Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

Resumen

Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.

Resumen

El esclarecimiento de la función de un gen típicamente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas y cepas de tipo salvaje en las que el gen de interés se ha interrumpido. La pérdida de la función después de la interrupción del gen se restaura posteriormente mediante la adición exógena del producto del gen alterado. Esto ayuda a determinar la función del gen. Un método descrito anteriormente implica la generación de una cepa de Streptococcus mutans interrumpida por el gen gtfC. Aquí, se describe un método poco exigente para purificar el producto del gen gtfC de la cepa s. mutans recién generada después de la interrupción del gen. Implica la adición de una secuencia de codificación de polihistidina en el extremo de 3o del gen de interés, que permite una simple purificación del producto genético mediante cromatografía de afinidad de metalinmovilizado. No se requieren reacciones enzimáticas que no sean PCR para la modificación genética en este método. La restauración del producto genético por adición exógena después de la interrupción del gen es un método eficaz para determinar la función génica, que también puede adaptarse a diferentes especies.

Introducción

El análisis de la función de un gen generalmente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas de tipo salvaje con cepas en las que el gen de interés se ha interrumpido. Una vez producida la cepa interrumpida por genes, la adición exógena del producto genético permite la restauración funcional.

El método más común para obtener productos genéticos purificados necesarios para ensayos de restauración posteriores es mediante la realización de expresiones hetólogas en Escherichia coli¹. Sin embargo, la expresión de proteínas de membrana o proteínas de alta masa molecular es a menudo difícil utilizando este sistema¹. En estos casos, la proteína diana generalmente se aísla de las células que sintetiza la proteína de forma nativa a través de una serie compleja de pasos, que pueden conducir a la pérdida del producto genético. Para superar estos problemas, se ha desarrollado un procedimiento sencillo para la purificación de productos genéticos siguiendo un método de interrupción genética^2,el método de empalme de ADN basado en PCR³ (designado PCR de fusión en dos pasos) y la electroporación para la genética transformación en Streptococcus mutans. La adición de una etiqueta de polihistidina (su etiqueta) a la terminal C del producto genético facilita su purificación mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).

Para aislar la cepa que expresa su etiqueta, todo el ADN genómico del gen de interés (en esta cepa interrumpida genéticamente his-tag-expressing) se reemplaza por un gen marcador resistente a los antibióticos. El procedimiento para generar la cepa His-tag-expressing es casi idéntico al de generar una cepa interrumpida genéticamente como se describió anteriormente^4,5. Por lo tanto, los métodos para la interrupción genética y el aislamiento de productos genéticos deben realizarse como experimentos en serie para el análisis funcional.

En el presente trabajo, se adjunta una secuencia de codificación de polihistidina al extremo de 3o del gen gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosiltransferasa-SI (GTF-SI) en S. mutans⁶. Luego, se realizaron estudios de expresión en una especie estreptocócica. Lograr la expresión heterotróloga de gtfC por E. coli es difícil, probablemente debido a la alta masa molecular de GTF-SI. Esta variedad se llama S. mutans His-gtfC. Una ilustración esquemática que representa la organización del casete genético de resistencia a gtfC y espectromicina (spc^r)⁷ loci en sándalo S. mutans (S. mutans WT) y sus derivados se muestra en Figura 1. El GTF-SI es una proteína secretor que contribuye al desarrollo de biofilm dental cariogénico^6. Bajo la presencia de sacarosa, se observa una biopelícula adherente en una superficie de vidrio liso en la cepa WT S. mutans pero no en la cepa interrumpida de S. mutans gtfC(S. mutans ágtfC)^2,5 . La formación de biopelículas se restaura en S. mutans ágtfC tras la adición exógena del GTF-SI recombinante. La cepa, S. mutans His-gtfC, se utiliza para producir el GTF-SI recombinante.

Protocolo

NOTA: La generación de S. mutans gt-fC, en la que toda la región de codificación del gen gtfC se sustituye por spc^r, debe completarse antes de realizar estos protocolos. Consulte el artículo publicado para obtener más información sobre la generación^5.

1. Diseño de imprimación

1. Preparar imprimaciones para la construcción de S. mutans His-gtfC.
   NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas en este protocolo se muestran en el Cuadro 1. El método PCR de fusión de dos pasos para la generación de S. mutans His-gtfC se ilustra esquemáticamente en la Figura 2.
   1. Imprimaciones de diseño (gtfC-reverse y spc^r-forward) para la fijación de la secuencia de codificación His-tag, interviniendo entre el gen gtfC y spc^r (Figura 2A).
      1. Incluya el vinculador GS y la secuencia de codificación His-tag en las imprimaciones gtfC-reverse y spc^r-forward, en las que 24 bases en las regiones de 5' son complementarias entre sí.
         NOTA: La secuencia de aminoácidos del vinculador GS y Su etiqueta (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) se une al término C de GTF-SI a través de la traducción genética.
      2. Diseñar una imprimación gtfC-forward para apuntar al gen gtfC en el genoma de S. mutans WT >1 kb aguas abajo del gen y la imprimación spc^r-reverse para apuntar a la región de flanqueo descendente de spc^r en el S. mutans gt-fC . Ajuste la temperatura de fusión⁸ (T_m) de las imprimaciones gtfC-adelante y spc^r-reverse para que coincidan con las temperaturas de fusión del gtfC-reverse y spc^r- imprimaciones delanteras, respectivamente.
   2. Diseñar imprimaciones anidadas (anidados hacia adelante y anidados) para el segundo PCR(figura 2B).
   3. Imprimaciones de diseño(gtfC-forward y colony-reverse) específicas para el ADN genómico del transformador(Figura 2C;los imprimadores se utilizan para la PCR de colonia).
      NOTA: Los amplicons se extienden por el borde entre gtfC y spc^r. La imprimación gtfC-forward se puede aplicar como imprimación delantera.
   4. Imprimaciones de diseño (hacia arriba y hacia abajo) para la confirmación final de la generación de S. mutans His-gtfC (Figura 2C;el producto PCR amplificado por los imprimadores se utiliza para la secuenciación de ADN).

2. Extracción de ADN genómico de S. mutans

NOTA: Cada cepa de S. mutans debe cultivarse en un medio de infusión del corazón cerebral (BHI) a 37 oC en condiciones anaeróbicas. Las cepas mutantes de S. mutans gtfC y S. mutans His-gtfC se cultivan en BHI complementado con 100 g/ml de espectromicina.

1. Streak S. mutans WT y S. mutans gtfC por separado en cada una de las placas de agar BHI. Incubarlos durante la noche a 37oC.
2. Escoge colonias únicas de S. mutans WT o S. mutans ágtfC usando un palillo esterilizado e inocula en 1,5 ml de caldo BHI. Incubarlos durante la noche a 37oC.
   NOTA: Las colonias pueden utilizarse como fuente de ADN de plantilla para la primera PCR (paso 3.1).
3. Transfiera 1 ml de cada cultivo bacteriano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar la cultura durante 1 min a 15.000 x g.
4. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml del tampón Tris-EDTA (pH 8.0) para resuspender el pellet celular.
5. Centrifugar la suspensión durante 1 min a 15.000 x g. Retire el sobrenadante. Resuspenda el gránulo celular en 50 ml de tampón Tris-EDTA (pH 8.0).
6. Calentar la suspensión con una incubadora de bloques durante 5 min a 95 oC. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 15.000 x g.
7. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (el sobrenadante servirá como ADN de plantilla para la primera PCR).

3. Amplificación de PCR

NOTA: El Cuadro 1, el Cuadro 2y el Cuadro 3 resumen los cuadros, reactivos y ciclos de amplificación de PCR, respectivamente.

1. Realice el primer PCR usando el genoma de S. mutans WT y S. mutans-gtfC como las plantillas de PCR. Amplificar las regiones que albergan la parte descendente del gen gtfC y las que albergan spc^r utilizando las imprimaciones descritas en el paso 1.1.1.2(Figura 2A).
2. Electroforrese cada producto de PCR en gel de agarosa al 1%. Exbobe los fragmentos de ADN deseados de aproximadamente 1.000 bp y 2.000 bp. Purifique los fragmentos de los geles utilizando el método de extracción de gel a base de membrana de sílice.
   NOTA: Los procedimientos básicos para PCR^9,electroforesis de gel de ADN¹⁰y purificación de ADN¹¹ se detallan en otros lugares.
3. Realice un segundo PCR utilizando los productos de la primera PCR (aproximadamente equimolar) como plantillas de PCR con los imprimadores anidados hacia adelante y anidados inversos(Figura 2B).
4. Electroforrese una décima parte de la mezcla de PCR en el gel de agarosa. Confirme la generación del amplicon apropiado de aproximadamente 3.000 bp.
5. Precipitar el producto PCR restante.
   NOTA: La purificación del producto PCR no es necesaria, ya que los amplicons no específicos generados por el segundo PCR no interfieren con la recombinación homóloga.
   1. Añadir agua libre de nucleasas a la mezcla de PCR y llevar el volumen total a 100 ml, seguido de 0,1 volumen (10 l) de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes (250 ml) de etanol absoluto. Mezclar y almacenar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
   2. Centrifugar la muestra durante 20 min a 15.000 x g a 4oC. Descarta el sobrenadante. Añadir 1 ml de 70% de etanol para lavar el pellet de ADN.
   3. Centrifugar la muestra durante 5 min a 15.000 x g a 4oC. Descarta el sobrenadante. Seca al aire y disuelve el pellet de ADN con 10 ml de agua libre de nucleasas.

4. Transformación celular

1. Preparar s. mutans WT competente para introducir el segundo producto PCR siguiendo los pasos descritos en la publicación anterior⁵. Almacene las celdas a -80 oC.
   NOTA: Para este experimento, las células competentes de S. mutans WT ya se han conservado en -80 oC para generar S. mutans ágtfC.
2. Mezclar 5 ml del segundo producto de PCR concentrado con la alícuota de 50 l de células competentes heladas con hielo y frío congeladas previamente. Añadir la mezcla en las cubetas de electroporación. Dar un solo pulso eléctrico (1,8 kV, 2,5 ms, 600 oC, 10 oF) a las células que utilicen el aparato de electroporación.
3. Resuspenda las células en 500 ml de caldo BHI. Inmediatamente, esparza de 10 a 100 ml de la suspensión en placas de agar BHI que contengan espectromicina. Incubar las placas durante 2-6 días a 37 oC hasta que las colonias hayan crecido lo suficiente como para ser recogidas.

5. Verificación de Genome Recombinación y almacenamiento

1. Realice la PCR de la colonia, usando los imprimadores gtfC-adelante y colony-reverse para detectar la recombinación. Electroforrese cada producto pcR de colonia en un gel de agarosa. Confirme el fragmento de ADN de aproximadamente 1.500 bp.
2. Escoge una de las colonias positivas usando un palillo esterilizado y subcultiva las células durante la noche en 2 ml de caldo BHI que contiene espectromicina.
3. Mezclar 0,8 ml de cultivo bacteriano con 0,8 ml de glicerol estéril al 50% y stock a -80 oC o -20 oC.
4. Transfiera el 1 ml restante de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita los pasos 2.3–2.7 para extraer el ADN genómico de las células.
5. Realice PCR utilizando los imprimadores hacia arriba y hacia abajo y el ADN genómico como plantilla. Repita el paso 3.2 para purificar el producto de ADN amplificado de los geles.
6. Determinar la secuencia de ADN del amplicon purificado mediante la secuenciación del ADN.
   NOTA: Asegúrese de confirmar la generación de S. mutans His-gtfC por secuenciación de ADN.

6. Purificación de GTF-SI con etiqueta de polihistidina

1. Streak S. mutans His-gtfC en una placa de agar BHI que contiene espemicina. Incubarlos durante la noche a 37oC.
2. Recoger una sola colonia utilizando un palillo de dientes esterilizado y células de subcultivo en 3 ml de caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.
3. Preparar dos matraces cónicos con 1 L de caldo BHI sin espectromicina. Inocular 1 ml de la suspensión de cultivo nocturno en 1 L del caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.
4. Concentrar las proteínas del sobrenadante del cultivo por precipitación de sulfato de amonio.
   NOTA: Extraiga de los cuerpos celulares si una proteína diana es intracelular. Los procedimientos básicos para la precipitación de sulfato de amonio se detallan en otros lugares^12.
   1. Centrifugar la suspensión del cultivo bacteriano durante 20 min a 10.000 x g a 4 oC. Recuperar el sobrenadante de cultivo en un vaso de vidrio de 3 L.
   2. Añadir 1.122 g de sulfato de amonio a 2 L del sobrenadante (80% de saturación) con agitación vigorosa utilizando un agitador magnético. Dejar que el precipitado se forme durante 4 h o más a 4oC con agitación.
      NOTA: La formación precipitada se puede continuar durante la noche.
   3. Centrifugar la solución precipitada con sulfato de amonio a 15.000 x g durante 20 min a 4oC. Decantar al sobrenadante.
   4. Recoger el precipitado con una espátula y transferir en un vaso de vidrio de 200 ml. Resuspender los pellets en 35 ml de tampón de unión (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0).
   5. Dializar la suspensión contra 2.500 ml del tampón de unión utilizando un tubo de diálisis de celulosa regenerada, a 4 oC, con agitación. Reemplace la solución de diálisis después de 2 h y continúe la diálisis durante la noche.
   6. Vuelva a colocar la solución de diálisis. Continúe dialize durante 2 h adicionales.
5. Centrifugar la suspensión dializada a 20.000 x g durante 10 min a 4oC. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de membrana utilizando un equipo de filtración por succión. Transfiera el filtrado a un matraz de 75 cm^2.
6. Fracciona el GTF-SI etiquetado con polihistidina de la suspensión filtrada por cromatografía de afinidad de metal inmovilizada (IMAC).
   1. Transfiera 2 ml de la suspensión de resina IMAC cargada con Ni (aproximadamente 1 ml de resina) a una columna cromatográfica cuya salida esté instalada en un tubo de silicona. Retire la solución de almacenamiento por el flujo de gravedad.
      PRECAUCION: No deje que la resina se seque a lo largo del IMAC.
   2. Añadir 3 ml de agua destilada en la columna para lavar la resina. Agregue 5 ml del búfer de unión para equilibrar la resina.
   3. Apaga el flujo con una polla de pizca Hoffmann. Agregue 5 ml de la suspensión filtrada del paso 6.5 para hacer la suspensión.
   4. Agregue toda la suspensión al resto de la suspensión filtrada. Gire suavemente la mezcla durante 30 minutos a 4 oC.
   5. Vuelva a cargar la mezcla en la columna. Retire la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 ml de tampón de unión.
      NOTA: Ajuste el caudal a aproximadamente 2 ml/min con un pellizco Hoffmann a lo largo de la IMAC posterior.
   6. Elule el GTF-SI recombinante con 20 mL del tampón de elución (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. El eluido debe almacenarse a 4oC. La resina IMAC se puede reutilizar. Consulte las instrucciones para la resina IMAC.
7. Sustituya el búfer de elución por el búfer de almacenamiento (buffer de fosfato de 50 mM, pH 6.5) y concentre la solución GTF-SI recombinante a aproximadamente 1 ml utilizando una unidad de ultrafiltración centrífuga. Almacene la solución recombinante de GTF-SI a 4 oC.
   NOTA: Confirme la purificación GTF-SI etiquetada con polihistidina utilizando SDS-PAGE¹³ y la hincha occidental¹⁴ empleando un anticuerpo monoclonal antipolihistidina conperoxidasa de rábano picante. Adición de CHAPS (concentración final, 0,1%) al eluyente puede ser necesario para evitar la adsorción inespecífica a la unidad, dependiendo de la proteína objetivo.

7. Restauración funcional por GTF-SI recombinante

1. Raya cada cepa de S. mutansobre una placa de agar BHI individualmente. Incubar las placas durante la noche a 37oC.
2. Usando un palillo de dientes esterilizado, recoger una sola colonia para inocular en 2 ml de caldo BHI. Incubar durante la noche a 37oC.
3. Utilice 20 ml del cultivo nocturno de S. mutans ágtfC para inocular 2 ml de caldo BHI que contenga 1% de sacarosa sin antibióticos en un tubo de ensayo de vidrio. Agregue el GTF-SI o un volumen equivalente del vehículo al cultivo de S. mutans ágtfC, y el cultivo de las células con el tubo colocado en una posición inclinada durante la noche.
   NOTA: Esterilice la solución GTF-SI con un filtro de jeringa estéril y determine la concentración de proteínas utilizando un ensayo de proteína de ácido bicincino¹⁵ antes de su uso.
4. Agitar las suspensiones de cultivo con un mezclador de vórtice para 10 s. Decantar las suspensiones. Lave los tubos de ensayo con una cantidad suficiente de agua destilada.
5. Mancha las biopelículas en la pared del tubo con 1 ml de 0,25% Coomassie azul brillante (CBB).
6. Decantar la solución de tinción después de 1 min. Lavar los tubos de ensayo con una cantidad suficiente de agua destilada. Seque al aire los tubos de ensayo.

Resultados

El cuadro 3 muestra el tamaño de cada amplicon del primer PCR(figura 3A)y del segundo PCR(figura 3B). El tamaño de cada amplificador correspondió al tamaño pronosticado, como se describe en el Cuadro 1. La Figura 4A muestra las colonias de S. mutans transformadas con el segundo producto PCR y chapadas en las placas de agar BHI que contienen ...

Discusión

El diseño de imprimadores es el paso más crítico en el protocolo. Las secuencias de las imprimaciones gtfC-reverse y spc^r-forward se determinaron automáticamente en función de las secuencias de la región final de 3o de gtfC y de la región final de 5o de spc^r. Cada imprimación incluye 24 bases complementarias que codifican un vinculador GS y una secuencia de codificación His-tag en sus regiones de 5'. La interrupción de las secuencias reglamentarias nativ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation