Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Резюме

Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.

Аннотация

Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 "конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.

Введение

Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.

Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli¹. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему^1. В этих случаях, целевой белок, как правило, изолированы из клеток, которые родно синтезирует белок через комплекс ряд шагов, которые могут привести к потере генного продукта. Чтобы преодолеть эти проблемы, простая процедура была разработана для очистки генного продукта после метода нарушения гена^2,ПЦР на основе метода сращивания ДНК³ (обозначенный двухступенчатый фьюжн ПЦР), и электропорации для генетической преобразование в Streptococcus mutans. Добавление тега полихистидина (His-tag) к C-термину с генным продуктом облегчает его очистку путем обездвижения хроматографии сродства металла (IMAC).

Чтобы изолировать его-тег-выражение штамма, вся геномная ДНК гена интереса (в этом Его-тег-выражение гена нарушенных штамма) заменяется антибиотикорезистентный маркер гена. Процедура для генерации Его-тег-выражение strainis почти идентичны, что для генерации гена нарушенных штамма, как описано ранее^4,5. Поэтому методы нарушения генов и изоляции генного продукта должны выполняться в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа.

В настоящей работе, последовательность политистидина-кодирования прилагается к 3 "конец gtfC (GenBank локус тег SMU-1005) ген, кодирование glucosyltransferase-SI (GTF-SI) в S. mutans⁶. Затем были проведены экспрессионные исследования стрептококковых видов. Достижение гетерологичного выражения gtfC E. coli затруднено, вероятно, из-за высокой молекулярной массы GTF-SI. Этот штамм называется S. mutans His-gtfC. Схематическая иллюстрация, изображающая организацию кассеты гена gtfC и spectomycin resistance(spc^r)⁷ локусов в диком типе S. mutans (S. mutans WT) и его производных показана в Рисунок 1. GTF-SI является секреторным белком, который способствует развитию кариогенной стоматологической биопленки⁶. При наличии сахарозы, адепт биопленка наблюдается на гладкой стеклянной поверхности в WT S. mutans штамма, но не в S. mutans gtfC-нарушенныйштамм (S. mutans s gtfC)^2,5 . Формирование биопленки восстанавливается в S. mutans sgtfC при экзогенном добавлении рекомбинантного GTF-SI. Штамм, S. mutans His-gtfC, затем используется для производства рекомбинантных GTF-SI.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spc^r, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении⁵.

1. Дизайн Праймера

1. Подготовка грунтовки для строительства S. mutans Его-gtfC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, используемые в этом протоколе, отображаются в таблице 1. Двухступенчатый метод фьюжн ПЦР для генерации S. mutans His-gtfC схематично иллюстрируется на рисунке 2.
   1. Дизайн праймеров (gtfC-обратнойи spc^r-forward)для крепления его-тег-кодирования последовательности, вмешиваясь между геном gtfC и spc^r (Рисунок 2A).
      1. Включите GS linker и его-тег-кодирования последовательности в обоих gtfC-обратнойи spc^{r-вперед}праймеры, в которых 24 баз в 5 'регионов дополняют друг друга.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислотная последовательность связующим GS и его-тег (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His- His) прилагается к C-термину gtF-SI через перевод генов.
      2. Дизайн gtfC-впередгрунтовка для целевой gtfC гена в геноме S. mutans WT в S. mutans Установите температуру плавления⁸ (T_м) gtfC-впереди spc^{r-обратный}грунтовки в соответствии с температурой плавления gtfC-обратнойи spc^r- вперед грунтовки, соответственно.
   2. Дизайн вложенных грунтовок (вложенных вперед и вложенных обратного) для второго ПЦР(рисунок 2B).
   3. Дизайн праймеров(gtfC-впереди колонии-обратного) конкретные для геномной ДНК трансформаторов(Рисунок 2C; праймеры используются для колонии PCR).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ампромсоны пересекают границу между gtfC и spc^r. GTfC-впередгрунтовка может быть применена в качестве переднего грунтовки.
   4. Дизайн праймеров (вверх-вперед и вниз-обратно) для окончательного подтверждения поколения S. mutans His-gtfC (Рисунок 2C; пЦР продукт усиливается грунтовки используется для секвенирования ДНК).

2. Геномная ДНК Извлечение из S. mutans

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штамм S. mutans должен быть культивирован в инфузии сердца головного мозга (BHI) среде при 37 градусах Цельсия в анаэробных условиях. Штаммы мутантов S. mutans и S. mutans His-gtfC культивируются в BHI, дополненных 100 мкг/мл спектриномицина.

1. Streak S. mutans WT и S. mutans -gtfC отдельно на каждую из тарелок BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
2. Выберите одиночные колонии S. mutans WT или S. mutans sgtfC с помощью стерилизованной зубочистки и привить в 1,5 мл бульона BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии могут быть использованы в качестве источника шаблона ДНК для первого ПЦР (шаг 3.1).
3. Перенесите 1 мл каждой бактериальной культуры в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуги культуры в течение 1 мин на 15000 х г.
4. Удалите супернатант и добавьте 1 мл буфера Tris-EDTA (pH 8.0), чтобы повторно приостановить действие клеточной гранулы.
5. Centrifuge подвески в течение 1 мин на 15000 х г. Удалите супернатант. Повторное увеличение количества клеточных гранул в 50 зликатбуфера Tris-EDTA (pH 8.0).
6. Нагрейте подвеску с помощью блока инкубатора в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Centrifuge подвески в течение 5 мин на 15000 х г.
7. Перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл (супернатант будет служить шаблоном ДНК для первого ПЦР).

3. Усиление ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1, Таблица 2и таблица 3 обобщены праймеры ПЦР, реагенты и циклы усиления, соответственно.

1. Выполните первый ПЦР с использованием S. mutans WT и S. mutans sgtfC в качестве шаблонов ПЦР. Усиль регионы укрывательство вниз по течению часть гена gtfC и тех, укрывательство spc^r с помощью грунтовки описаны в шаге 1.1.1.2(Рисунок 2A).
2. Электрофорез каждый продукт ПЦР на 1% агарозный гель. Акциз желаемых фрагментов ДНК около 1000 bp и 2000 bp. Очистите фрагменты из гелей с помощью кремнезема мембраны на основе метода извлечения геля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основные процедуры для ПЦР^9,электрофорус днк-геля¹⁰и очистки ДНК¹¹ подробно описаны в других местах.
3. Выполните второй ПЦР с использованием продуктов первого ПЦР (приблизительно эквимолярных) в качестве шаблонов ПЦР с вложенными вперед и вложенными обратной праймеры(рисунок 2B).
4. Электрофорезоднаодная одна десятая смеси ПЦР на геле агарозы. Подтвердите генерацию соответствующего ампликона примерно 3000 б.п.
5. Осаждает оставшийся продукт ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка продукта ПЦР не требуется, так как неспецифические ампликоны, генерируемые вторым ПЦР, не мешают гомологическому рекомбинации.
   1. Добавьте в смесь ПЦР воду без нуклеайза и доведите общий объем до 100 кв.м., а затем 0,1 объема (10 л) 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2,5 тома (250 л) абсолютного этанола. Смешайте и храните смесь в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
   2. Центрифуги образца в течение 20 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Добавьте 1 мл 70% этанола для мытья гранул ДНК.
   3. Центрифуги образца в течение 5 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Воздух-сухой и растворить гранулы ДНК с 10 зл и без нуклеазы воды.

4. Преобразование клеток

1. Подготовьте компетентный S. mutans WT, чтобы представить второй продукт ПЦР, следуя шагам, описанным в предыдущей публикации⁵. Храните ячейки при -80 градусах По Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента компетентные клетки S. mutans WT уже сохранились в -80 градусах по Цельсию для генерации S. mutans .
2. Смешайте 5 qL концентрированного второго продукта ПЦР с 50 qL аликот ледяных компетентных клеток, замороженных ранее. Добавить смесь в электропорации кюветы. Дайте один электрический импульс (1,8 кВ, 2,5 мс, 600,0, 10 кВ) клеткам с помощью электропорационного аппарата.
3. Приостановите действие клеток в 500 л бульона BHI. Немедленно, распространение 10-100 л суспензии на BHI агар пластин, содержащих спектромицин. Инкубировать пластины в течение 2-6 дней при 37 градусах Цельсия, пока колонии не выросли достаточно, чтобы быть подобраны.

5. Проверка Genome рекомбинации и хранения

1. Выполните колонии PCR, используя gtfC-вперед и колонии-обратной грунтовки для экрана для рекомбинации. Электрофорез ы каждой колонии ПЦР продукт на агарозный гель. Подтвердите фрагмент ДНК примерно 1500 bp.
2. Выберите одну из положительных колоний с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток на ночь в 2 мл бульона BHI, содержащего спектромицин.
3. Смешайте 0,8 мл бактериальной культуры с 0,8 мл стерильного 50% глицерола и бульон при -80 градусах или -20 градусов по Цельсию.
4. Перенесите оставшийся 1 мл клеточной подвески в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Повторите шаги 2.3-2.7 для извлечения геномной ДНК из клеток.
5. Выполните ПЦР с использованием вверх вперед и вниз-обратно грунтовки и геномной ДНК в качестве шаблона. Повторите шаг 3.2 для очищения усиленного продукта ДНК от гелей.
6. Определите последовательность ДНК очищенного ампромликона по секвенированию ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы подтвердить поколение S. mutans Его-gtfC по секвенированию ДНК.

6. Очистка полистицидина по метке GTF-SI

1. Streak S. mutans His-gtfC на спектромицин-содержащую BHI агар пластины. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
2. Возьмите одну колонию с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток в 3 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
3. Приготовьте две конические колбы с 1 l бульона BHI без спектромицина. Прививать 1 мл ночной культуры подвески в 1 л бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
4. Концентрируйте протеины от supernatant культуры высыпанием сульфата аммония.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Извлекайте из клеточных тел, если целевой белок внутриклеточного. Основные процедуры для осадков сульфат аммония подробно в другом месте¹².
   1. Центрифуги бактериальной культуры суспензии в течение 20 мин при 10000 х г при 4 c. Восстановить культуры supernatant в 3 L стеклянный стакан.
   2. Добавьте 1122 г сульфата аммония в 2 л супернатанта (80% насыщения) с энергичным перемешиванием с помощью магнитного мешалки. Разрешить осадок сформировать в течение 4 ч или более при 4 градусах Цельсия с перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование осадка может быть продолжено в одночасье.
   3. Центрифуги аммиак сульфат-осаждаемый раствор при 15000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Декант супернатант.
   4. Соберите осадок шпателем и перенесите в стеклянный стакан 200 мл. Отрептутивать гранулы в 35 мл связывающего буфера (50 мм₂PO_4,300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, pH 8.0).
   5. Диализировать подвеску против 2500 мл связывающего буфера с помощью регенерированной целлюлозы диаметра трубки, при 4 кв С, с перемешиванием. Замените диализный раствор после 2 ч и продолжайте диализ на ночь.
   6. Замените раствор диализа снова. Продолжайте диализ для дополнительных 2 ч.
5. Центрифуга диализированной подвески на 20000 х г в течение 10 мин при 4 c. Фильтр супернатант через мембранный фильтр с помощью всасывающего фильтрационного оборудования. Перенесите фильтрат на колбу 75 см^2.
6. Фракция пополистидин-тегами GTF-SI от фильтрообразной подвески с помощью обездвиженной хроматографии сродства металла (IMAC).
   1. Передача 2 мл суспензии с госраствором IMAC (примерно 1 мл из мина семы) в хроматографическую колонку, розетка которой установлена на силиконовую трубку. Удалите решение для хранения с помощью гравитационного потока.
      ПРЕДЕКТО: Не допускайте высыхания по всему IMAC.
   2. Добавьте 3 мл дистиллированной воды в колонку, чтобы помыть посуду. Добавьте 5 мл связывающего буфера, чтобы уравновесить пошельнку.
   3. Выключите поток с Hoffmann щепотку петух. Добавьте 5 мл отфильтроченной подвески со ступени 6.5, чтобы сделать суспензию.
   4. Добавьте всю суспензию в оставшуюся отфильтрованную подвеску. Закрутите смесь осторожно в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
   5. Загрузите смесь обратно на столбец. Удалите подвеску гравитационным потоком. Вымойте resin IMAC с 20 мл связывающего буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте скорость потока примерно до 2 мл/мин с помощью рваного петуха Хоффмана на протяжении всего последующего IMAC.
   6. Выявите рекомбинантный GTF-SI с 20 мл элютионного буфера (50 мМ₂PO_4,300 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 8.0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Элуат должен храниться при 4 градусах Цельсия. Resin IMAC можно использовать повторно. Обратитесь к инструкциям для мизины.
7. Замените буфер elution буфером хранения (50 мМ фосфатный буфер, pH 6.5) и концентрируйте рекомбинантный раствор GTF-SI примерно на 1 мл с помощью центробежного ультрафильтрационного блока. Храните рекомбинантный раствор GTF-SI при 4 градусах По Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите политистидин помечены GTF-SI очистки с помощью SDS-PAGE¹³ и западной blotting^14, используя хрен пероксидазы-конъюгированные анти-полихистидин моноклональных антител. Добавление CHAPS (окончательная концентрация, 0.1%) к eluent может быть необходимо во избежание nonspecific adsorption к блоку, в зависимости от протеина цели.

7. Функционная реставрация рекомбинантной GTF-SI

1. Полоса каждого S. Mutans деформации на BHI агар пластины индивидуально. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
2. Используя стерилизованные зубочистки, подобрать одну колонию, чтобы привить в 2 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
3. Используйте 20 зЛ ночной культуры S. mutans и gtfC, чтобы привить 2 мл бульона BHI, содержащего 1% сахарозы без антибиотиков в стеклянной пробирке. Добавьте GTF-SI или эквивалентный объем транспортного средства к культуре S. mutans иgtfC, и культурные клетки с трубкой, помещенной в наклонное положение, на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать раствор GTF-SI с помощью стерильного фильтра шприца и определить концентрацию белка с помощью анализа белка бисинхониновой кислоты¹⁵ перед использованием.
4. Агитировать культуры подвески с вихрем смеситель для 10 s. Decant подвески. Вымойте пробирки достаточным количеством дистиллированной воды.
5. Пятно биопленок на трубчатой стене с 1 мл 0,25% Coomassie блестящий синий (CBB).
6. Декантирование окрашивающий раствор после 1 мин. Вымойте пробирки с достаточным количеством дистиллированной воды. Воздушно-сухие пробирки.

Результаты

На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A

Обсуждение

Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spc^r-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 "конец области gtfC и 5" конец области spc^r. Каждый праймер включает в себя 24 д...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation