Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).

Abstract

L'omeostasi dei tessuti e la riparazione dipendono in modo critico dall'assunzione di macrofagi derivati da monociti. Sia il sotto- che l'esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite. Abbiamo dimostrato che le diete ad alto contenuto di grassi e ad alto contenuto di zucchero promuovono l'innesco e la disfunzione monociti, convertendo monociti del sangue sani in un fenotipo iperchimico pronto a differenziarsi in macrofagi con profili di attivazione disregolati e fenotipici alterati plasticità. Si ritiene che l'eccessivo reclutamento di macrofagi derivati da monociti e il reclutamento di macrofagi con profili di attivazione disregolati siano un importante contributore allo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui l'aterosclerosi e l'obesità. L'obiettivo di questo protocollo è quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue come biomarcatore per l'innesco e la disfunzione monociti e caratterizzare i monociti del sangue del fenomeno dei macrofagi sono pronti a differenziarsi in questi modelli murini. Utilizzando l'analisi a macchia occidentale a singola cellula, mostriamo che dopo 24 h 33% delle cellule reclutate in fedi di gel derivate dalla membrana seminterrato MCP-1 caricate nei topi sono monociti e macrofagi; 58% dopo il giorno 3. Tuttavia, il giorno 5, i numeri di monociti e macrofago sono diminuiti significativamente. Infine, mostriamo che questi saggi consentono anche l'isolamento dei macrofagi vivi dai tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea, che possono quindi essere sottoposti a conseguente caratterizzazione mediante l'analisi di macchie occidentali a singola cellula.

Introduzione

Il reclutamento di macrofagi di origine monocite è essenziale per lo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui aterosclerosi e obesità^{1,2,3, 4}. Il numero di macrofagi derivati da monociti nei siti di lesioni ai tessuti e la loro plasticità sono fondamentali per l'omeostasi dei tessuti e la riparazione. Sia il sotto- che l'esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite⁵. Innescando l'infiammazione dei tessuti locali, ad esempio, dall'accumulo e dall'ossidazione della lipoproteina a bassa densità (LDL) nella parete aortica o dall'attivazione infiammatoria di adipociti da acidi grassi o lipopolissaccofaride batterica che fuoriescono attraverso il barriera, porta al rilascio di mediatori infiammatori, comprese le chemiochine come la proteina chemiosante monocito-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 è un membro della famiglia chemiochina C-C e un chemioattraente chiave responsabile del reclutamento di macrofagi di origine monocitica in siti di infiammazione tissutale e lesioni^{6,7,8, 9,10}. L'attivazione infiammatoria dell'endotelio vascolare determina l'espressione di adere molecole come la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e la molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1)^11,12, monociti circolanti attivati da MCP-1 per rotolare, aderire fermamente e successivamente trasmigrare nello spazio subendoteliale¹². Infiltrarsi monociti si differenziano in macrofagi, che possono essere attivati in un fenotipo infiammatorio, guidando il processo infiammatorio acuto. Guidati dal microambiente, i macrofagi pro-infiammatori possono convertirsi in macrofagi che risolvono l'infiammazione, che svolgono un ruolo critico nella cancellazione delle cellule infiammatorie, rimuovendo i segnali pro-infiammatori e completando la riparazione e la ferita dei tessuti guarigione^12,13.

Primi monociti di stress metabolico cronico monociti per una reattività drammaticamente migliorata agli attrattivi di chemio e aumento del reclutamento di monociti, e abbiamo dimostrato che i monociti innescati danno origine a macrofagi con programmi di attivazione disregolati e polarizzazione Stati^14,15,16. Monocyte priming promuove l'aterosclerosi, l'obesità, e possibilmente altre malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici come steatoepatite, malattie renali e possibilmente cancro. Per valutare e quantificare l'innesco monocito nei modelli murini delle malattie umane, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per valutare lo stato di innesco dei monociti del sangue misurando l'attività chemiotattica in vivo^{14,15,16, 17}. Il nostro approccio prevede l'iniezione di gel derivato dalla membrana del seminterrato caricato con un chemioattraente - usiamo comunemente MCP-1 - o veicolo nel fianco sinistro e destro, rispettivamente, di topi. Quando iniettato con cura sottocutaneamente, il gel derivato dalla membrana del seminterrato formerà un singolo tappo, da cui le chemiochine possono diffondersi e creare un gradiente chemiotattico definito che non è influenzato dallo stato metabolico o infiammatorio dell'ambiente circostante tessuto o il mouse destinatario.

Il gel di base derivato dalla membrana che usiamo per il nostro saggio è una preparazione solubile della membrana del seminterrato estratta dal sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumore ricco di tali proteine a matrice extracellulare (ECM). Questa complessa miscela proteica contiene laminoina (60%), collagene IV (30%), la molecola di ponte entactin (8%) e una serie di fattori di crescita. Il test della spina a matrice a membrana seminterrato è stato originariamente sviluppato per studiare l'angiogenesi in risposta a vari fattori di crescita^18,19. Tuttavia, al fine di studiare la chemiotassidi monocite, è importante utilizzare il gel di matrice derivata dalla membrana del seminterrato impoverito dal fattore di crescita per ridurre al minimo il reclutamento di cellule endoteliali e l'angiogenesi. Ciò che rende Matrigel (noto come gel derivato dalla membrana seminterrato d'ora in poi) unico e particolarmente utile è che a temperature inferiori ai 10 gradi si liquefa, permettendo lo scioglimento delle chemiochine. A temperature superiori ai 22 gradi centigradi, la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato subisce rapidamente una transizione di fase e forma rapidamente un idrogel. Le spine possono essere ascise chirurgicamente, pulite e dissolte con una metalloproteasi neutra derivata da bacillo per produrre sospensioni a cella singola, che possono essere analizzate su una selezionatrice cellulare attivata a fluorescenza (FACS), da RNAseq, RNA a celle singole e una varietà di altri tecniche omiche. Qui descriviamo l'uso dell'analisi delle macchie occidentali unicellulari per la caratterizzazione delle popolazioni cellulari reclutate nei tappi di gel derivati dalla membrana seminterrato uno, tre o cinque giorni dopo l'iniezione.

Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Wake Forest School of Medicine.

1. Preparazione della soluzione derivata dalla membrana del basamento con carico MCP-1

NOT: Questa è una procedura sterile.

1. Cappa di coltura cellulare pulita con disinfettante prima di preparare la soluzione derivata dalla membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel).
2. Preparare la siringa sterile da 1 mL imballata individualmente e pulire la parte superiore della fiala derivata dalla membrana seminterrato con un tampone di alcool prima di caricarla nella siringa.
3. Scongelare completamente la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato ridotta completamente dal suolo sul ghiaccio.
   ATTENZIONE: Se la matrice della membrana del seminterrato viene scongelata a temperatura ambiente (RT), assicurarsi che una piccola particella di ghiaccio rimanga per evitare che la soluzione si geli.
4. Una volta scongelato, aprire la fiala e mescolare MCP-1 o 1xPBS con 0.1% BSA nella cappa di coltura cellulare.
5. Preparare una siringa sterile da 1 mL con un ago da 26 G e raffreddare sul ghiaccio.
6. Preparare una soluzione stock di MCP-1 sciogliendo MCP-1 a una concentrazione finale di 50 g/mL in 1 x PBS con 0,1% BSA.
7. Diluire MCP-1 in 5 mL fredda terra membrana-derivata soluzione ad una concentrazione finale di 500 ng/mL. Preparare una quantità uguale di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato solo con il veicolo (1x PBS contiene 0,1% BSA).
8. Caricare 500 l di soluzione derivata dalla membrana del seminterrato (con o senza MCP-1) nella siringa fredda da 1 mL.
9. Rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa derivata dalla membrana del seminterrato prima di effettuare l'iniezione per garantire una formazione uniforme della spina.

2. Iniezione di soluzione derivata da membrana sotterranea

1. Spruzzare il 70% di etanolo intorno all'area di procedura prima e durante le iniezioni per disinfettare l'ambiente.
2. Per indurre l'anestesia, posizionare il topo in una camera di anestesia e impostare il misuratore di flusso O₂ a 1 litro/min, quindi regolare il vaporizzatore al 2% isoflurane.
3. Monitorare la profondità dell'anestesia monitorando la frequenza respiratoria (tasso/min), il riflesso corneale e il movimento dei baffi.
4. Durante l'intera procedura, mantenere l'anestesia utilizzando un cono naso.
5. Durante la procedura continuare a monitorare la frequenza respiratoria (tasso/min), riflesso corneale e movimento dei baffi per verificare la profondità dell'anestesia.
6. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzico di punta, iniettare lentamente (circa 100 l/s) la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato sottocutaneamente a destra (senza MCP-1) e a sinistra (con MCP-1) fianco del mouse, rispettivamente. Se l'iniezione è troppo lenta, i tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato possono diventare di forma irregolare, o addirittura frammentati, e difficili da rimuovere.
7. Tenere la siringa per 20-30 s dopo l'iniezione per evitare la perdita della soluzione e per consentire la formazione di un singolo gel-plug liscio.
8. Dopo l'iniezione, posizionando il mouse sulla piastra di riscaldamento con il monitoraggio fino al recupero.
9. Riportare il mouse alla gabbia originale una volta che il mouse è completamente recuperato.

3. Raccogliere le spine Gel derivate dalla membrana del seminterrato

1. Pesare due tubi di microcentrismo da 1,5 mL separati per ogni topo ed etichettarli.
2. Tre giorni dopo l'iniezione della soluzione derivata dalla membrana del seminterrato, eutanasia il topo nella camera anestetica utilizzando 3% isoflurane seguita da lussazione cervicale.
3. Rimuovere la pelliccia dorsale del mouse con tagliacapelli o applicare la crema per la rimozione dei capelli con bastoncini con punta di cotone per 5 min e poi pulire.
4. Tenere la pelle del topo utilizzando pinze intorno alla vertebra lombare inferiore toracica e superiore e fare un'incisione lunga 2 mm nella pelle.
5. Tagliare la linea mediana della parte posteriore del topo da un'incisione fatta fino alle vertebre cervicali e fino a 1 cm sopra la giunzione delle vertebre caudale (giunzione della coda) utilizzando forbici chirurgiche.
6. Separare la pelle dallo strato muscolare e pin-down la pelle su una piattaforma di schiuma di polistirolo.
7. Tenere con attenzione la capsula fibrosa che contiene il tappo di gel derivato dalla membrana seminterrato utilizzando pinze sottili e rimuovere la capsula fibrosa utilizzando forbici fini per pulire la spina.
8. Rimuovere la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato pulita e trasferire a 1,5 mL di microcentrifuga (vedi 3.1).
9. Pesare il tubo di microcentrifuga con la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato pulita e calcolare il peso del tappo di gel derivato dalla membrana del seminterrato.

4. Digerire le spine Gel derivate dalla membrana del seminterrato

1. Dispase scongelato (10 mL) sul ghiaccio.
2. Tritare la spina gel derivata dalla membrana del seminterrato nel tubo di microcentrifuga utilizzando forbici pulite e fini.
3. Aggiungere 800 l di dispasi in ogni tubo di microcentrifuga contenente spina di gel derivata dalla membrana sotterranea.
4. Vortex con velocità massima per 10 s per interrompere la spina.
5. Incubare i tubi di microcentrifuga per 2 h a 37 gradi centigradi a 1.400 giri/min in un termomixer per sciogliere completamente la spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato.
6. Dopo 2 h, centrifugare a 400 x g per 10 min a RT. Rimuovere con attenzione e scartare il supernatale.
7. Risospendere il pellet in 1 mL di 1x PBS invertendo o toccando.
8. Ripetere la centrifuga a 200 x g per 10 min a RT. Rimuovere con attenzione e scartare il supernatante.
9. Risospendere il pellet in 300 gradi L di PBS.
10. Prendere 50 -L di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga separato.
11. Aggiungete alla sospensione cellulare 0,5 l di calceina AM (1 M).
    NOT: Calcein AM è un coloranti di vitalità delle cellule fluorescenti verdi che si accumula solo nelle cellule viventi.
12. Incubare le cellule in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 10 min.
13. Contare le cellule fluorescenti verdi (vive) e non fluorescenti (morte) utilizzando un contatore cellulare automatizzato.

5. Determinazione della composizione cellulare nella sospensione cellulare utilizzando l'analisi Blot occidentale a cella singola (scWB)

1. Reidratare il chip scWB prima dell'uso in 15 mL di 1x tampone di sospensione in una piastra Petri per almeno 10 min a RT.
2. Aggiungere 1 mL della sospensione a singola cella diluita (10,000-100.000 cellule/mL) al chip reidratato. Impostare la superficie sul fondo di un piatto Petri di 10 cm. Assicurarsi che la superficie sia impostata su piatta.
3. Coprire il piatto Petri con un coperchio per evitare l'essiccazione e lasciare che le cellule si accerchiano per 5-15 min per gradiente.
4. Posizionare il chip al microscopio a campo luminoso e ispezionare i pozzetti con ingrandimento 10x.
   NOT: Circa il 15-20% dei micropozzi devono essere occupati da una singola cellula, meno del 2% dei pozzi dovrebbe contenere 2 o più cellule
5. Inclinare di 45 gradi la teglia Petri di 10 cm contenente il chip.
6. Lavare il chip con il buffer di sospensione 1x per rimuovere le celle non catturate dalla superficie del chip con un leggero tubo dall'alto verso il basso del chip. Ripetere 3 volte.
7. Preparare lo strumento occidentale a cella singola.
8. Impostare il tempo di lisi, il tempo di elettroforesi e il tempo di cattura UV. Per analizzare i macrofagi reclutati recuperati dalla spina di gel derivata dalla membrana del seminterrato, utilizzare le seguenti impostazioni: tempo di lisi: 0 s; tempo di elettroforesi: 160 s; Tempo di cattura UV 240 s.
9. Caricare con attenzione il chip nella cella di elettroforesi dello strumento occidentale a cella singola, rivolto verso il lato gel. Prestare attenzione a non danneggiare il lato gel del chip.
10. Versare il buffer di lisi/corsa nella camera e coprire completamente l'intero chip occidentale a cella singola. Iniziare la lisi della cellula.
11. Eseguire lo strumento scWB utilizzando l'impostazione elencata nella 5.8.
12. Una volta completata la corsa, trasferire il chip in una parabola Petri da 10 cm e lavare il chip due volte con 1x buffer di lavaggio per 10 min a RT.
13. Preparare le diluizioni dell'anticorpo primario (anti-vinculina: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) in un volume totale di 80 -L di diluente (mix 8 - L of anticorpo 1 più 8 : L di anticorpo 2 più 64 L diluente).
14. Aggiungere 80 l della soluzione anticorpale primaria alla camera di sonda anticorpale e abbassare il lato gel del chip verso il basso in modo che la soluzione anticorpale si blocca attraverso il chip.
15. Incubare con la soluzione anticorpale primaria per 2 h a RT.
16. Lavare il chip tre volte per 10 min in 1x tampone di lavaggio sullo shaker.
17. Lavare il chip una volta per 10 min in acqua sullo shaker per dissalare il gel.
18. Preparare una diluizione di 1:20 di anticorpi secondari in un volume totale di 80 -L (mix 2 - L di anticorpo secondario più 78 L di diluente).
19. Incubare il chip con anticorpo secondario per 1 h a RT protetto dalla luce.
20. Lavare il chip tre volte per 10 min con 1x tampone di lavaggio sullo shaker.
21. Girare il chip utilizzando un filatore scorrevole per rimuovere il buffer di lavaggio rimanente.
22. Eseguire la scansione del chip su uno scanner microarray a doppio laser a risoluzione di 5 m nel canale spettrale del fluoroforo accoppiato agli anticorpi secondari.
23. Analizzare i dati utilizzando un software specifico di scWB.

6. Spogliare il chip scWB

1. Conservare il chip scansionato nel buffer di lavaggio fino a quando non è pronto a spogliarsi.
2. Mettere il bagno d'acqua in un cappuccio fume.
3. Mettere un rack di tube da 50 mL nel bagno d'acqua con l'acqua appena 1 cm sopra il rack e impostare la temperatura dell'acqua a 60 gradi centigradi.
4. Preparare il buffer di stripping. Per 1 L di soluzione di stripping buffer, sciogliere 9,85 g di Tris-HCl (pH 6,8) e 20 g di SDS in 900 mL di acqua distillata e regolare il pH. Quindi riempire con acqua distillata a 1L. Aggiungere lo 0,8% (v/v) di z-mercaptoetanolo (z-ME; 14,3 M) immediatamente prima di ogni utilizzo.
5. Dopo la scansione iniziale, mettere il chip in un piatto Petri 10 cm prima di spogliarsi.
6. Per ogni chip, prendere 40 mL di buffer di stripping e aggiungere 320 l di z-ME.
   AVVISO: il sito è tossico e pericoloso per l'uomo e l'ambiente. La seguente procedura deve essere eseguita in una cappa di fumi.
7. Posizionare il chip nel contenitore e sigillare il contenitore con parafilm per evitare perdite d'acqua nel contenitore.
8. Posizionare il contenitore all'interno del rack del tubo nel bagno d'acqua preriscaldato.
9. Incubare per 90 min.
10. Rimuovere con cura il chip dal contenitore e mettere in un piatto Petri fresco.
11. Lavare brevemente il chip una volta con 1x tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 15 mL di 1x detersivo tampone al piatto Petri.
12. Lavare il chip per 15 min su uno shaker. Ripetere il passaggio di lavaggio quattro volte.
    NOT: Il chip è pronto per il prossimo anticorpo primario (vedere i passaggi da 5.12 - 5.21).

Risultati

Per accedere alla reattività dei monociti del sangue ai chemoattraenti, abbiamo iniettato una soluzione cuordistica carica di veicoli e MCP-1 ha caricato una soluzione cuorduello sui fianchi sinistro e destro di ogni topo. I tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato sono stati rimossi 1, 3 e 5 giorni dopo le iniezioni, disciolti e le cellule reclutate in ogni spina sono state contate (Figura1A). Sottraendo il numero di celle nella spina caricata dal veicolo (barre aperte) dal numero di celle nella spina caricata MCP-1 (barre chiuse), abbiamo ottenuto il numero di celle specificamente reclutate in risposta a MCP-1 (numero di cella, Figura 1B). Abbiamo osservato un reclutamento accelerato MCP-1-specifico e accumulo di cellule nel periodo di 5 giorni, con tassi che aumentano da 31.000 cellule / giorno (giorno 1) a 78.000 cellule / giorno (giorno 3) e 136.000 cellule al giorno 5 (Figura 1B).

Per identificare i tipi di cellule che sono entrati nei tappi di gel derivati dalla membrana seminterrato, abbiamo sottoposto le cellule isolate da ogni spina all'analisi della macchia occidentale a singola cella (scWB), alla sonda per l'espressione CD45, CD11b e F4/80 per identificare i monociti (CD11b ^-), macrofagi (CD11b^,F4/80^, più CD11b^-F4/80⁾e rimanenti leucociti non monocitici (CD45^,CD11b^-F4/80^-) (Figura 2). I chip scWB sono stati poi sondati per la vinculina per determinare il numero totale di cellule su ogni gel e per confermare l'occupazione singola delle cellule dei micropozzi sul chip scWB. La percentuale di monociti all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 era bassa al giorno 1, 20%, ha raggiunto il picco al terzo giorno rispettivamente al 47%, prima di scendere al 14% al giorno 5 (Figura 2D). I numeri di macrofago all'interno dei tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 sono aumentati costantemente dal 13% al giorno 1, al 22% il giorno 3 e al 23% il giorno 5. Per le spine MCP-1 caricate, la percentuale di monociti più macrofagi all'interno della popolazione di cellule isolate era più alta al giorno 3, il 31% nei tappi caricati dal veicolo (Figura 3A) e il 58% nelle spine MCP-1 caricate (Figura 3B), indicando che dopo 3 giorni la stragrande maggioranza delle cellule reclutate dalla chemiotassi dipendente da MCP-1 sono monociti e macrofagi. Anche se il numero totale di monociti più macrofagi era più alto al giorno 5 rispetto al giorno 3 (Figura 3C e D), a causa della percentuale significativamente più elevata di monociti e macrofagi nella popolazione cellulare totale (Figura3A e B), il conteggio cellulare al giorno 3 riflette in modo più accurato il monocito del sangue chemiotassi e il reclutamento. Pertanto, iniettiamo regolarmente la soluzione derivata dalla membrana seminterrato tre giorni prima di sacrificare gli animali. Non è stato determinato se tutti i macrofagi reclutati da MCP-1 da MCP-1 siano monociti o mafigi residenti reclutati dai tessuti vicini.

L'analisi statistica dei dati qui mostrati è stata condotta con un software di analisi (ad esempio, SigmaPlot 14). ANOVA seguito dal test Fischer LSD è stato utilizzato per confrontare i valori medi tra gruppi sperimentali. Tutti i dati sono presentati come media: SD di almeno 3 esperimenti indipendenti. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi a livello p < 0,05.

Figura 1 : Quantitazione delle cellule reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea sottocutanei. (A) Numeri di cellule assoluti per i veicoli caricati (barre aperte) e tappi di gel derivati dalla membrana del seminterrato MCP-1 (barre chiuse). (B) Il numero di celle reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea da MCP-1, calcolati come differenza nei numeri di cella tra i tappi caricati da MCP-1 e quelli caricati dal veicolo. I risultati sono mostrati come media : SD (n. 4) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2 : Analisi delle popolazioni cellulari reclutate in tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea mediante analisi di macchie occidentali a singola cellula. ( A- B) Sono riportati esempi rappresentativi per l'analisi scWB di un veicolo caricato (Control) e di una spina MCP-1 con piombo (MCP-1) isolata da un mouse tre giorni dopo l'iniezione. Chip etichettati con anticorpi diretti contro CD45, CD11b e F4/80 seguiti da anticorpi secondari fluorescenti come descritto nel Protocollo. L'intensità di fluorescenza della banda etichettata per ogni singola cellula viene visualizzata come area di picco. (C-D) Le popolazioni cellulari sono state identificate come monociti (CD11b^-F4/80^- , ), macrofagi (CD11b^,F4/80^, più CD11b^-F4/80^, ) o come leucociti non monocitici (CD45⁾ , ). Le celle rimanenti sono stateetichettate come "altre" ( ). I risultati sono indicati come media : SD (n e 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3 : Contenuto monocito e macrofago di spine in gel derivate dalla membrana sotterranea. Analisi quantitativa del contenuto di monocyte e macrofago reclutato in spine caricate da veicoli e MCP-1 rimosse al giorno 1, 3 e 5 post-iniezione. I valori vengono visualizzati come percentuale della popolazione totale di celle (Ae B) e in numeri di cella assoluti per spina ( Ce D). I risultati sono indicati come media : SD (n e 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Discussione

Abbiamo sviluppato un saggio chemiotassico in vivo, sfruttando le proprietà fisiche uniche della matrice derivata dalla membrana del seminterrato e la capacità di caricare questa matrice unica con chemiochini e iniettarla nei topi. Il test ci permette di valutare nei topi viventi la reattività dei monociti (e dei macrofagi) alle chemiochini, come illustrato qui per MCP-1, e gli effetti della manipolazione genetica o delle esposizioni farmacologiche, alimentari e di altro tipo sul monocito Chemiotassi. Poiché il gradiente di chemiochina che creiamo in questi topi non è essenzialmente influenzato dall'esposizione genetica, farmacologica, alimentare o ambientale, i cambiamenti nell'attività chemiotattica monocite riflettono effettivamente i cambiamenti funzionali in questi monociti e, come abbiamo dimostrato in precedenza, anche la riprogrammazione sia a livello proteico che trascrizionale^17,20. Abbiamo riferito che lo stress metabolico nei topi aumenta la reattività monocitica al chemiodontico e che questa attività iper-chemiotassica è correlata con l'aumento della proteina S-glutathionylation, un reversibile, redox-dipendente post-traduzionale modificazione delle proteine, che nella maggior parte dei casi porta alla perdita di energia enzimatica e proteica^21,22, e in alcuni casi anche promuove la degradazione delle proteine^16,23.

Per eseguire con successo questa procedura e per ottenere risultati ottimali con questo saggio è fondamentale che i volumi precisi di soluzione derivata dalla membrana seminterrato vengano iniettati lentamente per creare un singolare spina ben formata e capsule fibrose devono essere rimosse completamente per ottenere tappi puliti durante il raccolto scalzo membrana-derivato tappi tappi gel, facilita la dissoluzione dell'intero plug nella soluzione dispasi. I nostri dati mostrano che lasciare la spina negli animali per tre giorni ottimizza 1) l'intensità del segnale, cioè il numero di monociti e macrofagi reclutati in ogni spina, 2) la selettività del segnale, vale a dire il contenuto di monociti e macrofagi all'interno del popolazioni cellulari totali e 3) la specificità del segnale, vale a dire l'aumento dei monociti e dei macrofagi in risposta all'MCP-1 rispetto al veicolo. Infine, dimostriamo come approcci a cellule singole all'avanguardia in combinazione con l'analisi della spina in gel derivata dalla membrana del seminterrato possono essere utilizzati per caratterizzare i monociti reclutati nei tappi e ottenere così un'istantanea del potenziale fenotipo di i macrofagi di origine monocite vengono reclutati in siti di lesioni in qualsiasi modello murino in risposta a specifici interventi genetici, farmacologici, dietetici o ambientali.

Ci sono una serie di limitazioni del saggio da considerare. In primo luogo, la movimentazione del mouse, tra cui l'anestesia, l'iniezione di soluzione derivata dalla membrana seminterrato e la dissezione chirurgica richiede pratica per generare singoli tappi e dati riproducibili. In secondo luogo, mentre la maggior parte delle cellule reclutate nei tappi caricati MCP-1 sono monociti e macrofagi, un numero sostanziale non lo sono. Questo può influenzare l'interpretazione di altri saggi analitici non basati su singole cellule eseguiti su questa popolazione cellulare. Infine, poiché le condizioni di lisi cellulare per scWB sono lievi, le distanze di migrazione delle proteine possono differire dalla STRUTTURA DI confronto standard e non possono essere correlate alle dimensioni delle proteine. Pertanto, sia la lisi cellulare che i tempi di esecuzione devono essere convalidati per ogni nuova proteina da testare e per ogni anticorpo primario utilizzato.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm petri dish	griner bio-one	664 160
10x suspension buffer	proteinsimple	R101
15 cm petri dish	Falcon	353025
2-Mercaptoethanol	MP BIOMEDICALS	2194705
5% washing buffer	proteinsimple	R252
Antibody diluent	proteinsimple	042-203
Bench Top Centrifuge	Beckman Coulter		Microfuge 22R Centrifuge
Bovine Serim Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein AM	ThermoFisher	C3099	1 ml
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) rabbit mAb	Cell Signal Technologies	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Cellometer Vision	Nexcelom
Dispase	BD	354235	100 ml
Dissecting sissor
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 conjugate
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 conjugate
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Heat Block	effendorf	22331	Thermomixer
Lysis/Running buffer	proteinsimple	R200
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)	BD	354230	10 ml
Microarray scanner	PerkinElmer	ScanArray Gx
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129
Microscope	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		Single cell western
Needle	BD	305111	26G
Parafilm
Probing chamber	proteinsimple	035-020
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein	R&D	479-JE-050
scWEST chip	proteinsimple	C300
Shaker	Bioexpress		Gene mate orbital shaker
Single cell western chip canister	proteinsimple	035-118
Slide spinner	Labnet	C1303-T
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
Syringe	BD	309602	1 ml
Tris-Hydrochloride	Fisher Scientific	BP 153-500
Tweezer	proteinsimple	035-020
Water bath	ThermoFisher