链球菌中高分子质量蛋白的纯化

摘要

这里描述的是一个简单的方法，用于纯化链球菌中的基因产物。该技术在蛋白质，特别是膜蛋白和高分子质量蛋白的纯化方面可能有利，可用于其他各种细菌物种。

摘要

解释基因的功能通常涉及野生型菌株和菌株的类名特征的比较，其中感兴趣的基因已被破坏。基因中断后功能丧失随后通过中断基因产物的外源性添加而恢复。这有助于确定基因的功能。前面描述的方法涉及生成gtfC基因破坏的链球菌菌株。在这里，描述了一种不要求的方法，用于在基因中断后从新生成的S.mutans菌株中纯化gtfC基因产物。它涉及在感兴趣的基因的3°端添加多聚苯乙烯编码序列，允许使用固定金属亲和色谱简单纯化基因产物。在此方法的遗传修饰中，不需要 PCR 以外的酶反应。基因破坏后通过外源性补充恢复基因产物是确定基因功能的有效方法，也可以适应不同的物种。

引言

对基因功能的分析通常涉及将野生型菌株的类特征与被破坏的菌株进行比较。一旦产生基因中断的菌株，基因产物的外源性添加允许功能恢复。

获得后续恢复测定所需的纯化基因产物的最常见方法是在大肠杆菌1中执行异体表达。然而，膜蛋白或高分子质量蛋白的表达往往很难使用^{这个系统1。}在这些情况下，目标蛋白通常从通过一系列复杂的步骤原生合成蛋白质的细胞中分离出来，这可能导致基因产物的丧失。为了克服这些问题，根据基因破坏^方法2、基于PCR的DNA拼接^方法3（指定的两步融合PCR）和基因电穿孔，为基因产物纯化开发了一个简单的程序。在链球菌的转化。在基因产品的C-终点区添加多肽标记（His-tag）有助于通过固定金属亲和色谱（IMAC）进行纯化。

为了分离His-tag表达菌株，感兴趣的基因的整个基因组DNA（在这个His-tag表达基因中断的菌株中）被一个抗生素抗药性标记基因所取代。产生His-tag表达应变的过程与产生基因中断的应变的过程几乎相同，如前面^{描述的4，5。}因此，基因破坏和基因产物分离的方法应作为功能分析的序列实验进行。

在本工作中，多聚苯二烯编码序列被附加到gtfC（GenBank locus标记SMU_1005）基因的3°端，在S.mutans6中编码葡聚酰亚胺转移酶-SI（GTF-SI）。然后，对链球菌物种进行表达研究。大肠杆菌实现异源性gtfC表达是困难的，很可能是因为GTF-SI的分子质量很高。这种菌株被命名为S.穆坦斯·克特夫克。图解图中描绘了野生S.mutans（S.mutans WT）中gtfC和光谱素抗基因盒（spc^r）7位数的组织及其衍生物。图 1.GTF-SI是一种分泌蛋白，有助于培育造血性牙科生物^膜6。在蔗糖的存在下，在WT S.mutans菌株的光滑玻璃表面上观察到粘附生物膜，但在S.mutans gtfC-中断菌株（S.mutans +gtfC）2、5.当重组GTF-SI的外源性添加后，生物膜形成在S.mutans _gtfC中恢复。应变，S.mutans His-gtfC，然后用于生产重组GTF-SI。

研究方案

注:在生成S. mutans _gtfC（其中 gtfC基因的整个编码区域被替换为spc^r）之前，必须在执行这些协议之前完成。有关第⁵代 的详细信息，请参阅已发表的文章。

1. 底漆设计

1. 准备引力为S.mutans他-gtfC的建设。
   注:本协议中使用的引性序列如表1所示。图2中图说明了用于生成S.mutans His-gtfC的两步融合PCR方法。
   1. 设计引物（gtfC-反向和spc^r-前） 用于附加 He-tag 编码序列，在gtfC基因和spc^r之间进行干预（图 2A）。
      1. 将 GS 链接器和 His 标记编码序列包括gtfC-反向和spc^r正向引基器中，其中 5' 区域的 24 个基块相互补充。
         注:GS链接器和其标签的氨基酸序列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-his-His-His-his-His-his-his-His-his-His-his-his-his-His-his-his-His-His-His-His-His-His-His-His-his-his-his-his-his-his-his-his-his-his-His-his-his-his-his-his-his-his-His-his-his-his-his-his
      2. 设计一个gtfC-前引基，以针对S.mutans WT基因组中的gtfC基因 >1 kb 在基因的下游和spc^r-反向引基，以靶向spc r的下游侧翼区域在S.穆坦斯[gtfC ] .设置gtfC正向和spc^r-反向底漆的熔融温度⁸ （T_m），以匹配gtfC- 反向和spc^r的熔融温度 - -分别向前引注。
   2. 为第二个 PCR 设计嵌套引体（嵌套正向和嵌套反向）（图2B）。
   3. 设计引物（gtfC-前向和菌落-反向），具体用于转化剂的基因组DNA（图2C;引物用于菌落PCR）。
      注:放大放大器跨越gtfC和spc^r之间的边界。gtfC-前引基可以用作前引基。
   4. 设计引体（上向和向下反向），用于最终确认S.mutans His-gtfC的生成（图2C;引体放大的PCR产物用于DNA测序）。

2.从S.mutans中提取基因组DNA

注:在厌氧条件下，每个S.mutan菌株应在37°C的脑心脏输注（BHI）培养中培养。S. mutans _gtfC和S. mutans His-gtfC 的突变菌株在 BHI 中培养，辅以 100 μg/mL 光谱霉素。

1. Streak S. mutan的 WT 和S. mutans _gtfC分别放在每个 BHI 琼脂板上。在37°C下孵育它们过夜。
2. 使用消毒牙签选择S. mutanWT 或S. mutans +gtfC的单菌落，并接种到 1.5 mL 的 BHI 肉汤中。在37°C下孵育它们过夜。
   注:菌落可用作第一个PCR的模板DNA来源（步骤3.1）。
3. 将每个细菌培养物的 1 mL 转移到 1.5 mL 微离心管中。在15，000 x g下将培养层离心1分钟。
4. 取出上清液，加入1 mL的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0），以重新悬浮细胞颗粒。
5. 在 15，000 x g下将悬架离心 1 分钟。拆下上清液。在 50 μL 的 Tris-EDTA 缓冲液 （pH 8.0） 中重新悬浮细胞颗粒。
6. 在 95°C 下，使用块培养箱加热悬浮液 5 分钟。在 15，000 x g下将悬架离心 5 分钟。
7. 将上清液转移到新的1.5 mL微离心管（上清液将作为第一个PCR的模板DNA）。

3. PCR 放大

注:表1、表2和表3分别总结了PCR引注、试剂和扩增周期。

1. 使用S. mutan的 WT 和S. mutans +gtfC基因组作为 PCR 模板执行第一个 PCR。使用步骤 1.1.1.2 中描述的引基（图 2A）放大包含gtfC基因下游部分的区域和那些怀有spc^r的区域。
2. 电噬每个PCR产物在1%的胶胶上。使用硅膜凝胶提取方法，从凝胶中纯化所需的DNA片段约1，000 bp和2，000 bp。
   注:PCR^9、DNA凝胶电^泳10和DNA纯^化11的基本程序在其他地方详细介绍。
3. 使用第一个 PCR（近似等值）的产品作为 PCR 模板，使用嵌套正向和嵌套反向引物执行第二个 PCR（图2B）。
4. 在胶凝剂凝胶上电噬十二分之一的PCR混合物。确认产生约 3，000 bp 的适当放大量。
5. 沉淀剩余的PCR产品。
   注:无需纯化PCR产物，因为第二PCR产生的非特异性放大器不会干扰同源重组。
   1. 将无核酸酯水加入 PCR 混合物，使总体积达到 100 μL，然后是 0.1 卷（10 μL） 的 3 M 醋酸钠 （pH 5.2） 和 2.5 卷 （250 μL） 绝对乙醇。在室温 （RT） 下混合并储存混合物 10 分钟。
   2. 在4°C下在15，000 x g下将样品离心20分钟。丢弃上清液。加入1 mL的70%乙醇来清洗DNA颗粒。
   3. 在 4°C 下在 15，000 x g下将样品离心 5 分钟。丢弃上清液。用10μL无核酸酶水风干并溶解DNA颗粒。

4. 细胞变换

1. 按照上一份^出版物5中描述的步骤，准备主管S. mutanWT 来介绍第二个 PCR 产品。将细胞储存在-80°C。
   注:在本实验中，合格的S.mutanWT细胞已经保存在-80°C中，以产生S.mutans_gtfC。
2. 将浓缩的第二种PCR产物的5μL混合到50μL等分的冰冷能细胞中先前冻结。将混合物加入电穿孔比质器中。使用电穿孔装置向电池提供单个电脉冲（1.8 kV、2.5 ms、600 Ω、10 μF）。
3. 在 500 μL 的 BHI 汤中重新悬浮细胞。立即将悬浮液的10~100μL扩散到含有霉素的BHI琼脂板上。在37°C下孵育板2~6天，直到菌落长长足可拾起。

5. Genome 重组和存储的验证

1. 执行菌落 PCR，使用 gtfC 正向和菌落反向底漆进行屏幕重组。电噬每个菌落PCR产物在一个胶质凝胶。确认大约 1，500 bp 的 DNA 片段。
2. 使用消毒牙签选择其中一个阳性菌落，并在含有霉素的BHI肉汤中过夜对细胞进行亚培养。
3. 将 0.8 mL 的细菌培养物与 0.8 mL 的无菌 50% 甘油混合，并在 -80°C 或 -20 °C 下储存。
4. 将剩余的1 mL细胞悬浮液转移到1.5 mL微离心管中。重复步骤2.3~2.7从细胞中提取基因组DNA。
5. 使用上冲和向下反向引注和基因组DNA作为模板执行PCR。重复步骤3.2，从凝胶中纯化扩增DNA产物。
6. 通过DNA测序确定纯化的安培龙的DNA序列。
   注:确保通过DNA测序确认S.mutans His-gtfC的产生。

6. 聚氨酰胺标记 GTF-SI 的纯化

1. Streak S. mutans将他的-gtfC 放在一个含有光谱霉素的 BHI 琼脂板上。在37°C下孵育它们过夜。
2. 使用消毒牙签和亚培养细胞在3 mL的BHI肉汤中拿起单个菌落。在37°C下孵育过夜。
3. 准备两个圆锥形瓶，1 L BHI汤，不含异种霉素。接种1 mL的过夜文化悬浮成1升BHI汤。在37°C下孵育过夜。
4. 通过硫酸铵沉淀浓缩培养上清液的蛋白质。
   注:如果目标蛋白质在细胞内，从细胞体中提取。硫酸铵沉淀的基本程序详^见12日。
   1. 在 4°C 下在 10，000 x g下将细菌培养悬浮液离心 20 分钟。将养殖上清液恢复到 3 L 玻璃烧杯中。
   2. 将 1，122 克硫酸铵添加到 2 L 的上清液（80% 饱和度），并使用磁性搅拌器进行强力搅拌。在4°C下搅拌，让沉淀形成4小时或更长时间。
      注:沉淀形成可以在一夜之间继续。
   3. 在4°C下将硫酸铵沉淀溶液在15，000 x g下离心20分钟。去上清。
   4. 用铲子收集沉淀物，然后转移到 200 mL 玻璃烧杯中。在35 mL的结合缓冲液中重新悬浮颗粒（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，5 mM imidazole，pH 8.0）。
   5. 使用再生纤维素透析管在4°C下，用搅拌将悬浮液与2，500 mL结合缓冲液进行透析。2小时后更换透析溶液，过夜继续透析。
   6. 再次更换透析溶液。继续透析 2 小时。
5. 在 4°C 下将透析悬浮液在 20，000 x g下离心 10 分钟。使用吸滤设备通过膜过滤器过滤上清液。将滤液转移到 75 厘米²瓶中。
6. 通过固定金属亲和色谱法 （IMAC） 从过滤悬浮液中分离出多聚基酰胺标记的 GTF-SI。
   1. 将 2 mL 的 Ni 充电 IMAC 树脂浆料（约 1 mL 树脂）转移到色谱柱上，其出口安装在硅胶管上。通过重力流移除存储解决方案。
      警告:不要让树脂在整个 IMAC 中干燥。
   2. 将 3 mL 的蒸馏水加入柱中，以清洗树脂。加入5 mL的装订缓冲液，使树脂平衡。
   3. 用霍夫曼捏公鸡关闭流动。从步骤 6.5 添加 5 mL 的过滤悬浮液，以制造浆料。
   4. 将所有浆料添加到剩余的过滤悬浮液中。在 4°C 下轻轻旋转混合物 30 分钟。
   5. 将混合物装回列上。通过重力流拆下悬架。用 20 mL 的装订缓冲液清洗 IMAC 树脂。
      注:在接下来的 IMAC 中，使用霍夫曼捏旋塞将流速调整到大约 2 mL/min。
   6. 使用 20 mL 的洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0）来洗脱重组的 GTF-SI。
      注:可以在此处暂停该协议。埃卢特应储存在4°C。IMAC 树脂可重复使用。请参阅 IMAC 树脂的说明。
7. 将洗脱缓冲液替换为存储缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.5），并使用离心超滤单元将重组 GTF-SI 溶液浓缩至约 1 mL。将重组 GTF-SI 溶液储存在 4°C。
   注:使用SDS-PAGE¹³和西^印14，使用马萝卜过氧化物酶结合抗多聚苯甲酸酯单克隆抗体，确认多肽标记的GTF-SI纯化。增加 CHAPS（最终浓度，0.1%）可能需要洗脱剂，以避免非特异性吸附到单位，取决于目标蛋白质。

7. 重组GTF-SI的功能恢复

1. 将每个S. mutan的应变分别压到 BHI 琼脂板上。在37°C下孵育板。
2. 使用消毒牙签，拿起单个菌落接种成2 mL的BHI汤。在37°C下孵育过夜。
3. 使用 20 μL 的S. mutans -gtfC过夜培养，在玻璃试管中接种含有 1% 蔗糖的 2 mL BHI 肉汤，不含抗生素。将 GTF-SI 或车辆的等效体积添加到S. mutans +gtfC培养物中，并在一夜之间将管置于倾斜位置的细胞进行培养。
   注:使用无菌注射器过滤器对GTF-SI溶液进行消毒，并在使用前使用双辛酸蛋白^测定15确定蛋白质浓度。
4. 用涡旋混合器搅拌培养悬浮液10s。用足够的蒸馏水清洗试管。
5. 将生物膜染色在管壁上，1 mL 为 0.25% 的库马西亮蓝色 （CBB）。
6. 1分钟后将染色溶液浸渍，用足够的蒸馏水清洗试管。空气干燥试管。

结果

图 3显示了第一个 PCR（图 3A）和第二 PCR （图 3B） 中每个放大子的大小。如表 1所述，每个放大子的大小与预测大小相对应。图4A显示了用第二种PCR产品转化并镀在含有霉素的BHI琼脂板上的S.mutans菌落。然后，在胶凝剂凝胶上运行殖民地 PCR 产品 （?...

讨论

引体的设计是协议中最关键的一步。gtfC-反向和spc^r-前引基的序列根据gtfC的3°端区域和spc^r的5°端区域的顺序自动确定。每个引基包括 24 个互补基库，这些基础对 GS 链接器进行编码，并在其 5' 区域对 His-tag 编码序列进行编码。通过在 3° 端添加 His 标记编码序列，可以避免位于上游侧翼区域的本机调控序列中断。DNA停止科顿必须从gtfC-反向引基器中...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation