Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Özet

Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.

Özet

Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ' sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.

Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli¹heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur^1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi², PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi³ (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.

O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır^4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.

Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ' sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans⁶. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI'nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spc^r) yabani tip S. mutanlarda ⁷ loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik diş^biyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)^2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC'de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.

Protokol

1. Astar tasarımı

1. S. mutans His-gtfCinşaatı için astar hazırlayın.
   NOT: Bu protokolde kullanılan astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir. S. mutans Üretimi için iki aşamalı füzyon PCR yöntemiHis-gtfC şematik Şekil 2'degösterilmiştir.
   1. Tasarım astarları (gtfC-ters ve spc^r-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki için, gtfC geni ve spc^r (Şekil 2A)arasında müdahale.
      1. GS bağlantı ve His-tag-kodlama dizisini gtfC-reverse ve spc^r-forward astarlarına ekleyin, 5' bölgelerdeki 24 taban birbirini tamamlayıcı dır.
         NOT: GS bağlayıcısı ve Onun-tag amino asit dizisi (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) gen çevirisi yoluyla GTF-SI C-terminus bağlı.
      2. S. mutans WT genomunda gtfC genini hedeflemek için gtfC-ileri astar tasarla >1 kb genin aşağı akışı ve spc^r-ters astar, spc r'nin aşağı yakan bölgesini hedeflemek için S. mutans içinde •gtfC. GTFC -forwardve spc^r-reverse astarların erime^{sıcaklığını} gtfC-ters ve spc^rerime sıcaklıklarıile eşleşecek şekilde ayarlayın - ileri astarlar, sırasıyla.
   2. İkinci PCR(Şekil 2B)için iç içe astar (iç içe dönük ve iç içe dönük-ters) tasarla.
   3. Transformantın genomik DNA'sına özgü tasarım astarları(gtfC-ileri ve koloni-ters)(Şekil 2C; koloni PCR için astarlar kullanılır).
      NOT: Amplicons gtfC ve spc^rarasındaki sınır straddle . GTFC-forwardastarı ileri astar olarak uygulanabilir.
   4. S. mutans His-gtfC (Şekil 2C;astarlar tarafından amplifiye PCR ürün DNA dizileme için kullanılır) üretimi son onay için tasarım astar (yukarı-ileri ve aşağı-ters).

2. S. mutanlardan genomik DNA Çıkarma

NOT: Her S. mutans suşu anaerobik koşullarda 37 °C'de beyin kalp infüzyonu (BHI) orta kültüre olmalıdır. S. mutanların mutant suşları •gtfC ve S. mutans His-gtfC BHI 100 μg/mL spectinomycin ile desteklenmektedir.

1. Streak S. mutans WT ve S. mutans •gtfC ayrı ayrı BHI agar plakaları her üzerine. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
2. S. mutans WT veya S. mutans • sterilize kürdan kullanarakgtfC tek kolonileri seçin ve BHI suyu 1,5 mL içine aşılamak. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
   NOT: Koloniler ilk PCR için şablon DNA kaynağı olarak kullanılabilir (adım 3.1).
3. Her bakteri kültürünün 1 mL'sini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. 15.000 x g1 dakika için kültür santrifüj .
4. Süpernatant çıkarın ve hücre pelet yeniden askıya almak için Tris-EDTA tampon (pH 8.0) 1 mL ekleyin.
5. 15.000 x g1 dakika için süspansiyon santrifüj . Supernatant çıkarın. Hücre peletini 50 μL Tris-EDTA tamponunda (pH 8.0) yeniden askıya alın.
6. Süspansiyonu blok kuvöz kullanarak 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Santrifüj süspansiyon için 5 dakika 15.000 x g.
7. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın (supernatant ilk PCR için şablon DNA olarak hizmet verecektir).

3. PCR Amplifikasyon

NOT: Tablo 1, Tablo 2ve Tablo 3, sırasıyla PCR astarlarını, reaktifleri ve amplifikasyon döngülerini özetler.

1. PCR şablonları olarak S. mutanve S. mutans •gtfC genomu kullanarak ilk PCR'yi gerçekleştirin. GTFC geninin aşağı kısmını barındıran bölgeleri ve adım 1.1.1.2'de tanımlanan astarları kullanarak spc^r'yi barındıran bölgeleri güçlendirin(Şekil 2A).
2. Her PCR ürününü %1 agarose jel üzerinde elektrofore edin. Yaklaşık 1.000 bp ve 2.000 bp. Silika membran bazlı jel çıkarma yöntemi kullanarak jellerden parçaları arındırmak için istenilen DNA parçaları excise.
   NOT: PCR^9,DNA jel elektroforezi¹⁰ve DNA arınması¹¹ için temel prosedürler başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
3. İç içe ve iç içe dönük astarlarla PCR şablonları olarak ilk PCR (yaklaşık equimolar) ürünlerini kullanarak ikinci bir PCR gerçekleştirin(Şekil 2B).
4. Agarose jel üzerinde PCR karışımının onda biri elektrofore. Yaklaşık 3.000 bp uygun amplicon üretimi onaylayın.
5. Kalan PCR ürüne çökeltin.
   NOT: İkinci PCR tarafından üretilen spesifik olmayan amplikonlar homolog rekombinasyona müdahale etmediğinden, PCR ürününün saflaştırılması gerekli değildir.
   1. PCR karışımına çekirdeksiz su ekleyin ve toplam hacmi 100°L'ye getirin ve ardından 0,1 hacim (10°L) 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve 2,5 hacim (250°L) mutlak etanol ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca karıştırın ve saklayın.
   2. Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 20 dk santrifüj edin. Supernatant atın. DNA peletini yıkamak için %70 etanol1 mL ekleyin.
   3. Numuneyi 4 °C'de 15.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın. Hava kuruve 10 μL nükleaz içermeyen su ile DNA pelet eritin.

4. Hücre Dönüşümü

1. Önceki yayında açıklanan adımları izleyerek ikinci PCR ürün tanıtmak için yetkili S. mutans WT hazırlayın⁵. Hücreleri -80 °C'de saklayın.
   NOT: Bu deney için, yetkin S. mutans WT hücreleri zaten -80 °C'de S. mutans oluşturmakiçin korunmuştur .
2. Konsantre ikinci PCR ürününün 5 μL'sini daha önce dondurulmuş buz gibi donmuş 50 μL'lik buz gibi yetkin hücrelerle karıştırın. Elektroporasyon cuvettes içine karışımı ekleyin. Elektroporasyon cihazını kullanarak hücrelere tek bir elektrik darbesi (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) verin.
3. BHI suyu 500 μL hücreleri resuspend. Hemen, spektinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine süspansiyon 10-100 μL yayıldı. 37 °C'de 2-6 gün boyunca kolonyalar alınacak kadar büyüyüp, 2-6 gün kuluçkaya yatırın.

5. Genome Rekombinasyon ve Depolama Doğrulama

1. Rekombinasyon için ekrangtfC ileri ve koloni-ters astar kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Elektroforse bir agarose jel üzerinde her koloni PCR ürün. Yaklaşık 1500 bp'lik DNA parçasını doğrulayın.
2. Bir steril kürdan ve subculture kullanarak pozitif kolonilerden birini seçin bhi brop spectinomycin içeren 2 mL bir gecede hücreleri.
3. 0,8 mL bakteri kültürünü 0,8 mL steril %50 gliserol ve -80 °C veya -20 °C'de stokla karıştırın.
4. Kalan 1 mL hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Genomik DNA'yı hücrelerden çıkarmak için 2.3-2.7 adımlarını tekrarlayın.
5. Bir şablon olarak ileri ve aşağı-ters astarlar ve genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirin. Güçlendirilmiş DNA ürününü jellerden arındırmak için 3.2 adımını tekrarlayın.
6. Saflaştırılmış amplikontenin DNA dizilimini DNA dizilimi ile belirleyin.
   NOT: S. mutans His-gtfC'nin neslini DNA dizilimi ile doğruladıklarından emin olun.

6. Polihistidin arınması-etiketli GTF-SI

1. Streak S. bir spectinomycin içeren BHI agar plaka üzerineHis-gtfC mutans. 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
2. BHI suyu 3 mL sterilize kürdan ve alt kültür hücreleri kullanarak tek bir koloni pick up. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. Spectinomycin olmadan BHI suyu 1 L ile iki konik şişeleri hazırlayın. BHI suyu 1 L içine gece kültürü süspansiyon 1 mL aşılamak. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
4. Amonyum sülfat çökelti ile kültür supernatant konsantre proteinler.
   NOT: Hedef protein hücre içi ise hücre cisimlerinden ayıklayın. Amonyum sülfat çökeltisi için temel prosedürler başka bir yerde^{ayrıntılı 12}.
   1. 4 °C'de 10.000 x g'de 20 dk için bakteri kültürü süspansiyonuna santrifüj edin. 3 L cam bir kabın içine kültür supernatant kurtarın.
   2. 1.122 g amonyum sülfat ekleyin 2 L supernatant (80% doygunluk) bir manyetik karıştırıcı kullanarak güçlü karıştırma ile. Çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha fazla süreyle karıştırılarak oluşmasına izin verin.
      NOT: Çökelti oluşumu bir gecede devam edilebilir.
   3. 4 °C'de 20 dk için 15.000 x g amonyum sülfat çökelmiş çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatant'ı decant.
   4. Bir spatula ile çökelti toplamak ve 200 mL cam kabıiçine aktarın. Bağlayıcı tamponun 35 mL'lik peletlerini yeniden askıya alın (50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).
   5. 4 °C'de, yeniden üretilen selüloz diyaliz tüpü kullanılarak bağlayıcı tamponun 2.500 mL'lik süspansiyonu karıştırarak diyalize karşı diyalize titretin. 2 saat sonra diyaliz solüsyonu değiştirin ve bir gecede diyalize devam edin.
   6. Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. Ek bir 2 saat için diyaliz devam edin.
5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'de diyaliz süspansiyonu santrifüj edin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatant'ı bir membran filtreden geçirin. Filtrat'ı 75 cm^2'lik bir şişeye aktarın.
6. Immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) tarafından filtröz süspansiyondan polihistidin etiketli GTF-SI'yi fraksiyone alın.
   1. Ni yüklü IMAC reçine bulamacının 2 mL'sini (yaklaşık 1 mL reçine) çıkış çıkışı silikon bir tüpe monte edilmiş bir kromatografik kolona aktarın. Yerçekimi akışı ile depolama çözeltisi çıkarın.
      DİkKAT: Resenin IMAC boyunca kurumasını izin verme.
   2. Reçine yıkamak için sütuniçine distile su 3 mL ekleyin. Rezorsu dengelemek için bağlama arabelleği 5 mL ekleyin.
   3. Bir Hoffmann çimdik horoz ile akışı kapatın. Bulamaç yapmak için adım 6.5 filtreli süspansiyon 5 mL ekleyin.
   4. Kalan filtreli süspansiyon tüm bulamaç ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dk hafifçe döndürün.
   5. Karışımı sütuna geri yükleyin. Yerçekimi akışı ile süspansiyon kaldırın. IMAC reçiyi 20 mL bağlayıcı arabellekle yıkayın.
      NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann çimdik horoz ile yaklaşık 2 mL / dk akış hızı ayarlayın.
   6. Elüsyon tamponunun 20 mL'si (50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) rekombinant GTF-SI'yi eleştirmek.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Eluat 4 °C'de depolanmalıdır. IMAC reşini yeniden kullanılabilir. IMAC rezorinin talimatlarına bakın.
7. Elüsyon tamponu depolama tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.5) ile değiştirin ve rekombinant GTF-SI çözeltisini santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi kullanarak yaklaşık 1 mL'ye yoğunlaştırın. Rekombinant GTF-SI çözeltisini 4 °C'de saklayın.
   NOT: SDS-PAGE¹³ ve batı lekeleme¹⁴ kullanarak polihistidin etiketli GTF-SI arınma doğrulayın bir horseradish peroksidaz-konjuge anti-polihistidin monoklonal antikor kullanarak. CHAPS ilavesi (son konsantrasyon, %0.1) eluent için hedef proteine bağlı olarak, birim nonspesifik adsorpsiyon önlemek için gerekli olabilir.

7. Rekombinant GTF-SI tarafından Fonksiyonel Restorasyon

Sonuçlar

Şekil 3, ilk PCR(Şekil 3A)ve ikinci PCR(Şekil 3B)her bir amplicon boyutunu gösterir. Her amplicon boyutu Tablo 1'deaçıklandığı gibi, öngörülen boyutu ile karşılık gelir. Şekil 4A, ikinci PCR ürünü ile dönüştürülmüş ve spectinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine kaplanmış S. mutans kolonilerini göstermektedir. ...

Tartışmalar

Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spc^r-forward astarlarının dizileri, gtfC'nin 3' son bölgesi nin ve spc^r'nin5' uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5'bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3' sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation