单核细胞化学策略活性在Vivo的定量和血液单核细胞衍生巨噬细胞的特征

摘要

在这里,我们提出一个协议,以量化小鼠模型中血液单核细胞的化学活性,评估营养、药理和遗传干预对血液单核细胞的影响,并描述在小鼠模型中产生的血单核细胞使用单核细胞-化学吸引蛋白-1(MCP-1)加载的基底膜衍生凝胶塞的小鼠模型。

摘要

组织平衡和修复严重依赖单细胞衍生巨噬细胞的招募。单细胞衍生巨噬细胞的不足和过度招募都会损害伤口愈合。我们表明,高脂肪和高糖饮食促进单核细胞启动和功能障碍,将健康的血液单核细胞转化为一种超化学性表型,随时准备分化成具有调节激活特征和受损的表型的巨噬细胞可塑性。过度招募单核衍生巨噬细胞和招募具有调节障碍活化特征的巨噬细胞被认为是导致与代谢紊乱有关的慢性炎症性疾病发展的主要原因,包括动脉粥样硬化和肥胖。该协议的目标是量化血液单核细胞的化学活性,作为单核细胞启动和功能障碍的生物标志物,并描述巨噬细胞表型血单核细胞在这些小鼠模型中的特性。利用单细胞西斑分析,结果表明,24 h 33%的细胞被吸收到MCP-1加载的基底膜衍生凝胶塞中注入小鼠后是单核细胞和巨噬细胞;58% 后 3 天。然而,第5天,单核细胞和巨噬细胞数量显著减少。最后,我们表明,该测定还允许从手术检索的基底膜衍生凝胶塞分离活巨噬细胞,然后通过单细胞西斑分析进行后续表征。

引言

单核细胞衍生巨噬细胞的招募对于与代谢紊乱有关的慢性炎症疾病的发展至关重要,包括动脉粥样硬化和肥胖1,2,3 ⁴.组织损伤部位的单核衍生巨噬细胞数量及其可塑性对组织平衡和修复至关重要。单细胞衍生巨噬细胞的不足和过度招募都会损害伤口愈合5。引发局部组织炎症,例如,通过低密度脂蛋白 (LDL) 在主动脉壁的积累和氧化,或通过肠道泄漏的细菌脂多糖对脂肪细胞的炎症激活屏障,导致炎症介质的释放,包括化疗素,如单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1/CCL2)。MCP-1是C-C化学素家族的成员,也是负责在组织炎症和损伤部位招募单核细胞衍生巨噬细胞的关键化学吸引剂6,7,8 ^9,10.血管内皮的炎症活化导致粘附分子的表达,如细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)11,12,允许由MCP-1激活的循环单核细胞滚动,牢固地粘附并随后移入下直肠^空间12。渗透单核细胞分化成巨噬细胞,可以激活成亲炎表型,推动急性炎症过程。在微环境的驱动下,亲炎巨噬细胞可以转化为炎症解析巨噬细胞,在清除炎症细胞、消除亲炎信号和完成组织修复和伤口方面起着至关重要的作用愈合12,13。

慢性代谢压力使单核细胞对化疗吸引物的反应显著增强,并增加了单核细胞的招募,我们表明,充血的单核细胞产生巨噬细胞,具有调节不良的活化程序和极化州14,15,16。单核细胞启动促进动脉粥样硬化,肥胖,可能与其他慢性炎症疾病,如脂肪瘤,肾脏疾病和可能癌症。为了评估和量化人类疾病小鼠模型中的单核细胞启动,我们开发了一种新技术,通过测量体内的化学活性14、15、16,来评估血液单核细胞的启动状态。 ¹⁷.我们的方法包括将底膜衍生凝胶注入,其中要么装有化学吸引剂(我们通常使用 MCP-1),要么分别注入小鼠的左右侧翼。当仔细注射皮下,基底膜衍生凝胶将形成一个单一的插头,其中化学因子可以扩散,并创建一个定义的化学梯度,不受周围代谢或炎症状态的影响组织或受体小鼠。

我们用于测定的基底膜衍生凝胶是从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖姆(EHS)小鼠肉瘤中提取的溶解基底膜制剂,这种肿瘤富含这种细胞外基质(ECM)蛋白质。这种复杂的蛋白质混合物含有层蛋白(60%)、胶原蛋白IV(30%)、桥接分子定木蛋白(8%)和多种生长因子。地下室膜基塞塞测定最初是为研究血管生成而开发的,以响应各种生长因子18,19。然而,为了研究单细胞化学,重要的是使用生长因子耗尽的基底膜衍生凝胶,以尽量减少内皮细胞的招募和血管生成。Matrigel(称为基底膜衍生凝胶)之所以独特,而且特别有用,是在低于10°C的温度下,它液化,允许化学素溶解。在22°C以上的温度下,基底膜衍生溶液快速经历相变,并迅速形成水凝胶。这些插头可以通过细菌衍生的中性金属蛋白酶进行手术切除、清洁和溶解,从而产生单细胞悬浮液,可在荧光活性细胞分拣机(FACS)、RNA、单细胞RNA和各种其他酶中进行分析omics 技术。在这里,我们描述了使用单细胞西斑分析来描述细胞群的表征招募到地下室膜衍生凝胶塞1,3或5天后注射。

研究方案

本议定书中描述的所有方法均已获得威克森林医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 制备MCP-1负载生长因子-减少基底膜衍生解决方案

注:这是一个无菌程序。

1. 在制备基底膜衍生溶液(例如,Matrigel)之前,用消毒剂清洁细胞培养罩。
2. 单独包装无菌 1 mL 注射器,并用酒精拭子擦拭地下室膜衍生溶液小瓶的顶部,然后再将其装入注射器。
3. 完全解冻生长因子减少的基底膜衍生溶液在冰上。
   警告:如果基底膜基质在室温 (RT) 下解冻,请确保保持小冰颗粒以防止溶液凝固。
4. 解冻后,打开小瓶,将MCP-1或1xPBS与0.1%的BSA混合在细胞培养罩中。
5. 用26G针头准备1mL的无菌注射器,在冰上冷却。
6. 通过将 MCP-1 溶解至 1x PBS 中最终浓度为 50 μg/mL,在 0.1% BSA 中制备 MCP-1 的库存溶液。
7. 将MCP-1稀释至5mL冷基底膜衍生溶液中,最终浓度为500纳克/mL。仅使用车辆制备同等数量的基底膜衍生溶液(1x PBS 包含 0.1% BSA)。
8. 在冷1 mL注射器中装载500μL的基底膜衍生溶液(带或不带MCP-1)。
9. 在注射前,从地下室膜衍生溶液加载注射器中取出所有气泡,以确保形成均匀的塞。

2. 注射基底膜衍生溶液

1. 在注射前和注射过程中在手术区域周围喷洒 70% 乙醇,以对环境进行消毒。
2. 要诱导麻醉,将鼠标放在麻醉室中,将O₂流量计设置为1升/分钟,然后将蒸发器调整到2%的电一苯。
3. 通过监测呼吸速率(速率/分钟)、角膜反射和胡须的运动来监测麻醉深度。
4. 在整个过程中,使用鼻锥保持麻醉。
5. 在手术过程中,持续监测呼吸速率(速率/分钟)、角膜反射和胡须的运动,以验证麻醉的深度。
6. 确认对脚趾捏合缺乏反应后,缓慢地将基底膜衍生溶液分皮地注射到鼠标的右侧(无 MCP-1)和左侧(使用 MCP-1)。如果注射速度太慢,地下室膜衍生的凝胶塞可能会变得不规则,甚至支离破碎,难以去除。
7. 注射后将注射器握住20-30,以防止溶液泄漏,并形成单片光滑的凝胶塞。
8. 注射后,将鼠标放在加热垫上,进行监测,直到恢复。
9. 完全恢复鼠标后,将鼠标返回到原始保持架。

3. 收获基底膜衍生凝胶塞

1. 为每只小鼠称重两个单独的 1.5 mL 微离心管,并标记它们。
2. 注射基底膜衍生溶液三天后,在麻醉室用3%异二苯基使小鼠安乐死,然后进行宫颈脱位。
3. 使用剪发器去除鼠标的背毛,或用棉签棒涂抹脱发霜 5 分钟,然后擦掉。
4. 用钳子在下胸椎和上腰椎周围用钳子握住小鼠皮肤,并进入皮肤进行2毫米长的切口。
5. 用手术剪刀将小鼠背部的中线从颈椎切口切开,并切至距颈椎结(尾结)1厘米处。
6. 将皮肤与肌肉层分离,在聚苯乙烯泡沫平台上固定皮肤。
7. 小心地握住含有基底膜衍生凝胶塞的纤维胶囊,用细钳子取出纤维胶囊,用细剪刀清洁塞子。
8. 取出清洁的地下室膜衍生凝胶塞并转移到 1.5 mL 微离心机(参见 3.1)。
9. 使用清洁的地下室膜衍生凝胶塞称重微离心管,并计算地下室膜衍生凝胶塞的重量。

4. 消化地下室膜衍生凝胶塞

1. 在冰上解冻(10 mL)。
2. 使用干净的精细剪刀将基底膜衍生凝胶塞在微离心管中切碎。
3. 将800 μL的消膜加入每个含有基底膜衍生凝胶塞的微离心管中。
4. 涡旋与最大速度为10s,以中断插头。
5. 在热混合器中,在 1,400 rpm 的转速下,在 37°C 下孵育微离心管 2 小时,以完全溶解基底膜衍生凝胶塞。
6. 2小时后,在RT处以400 x g离心10分钟,小心地取出并丢弃上清液。
7. 通过反转或攻丝将颗粒重新悬浮在 1x PBS 的 1 mL 中。
8. 在 RT 处以 200 x g重复离心 10 分钟。小心地取出并丢弃上清液。
9. 在 300 μL 的 PBS 中重新悬浮颗粒。
10. 在单独的微离心管中取50μL的细胞悬浮液。
11. 在细胞悬浮液中加入0.5 μL的钙素AM(1 M)。
    注:钙素AM是一种绿色荧光细胞活力染料,只积聚在活细胞中。
12. 在37°C的CO2培养箱中孵育细胞10分钟。
13. 使用自动细胞计数器对绿色荧光(活)和非荧光(死)细胞进行计数。

5. 使用单细胞西胸(scWB)分析确定细胞悬浮液中的细胞组成

1. 在 Rt 在培养皿中以 15 mL 的 1x 悬浮缓冲液重新冻结 scWB 芯片至少 10 分钟。
2. 将稀释后的单个细胞悬浮液(10,000-100,000个电池/mL)加入1 mL的再水化芯片。将表面放在 10 厘米培养皿的底部。确保曲面设置平整。
3. 用盖子盖住培养皿,防止干燥,让细胞通过梯度沉淀5-15分钟。
4. 将芯片置于明场显微镜下,以 10 倍放大倍率检查井。
   注:大约15-20%的微孔应该由单细胞占用,少于2%的孔应包含2个或更多细胞
5. 将包含芯片的 10 厘米培养皿倾斜 45 度。
6. 使用 1x 悬架缓冲液清洗芯片,通过从芯片顶部到底部温和移液,从芯片表面去除未捕获的电池。重复3次。
7. 准备单细胞西式仪器。
8. 设置赖沙时间、电泳时间和紫外线捕获时间。分析从地下室膜衍生凝胶塞中回收的招募巨噬细胞,使用以下设置:分管时间:0 s;电泳时间:160 s;紫外线捕获时间 240 s。
9. 小心地将芯片加载到单细胞西式仪器的电泳单元中,凝胶面朝。小心不要损坏芯片的凝胶侧。
10. 将裂液/运行缓冲液倒入腔室,并完全覆盖整个单细胞西芯片。启动细胞莱沙。
11. 使用 5.8 中列出的设置运行 scWB 仪器。
12. 一旦运行完成,将芯片转移到10厘米培养皿,并在RT用1倍洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
13. 制备原抗体稀释剂(抗葡萄脂:1:10;抗CD45:1:15,抗CD11b:1:20,抗F4/80:1:10),总体积为80μL的抗体稀释剂(混合8μL抗体1加8μL抗体2加64μL稀释剂)。
14. 将80μL的初级抗体溶液添加到抗体探测室,并将芯片凝胶侧下降低,使抗体溶液在芯片上芯。
15. 在RT用原抗体溶液孵育2小时。
16. 在摇床上的 1 倍洗涤缓冲液中,将芯片清洗三次,10 分钟。
17. 在摇床的水中清洗一次芯片10分钟,以脱盐凝胶。
18. 在总体积为80μL(混合2μL的二级抗体加78μL稀释剂)中制备1:20稀释二次抗体。
19. 在RT保护光线时,用二级抗体孵育芯片1小时。
20. 用1倍洗涤缓冲液在摇床上清洗芯片三次10分钟。
21. 使用滑动微调器旋转芯片以移除任何剩余的洗涤缓冲液。
22. 在荧光光与次级抗体耦合的光谱通道以 5 μm 分辨率扫描双激光微阵列扫描仪上的芯片。
23. 使用特定于 scWB 的软件分析数据。

6. 剥离 scWB 芯片

1. 将扫描的芯片存放在洗涤缓冲液中,直到准备剥离。
2. 将水浴放在烟罩中。
3. 将 50 mL 管架放在水浴中,水距机架仅 1 厘米,并将水温设置为 60°C。
4. 准备剥离缓冲区。对于1 L剥离缓冲液,在900 mL蒸馏水中溶解9.85克Tris-HCl(pH 6.8)和20克SDS,并调整pH。然后加入蒸馏水至1L。每次使用前加入0.8%(v/v)β-甲苯醇(β-ME;14.3 M)。
5. 初次扫描后,将芯片放入10厘米培养皿中,然后再剥离。
6. 对于每个芯片,取取40 mL的剥离缓冲液,并加入320μl的β-ME。
   注意:β-ME对人类和环境有毒和有害。应在烟罩中执行以下步骤。
7. 将芯片放入罐中,用防渗膜密封罐,以防止水泄漏到罐中。
8. 将罐放在管架内的预加热水浴中。
9. 孵育90分钟。
10. 小心地从罐子中取出芯片,放入新鲜的培养皿中。
11. 用1x洗涤缓冲液短暂清洗芯片一次。然后加入 15 mL 的 1x 洗涤缓冲液到培养皿中。
12. 在摇床上清洗芯片 15 分钟。重复洗涤步骤四次。
    注:芯片已准备好用于下一个初级抗体(参见步骤 5.12 - 5.21)。

结果

为了获得血液单核细胞对化学吸引剂的响应能力,我们向每只小鼠的左右侧翼注射车载和MCP-1加载的基底膜衍生溶液。注射后1天、3天和5天,将基底膜衍生的凝胶塞取出,溶解并加入每个塞内细胞(图1A)。通过从 MCP-1 加载插头(闭合柱)中的单元计数中减去车载插头(开杆)中的单元计数,我们获得了响应 MCP-1(+ 细胞编号,图 1B)而专门招募的细胞数。我们观察到在5天期间加速MCP-1特定细胞的招募和积累,其比率从每天31,000个细胞(第1天)增加到78,000个细胞/天(第3天),第5天每天136,000个细胞(图1B)。

为了识别进入基底膜衍生凝胶塞的细胞类型,我们根据从每个插头分离的细胞进行单细胞西斑分析(scWB),探测CD45、CD11b和F4/80表达,以识别单核细胞(CD11b⁼F4/80)^-), 巨噬细胞 (CD11b⁺F4/80⁺加上 CD11b^-F4/80⁺) 和剩余的非单细胞白细胞 (CD45⁺CD11b^-F4/80^-) (图2)。然后,对scWB芯片进行探查,以测定每个凝胶上的总细胞数,并确认scWB芯片上微孔的单细胞占用率。MCP-1加载的基底膜衍生凝胶塞中单核细胞的百分比在第1天、20%时处于低位,在第3天达到47%的峰值,第5天降至14%(图2D)。MCP-1 加载的基底膜衍生凝胶塞内的巨噬细胞数量从第 1 天的 13% 稳步增加至第 3 天的 22%和第 5 天的 23%。对于 MCP-1 加载插头,隔离细胞群中单核细胞加巨噬细胞的百分比在第 3 天最高,车辆加载插头(图 3A)为 31%,MCP-1 加载插头为 58%(图 3B),表明 3 天后MCP-1依赖性化学细胞招募的绝大多数细胞是单核细胞和巨噬细胞。尽管单核细胞加巨噬细胞的总数在第5天比第3天(图3C和D)高,但由于单核细胞和巨噬细胞在细胞总数中所占的比例明显较高(图3A)和B),第3天的细胞计数更准确地反映了血液单细胞化学和招募。因此,我们通常在牺牲动物前三天注射基底膜衍生溶液。MCP-1招募的所有巨噬细胞是否都是单核衍生物还是从邻近组织招募的常驻巨噬细胞,尚未确定。

此处显示的数据的统计分析是使用分析软件(例如,SigmaPlot 14)进行的。ANOVA随后的Fischer LSD测试用于比较实验组之间的平均值。所有数据均以至少 3 个独立实验的均值和 SD 形式呈现。结果在P < 0.05 水平上被认为具有统计显著性。

图 1: 将细胞定量加入皮下基底膜衍生凝胶塞中。(A) 车辆装载(开杆)和 MCP-1 加载的基底膜衍生凝胶插头(闭合杆)的绝对电池数。(B) MCP-1 引入地下室膜衍生凝胶插头的细胞数量,计算为 MCP-1 加载插头和车载插头之间的细胞数差异。结果显示为均值 = SD (n=4)请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:通过单细胞西斑分析,对进入基底膜衍生凝胶塞的细胞群进行分析。(A+B)在注射三天后从鼠标分离出的车辆载载 (控制) 和 MCP-1 铅插头 (MCP-1)的 scWB 分析中,显示了代表性示例。标有针对CD45、CD11b和F4/80的抗体的芯片,然后是《议定书》中所述的荧光二级抗体。每个细胞标记带的荧光强度显示为峰值区域。(C+D)细胞群被确定为单核细胞 (CD11b⁺F4/80 ^-, ), 巨噬细胞 (CD11b⁺F4/80⁺加上 CD11b^-F4/80⁼)或非单细胞白细胞 (CD45⁺, ).其余单元格标记为"其他" ()。结果显示为均值 = SD (n = 3)。请点击此处查看此图的较大版本。 

图 3: 基底膜衍生凝胶塞的单核细胞和巨噬细胞含量。定量分析在注射后第1天、第3天和第5天取出的车辆装载和MCP-1加载插头中招募的单核细胞和巨噬细胞含量。值显示为总细胞群的百分比 (A + B) 和每个插头的绝对细胞数 (C + D)。结果显示为均值 = SD (n = 3)。请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

我们开发了一种体内化学化学测定,利用基底膜衍生基质的独特物理特性,以及用化学基质加载这种独特的基质并将其注射到小鼠体内的能力。该测定使我们能够评估活小鼠对化学细胞(和巨噬细胞)的反应能力,如MCP-1所示,以及基因操纵或药理学、饮食和其他环境暴露对单核细胞的影响趋 化。由于我们在这些小鼠中创造的化学梯度基本上不受遗传、药理学、饮食或环境暴露的影响,单核细胞化学策略活性的变化实际上反映了这些单核细胞的功能变化,正如我们所展示的以前,也重新编程在蛋白质和转录水平17,20。我们报告说,小鼠的代谢应激增加单细胞对化学吸引剂的反应,这种超化学性活性与增加的蛋白质S-谷氨酸化相关,一种可逆的,依赖氧化还原的后转化蛋白质修饰,在大多数情况下导致酶和蛋白质功能的损失21,22,在某些情况下甚至促进蛋白质降解16,23。

为了成功执行这一程序并获得最佳结果,通过这种测定,必须缓慢地注入准确的基底膜衍生溶液,以创建一个奇异的成形良好的塞和纤维胶囊。完全获得清洁插头时收获地下室膜衍生凝胶插头,有利于溶解整个插头在消生溶液。我们的数据表明,将插头留在动物体内三天可优化 1) 信号强度,即每个插头中招募的单核细胞和巨噬细胞的数量,2) 信号的选择性,即单核细胞和巨噬细胞在总细胞群和3)信号的特异性,即单核细胞和巨噬细胞在MCP-1响应时与车辆相比的增加。最后,我们演示了如何利用最先进的单细胞方法与基底膜衍生凝胶插头测定一起,对插入插头中的单核细胞进行表征,从而获得潜在表型的快照。单细胞衍生巨噬细胞被招募到任何给定小鼠模型中的损伤部位,以响应特定的遗传、药理学、饮食或环境干预。

要考虑的测定有若干限制。首先,小鼠处理,包括麻醉,注射地下室膜衍生溶液,和手术解剖需要实践产生单插头和可重复的数据。其次,虽然大多数被招募到MCP-1加载插头的细胞是单核细胞和巨噬细胞,但相当多的细胞不是。这可能会影响对该细胞群执行的其他非单细胞分析分析分析的解释。最后,由于scWB的细胞分裂条件温和,蛋白质的迁移距离可能与标准WB不同,可能与蛋白质大小无关。因此,细胞解毒和运行时间都必须验证每个要测试的新蛋白质和使用的每个主要抗体。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm petri dish	griner bio-one	664 160
10x suspension buffer	proteinsimple	R101
15 cm petri dish	Falcon	353025
2-Mercaptoethanol	MP BIOMEDICALS	2194705
5% washing buffer	proteinsimple	R252
Antibody diluent	proteinsimple	042-203
Bench Top Centrifuge	Beckman Coulter		Microfuge 22R Centrifuge
Bovine Serim Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein AM	ThermoFisher	C3099	1 ml
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) rabbit mAb	Cell Signal Technologies	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Cellometer Vision	Nexcelom
Dispase	BD	354235	100 ml
Dissecting sissor
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 conjugate
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 conjugate
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Heat Block	effendorf	22331	Thermomixer
Lysis/Running buffer	proteinsimple	R200
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)	BD	354230	10 ml
Microarray scanner	PerkinElmer	ScanArray Gx
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129
Microscope	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		Single cell western
Needle	BD	305111	26G
Parafilm
Probing chamber	proteinsimple	035-020
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein	R&D	479-JE-050
scWEST chip	proteinsimple	C300
Shaker	Bioexpress		Gene mate orbital shaker
Single cell western chip canister	proteinsimple	035-118
Slide spinner	Labnet	C1303-T
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
Syringe	BD	309602	1 ml
Tris-Hydrochloride	Fisher Scientific	BP 153-500
Tweezer	proteinsimple	035-020
Water bath	ThermoFisher