することができる。以前に確立されたプロトコルは、照射オルガノイドを評価するために使用することができる。以前のモデルでは、乳腺オルガノイドと免疫細胞の共培養は、転移と播種のメカニズムに光を当てています。DeNardo et al. は、腫瘍関連マクロファージの CD4 + T 細胞調節が乳腺腺癌¹⁴の転移性表現型を増強したことを見出した。共培養モデルは、生物学的発達のメカニズムを解明するためにも用いられてきた。Plaks et al. は、乳腺器官形成¹⁵のダウンレギュレータとしての CD4 + T 細胞の役割を明らかにした。しかし、私たちのグループは、正常な組織の照射がどのように免疫細胞の挙動に影響するかを可視化する手順を最初に確立します。正常な組織の照射が腫瘍細胞の動員⁵を増強することが示されているので、このプロトコルは、腫瘍細胞の挙動が正常な組織および細胞の照射によってどのように変化するかを分析するためにさらに開発することができ、より大きな理解につながる癌の再発

プロトコル

動物実験は、ヴァンダービルト大学組織動物ケア・ユース委員会によって承認された制度的ガイドラインとプロトコルに従って実施した。

1. マウスおよび細胞の獲得の準備 (グエン・ゴック et al.¹¹から適応)

1. 犠牲無胸腺 Nu/Nu マウス (8-10 週齢) を使用して、co2 窒息の後に頚部脱臼が続きます。70% エタノールを使用して皮膚をきれいにします。
2. 切除は、滅菌済みのはさみおよび鉗子を使用して、マウスから腹部および鼠径乳腺を採取します。切除前にリンパ節を除去する。滅菌1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ですすいでください (図 1a)。
3. 輸送用のダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F12 (DMEM/F12) 10 mL の 15 mL チューブに入れてください。サンプルは4° c で一晩保存するか、すぐに処理することができます。氷の上に保管してください。
4. セシウム源を用いて 20 Gy で試料を照射する (図 1b)。
5. 45分照射後、乳腺を 35 mm の無菌細胞プレートに入れ、メスでミンチする (図1c、D)。約40のストロークでミンチすると、組織が弛緩し、部分が約 1mm²より大きくならない小片が得られる。
6. 50 mL 遠心管でコラゲナーゼ溶液に移します。コラゲナーゼ溶液は、2mg/mL コラゲナーゼ (材料表参照)、2mg/ml トリプシン、5% v/v 胎仔ウシ血清 (FBS)、5μ g/ml インスリン、および50μ g/ml ゲンタマイシンで、DMEM/F12 培地で構成される。マウスあたり 10 mL のコラゲナーゼ溶液を使用する。
7. 37° c の水浴中に配置し、ボルテックスの場合は10分ごとに30-60 分間、コラゲナーゼ溶液が白濁したときに消化が完了する (図 1e, F)。
8. 室温 (RT) で10分間 450 x gで消化液をスピンダウンします。3つの層が観察されます。上清は、脂肪から構成され、中間層は水溶液であり、底部はペレットである。このペレットは、上皮細胞、個々の基質細胞、および赤血球の混合物であるため、赤色で表示されます (図 1g)。
9. 予備コーティングは、すべてのピペット、ピペットチップ、および接触前にウシ血清アルブミン (BSA) 溶液で遠心管を使用します。BSA 溶液は、ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 中の 2.5 w/v% BSA で構成されています。前コーティングのために、単にピペットの先端および管の内部に BSA の解決を加えて取除きなさい。BSA 溶液は、各実験の前に滅菌濾過されるべきであるが、再利用することができる。
10. 追加の回復のために、上清を新鮮な BSA に 15 mL のチューブをコーティングして移します。上下に激しく脂肪層を分散させます。RT で10分間 450 x gで遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを吸引しないように少量の培地をチューブに残します。
11. 元のペレットでチューブから水性層を吸引します。
12. 元のペレットでチューブに 10 mL の DMEM/F12 を加え、2番目のチューブに移します。2つのペレットを結合し、再懸濁するために精力的にピペット。
13. RT で10分間 450 x gで遠心分離します。上澄みを吸引し、4 ML の DMEM/F12 をチューブに加えます。
14. 40μ l のデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) を懸濁液に加え、RT で2-5 分間軽く手で振ります。 DNase 溶液は、DMEM/F12 で 4 U/mL の DNase で構成されています。
15. 6 mL の DMEM/F12 およびピペットを完全に加えてください。RT で10分間 450 x gでチューブを遠心します。
16. 0.5 mL マークに上清を吸引します。10 mL の DMEM/F12 およびピペットで再懸濁を完全に洗浄する。
17. 450 x gにパルスし、その速度に達した後に4秒を停止します。
18. ステップ 1.16-1.17 をさらに3回繰り返して、遠心分化によってオルガノイドを精製します。ペレットは、上皮オルガノイドのみからなるオフホワイト色になります (図 1h)。
    注: オルガノイドはまた生殖不能の網40μ m フィルターを使用してろ過することができる。ステップ1.16 の後、フィルターを通してオルガノイドを含有する培地を遠心管に通し、次いで5〜10ml の DMEM/F12 培地ですすいでください。新しい 50 mL の遠心管の上のフィルターをひっくり返しなさい。10 mL の DMEM/F12 メディアを通して、逆方向に行って任意の保持液を洗い流す。保持液はオルガノイドで構成されており、濾液は主に基質細胞から成り、必要に応じて廃棄または保持することができる。

2. 密度とめっきオルガノイドの決定

1. 再懸濁ペレットを 10 mL の DMEM/F12 で行います。均質な溶液を作成するために徹底的にピペット。
2. 50μ l を 30 mm のペトリ皿に移し、20倍の位相コントラスト顕微鏡で見る。集計カウンタを使用してオルガノイドの数をカウントします。
   注: ここでピペットの先端が一貫して457μ m の最低の直径と、播種されるオルガノイドの直径の5-10 倍で使用されています。2つの mL またはより大きいの容積 (例えばステップ1.16 および 2.1) の移動のために、1500μ m の先端の直径超過の血清学的ピペットを使用しなさい。
3. 次の式を使用して、オルガノイド密度を計算します。
   
   所望の密度は、さらなる希釈を容易にするために1000オルガノイド/mL である。密度が低すぎる場合は、450 x gで5分間の遠心分離を行います。1000オルガノイド/mL に到達するために必要なメディアを追加し、均質な混合物を作成するために徹底的にピペット。
   1. タンパク質マトリックス中でオルガノイドを成長させるために、種子オルガノイドをコラーゲンタイプ1で1オルガノイド/L の濃度で 87% に希釈するか、または Engelbreth ・ホルム群マウス肉腫から抽出した基底膜中で濃縮する。サンプルで作業しながら、氷の上で維持します。
   2. オルガノイドを凍結するには、目的の容積を別の遠心管に移します。5分間、450 x gでスピンダウンして、同じ容量の 90% FBS/10% DMSO を加えます。オルガノイドを再懸濁、次に cryotubes にアリコートします。-80 ° c に移し、その後1週間以内に液体窒素に移行します。
   3. 解凍するには、37° c の水浴で1分間加温し、450 x gで5分間遠心分離し、次いで凍結培地を吸引する。滅菌 DPBS ですすいでから、再度遠心分離してください。DPBS を吸引し、オルガノイドメディアを追加します。
4. 低付着プレートの各ウェルにピペット50μ l (50 オルガノイド) を挿入します (図 1i)。
5. 150μ l のオルガノイドを加えて、総作業量を200μ l とする。オルガノイド培地は、1% のペニシリン・ストレプトマイシンと 1% のインスリン-トランスフェリン−セレン (ITS) を DMEM/F12 培地で構成する。
6. 2日ごとにメディアを慎重に置き換えます。
   注: 低付着プレートは、治療された組織培養ではありません。したがって、細胞を容易に剥離することができる。プレートを傾け、各ウェルの端にピペットチップを挿入して、ゆっくりとメディアを吸引します。井戸の底にメディアの少量を残します。不要なせん断力をオルガノイドに適用しないように、新しいメディアをゆっくりと追加します。

3. マクロファージとの共培養

1. 10% の FBS および 1% のペニシリン・ストレプトマイシンを添加した DMEM 培地中の GFP または dTomato ラベルの生264.7 マクロファージを維持する。シード 1 x 10⁴, 5 x 10⁴, または 1 x 10⁵細胞/ml オルガノイドメディアに.
2. 生細胞相コントラストと蛍光イメージングを使用して、時間の経過とともにマクロファージ浸潤を監視します。

4. オルガノイドの免疫蛍光染色

注: オルガノイドは低い付着の井戸で染まることができるまたは部屋のスライドに移すことができる。転送するには、オルガノイドがプレートから取り外されるまで、ゆっくりと上下にピペットで移動します。部屋のスライドに移し、4-8 h の間インキュベートして、オルガノイドがプレート表面に付着できるようにします。

1. 慎重に吸引することにより、ウェルからオルガノイド培地を除去します。RT で15分間 10% 中性緩衝ホルマリンでサンプルを固定します。
2. 1x PBS で3倍5分洗浄します。必要に応じて、固定サンプルを4° c で1週間保存し、さらに染色を行うことができます。
3. 透過処理の 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) フェニル-5 分のポリエチレングリコール。
   注: F-アクチンを染色するには、ファロイジンで 1: 1000 および 1.67 nM bisbenzimide の核色素を 1% の PBS/BSA で 1% の RT でインキュベートします。次に、ステップ4.8 に進みます。
4. 0.5 PBS で Bermeabilize。サンプルは4opy イメージおよび immunofluorescent イメージで貯えることができる。CTC に寄与する機構 rlock で 5% 正常ヤギ血清で 0.1% PBS/ポリエチレングリコールソルビタン monolaurate (PBST) を RT で1時間洗浄する。 PBS で3倍5分洗ってください。
5. 抗サイトケラチン14希釈した 1: 1000、E-カドヘリンを希釈した1:200、またはタイトな接合タンパク質1を RT で1時間 PBST で 1% の NGS で希釈した1:100 でインキュベートします。 PBST で5分間洗浄します。
6. ヤギ抗ウサギ2次希釈1:200 で 1% の NGS/PBST で1時間 RT でインキュベートします。光の暴露を避けるために箔でカバーしています。
7. PBS で3倍5分洗浄します。核染料 (物質表参照) を使って核を染色する。
8. PBS で3倍5分洗浄します。チェンバースライドを使用する場合は、カバースリップで取り付けてください。4° c で2週間まで箔で包まれた店舗。

結果

照射した上皮乳腺オルガノイドをマウス乳腺から正常に取得し、処理し、低付着性プレート上で培養した (図 1)。オルガノイド収率は、異なる増殖環境で播種することによって試験された (図2a − G)。組織培養に直接播種された細胞は 10 cm の細胞版を処理し、線維芽細胞の増殖を引き起こした。線維芽細胞は、オルガノイドと同じ焦点のまたはその近くの位...

ディスカッション

このプロトコルでは、照射された乳腺オルガノイドの再生可能な成長と特性評価のための方法を開発しました (図 1)。20 Gy の照射用量を、腫瘍細胞リクルート⁵の前インビボモデルを鏡映するために適用した。オルガノイド形成の前にインビボの乳腺の照射は、免疫細胞の対応する浸潤を伴わずに放射線損傷の影響を単離することを可能にした。インビ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Anti-cytokeratin 14	abcam	ab181595	Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin	Sigma	A1933-25G
Collagen Type I	Corning	354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	Cell Signaling	24E10	Lot: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150077	green Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary	abcam	ab150080	red Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher	15140122
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)	Sigma	P1379-100ML