연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

요약

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

초록

유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.

서문

유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.

후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균^1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다^1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법^2,PCR 기반 DNA 접합 방법^3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.

그의 태그 발현 긴장을 격리하기 위하여는, 관심 있는 유전자의 전체 게놈 DNA (이 그의 꼬리표 발현 유전자 중단한 긴장에서)는 항생 저항하는 마커 유전자로 대체됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 중단 균주를 생성하는 것과 거의 동일한 그의 태그 발현 균주를 생성하는 절차^4,5. 따라서, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 위한 방법은 기능분석을 위한 직렬 실험으로서 수행되어야 한다.

본 작에서, 폴리히스티딘 코딩 서열은 gtfC(GenBank 궤적 태그 SMU_1005) 유전자의 3′ 말단에 부착되고, 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 S. 뮤탄스^6에인코딩한다. 이어서, 연쇄상 구균 종에서 발현 연구가 수행되었다. 대장균에 의한 이종 gtfC 발현을 달성하는 것은 어렵고, 이는 GTF-SI의 높은 분자량 때문에 가능성이 높다. 이 균주는 S. mutans 그의- gtfC라는 이름입니다. 야생형 S. 뮤탄스(S. 뮤탄스 WT)의 gtfC 및 스펙티노마이신 내성 유전자 카세트(spc^r)7로 의 조직을 묘사한 개략적 그림과 그 유도체가 그림 1. GTF-SI는 카리오제닉 치과 용 생물막^6의개발에 기여하는 분비 단백질입니다. 자당의 존재 하에, 부착 생물막은 WT S. 뮤탄스 균주에서 매끄러운 유리 표면에서 관찰되지만 S. 뮤탄스 gtfC-중단 균주(S. mutans ΔgtfC)^2,5 . 생물막 형성은 재조합GTF-SI의 외인성 첨가 시 S. 뮤탄스 Δ gtfC에서 회복된다. 변형, S. 뮤탄스 그의-gtfC,다음 재조합 GTF-SI를 생산하는 데사용됩니다.

프로토콜

참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spc^r로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. ^5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.

1. 프라이머 디자인

1. S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에나와 있습니다. S. 뮤탄스-gtfC의 생성을 위한 2단계 융합 PCR 방법은 도 2에도시된 것이다.
   1. 설계 프라이머(gtfC-reverse및 spc^r-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spc^r 사이 개입(그림 2A).
      1. GS 링커와 그의 태그 코딩 시퀀스를 gtfC-reverse및 spc^r-forward프라이머에 포함하며, 5' 영역에서 24개의 베이스가 서로 보완됩니다.
         참고 : GS 링커와 그의 태그의 아미노산 서열 (글리 글리 글리 - 글리 - 세르 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의) 유전자 번역을 통해 GTF-SI의 C 종점에 부착되어 있습니다.
      2. S. 뮤탄스 WT 게놈 >1 kb 다운스트림의 유전자와 spc^r-reverse프라이머에서 gtfC-forward 프라이머를 타겟팅하여 spc r의 하류 측면 영역을 타겟팅하는 gtfC-forward프라이머를 설계합니다. S. 뮤탄스 □gtfC에서. gtfC의용융 온도⁸ (T_m)를설정 -앞으로 및 spc^r-역 프라이머는 gtfC의용융 온도와 일치 -reverse 및 spc^r- 포워드 프라이머를 각각.
   2. 두 번째 PCR(그림2B)에대해 중첩된 프라이머(중첩 포워드 및 중첩 역방향)를 디자인합니다.
   3. 변형제의 게놈 DNA에 특이적인 설계프라이머(gtfC-forward및 콜로니 리버스)(도2C;프라이머는 콜로니 PCR에 사용된다).
      참고: 앰플리콘은 gtfC와 spc^r사이의 경계를 가로질러. gtfC-포워드프라이머는 전진 프라이머로서 적용될 수 있다.
   4. 설계 프라이머(위-전진 및 하향-반전)는 S. 뮤탄스-gtfC의 생성에 대한 최종 확인을 위한 것이다(도2C;프라이머에 의해 증폭된 PCR 생성물은 DNA 염기서열 분석에 사용된다).

2. S. 뮤탄에서 유전체 DNA 추출

참고: 각 S. 뮤탄스 균주는 혐기성 조건 하에서 37°C에서 뇌 심장 주입(BHI) 배지에서 배양되어야 합니다. S. 뮤탄스 □gtfC 및 S. 뮤탄스 그의-gtfC의 돌연변이 균주는 100 μg/mL 스펙티노마이신으로 보충된 BHI에서 배양된다.

1. 줄무늬 S. 뮤탄s WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC를 각각의 BHI 한천 플레이트에 별도로 상한다. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
2. 살균 된 이쑤시개를사용하여 S. 뮤탄s WT 또는 S. 뮤탄의 단일 콜로니를 선택하고 BHI 국물의 1.5 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
   참고: 상기 콜로니는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA의 공급원으로 사용될 수 있다(단계 3.1).
3. 각 세균 배양액의 1 mL을 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮김. 15,000 x g에서1 분 동안 배양하는 원심 분리기.
4. 상급체를 제거하고 트리스-EDTA 버퍼(pH 8.0)의 1 mL을 추가하여 세포 펠릿을 다시 중단시된다.
5. 15,000 x g에서1 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 상급체를 제거합니다. 트리스-EDTA 완충액(pH 8.0)의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
6. 95°C에서 5분 동안 블록 인큐베이터를 사용하여 현탁액을 가열합니다. 15,000 x g에서5 분 동안 현탁액을 원심 분리기.
7. 상급체를 새로운 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브로 옮김(상급체는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA로서 작용할 것이다).

3. PCR 증폭

참고: 표 1, 표 2및 표 3은 각각 PCR 프라이머, 시약 및 증폭 주기를 요약한다.

1. PcR 템플릿으로서 S. 뮤탄의WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC 게놈을 사용하여 제1 PCR을 수행한다. 1.1.1.2단계(도2A)에기재된 프라이머를 이용하여 gtfC 유전자및 그 항구 spc^r의 하류 부분을 항재하는 영역을 증폭한다.
2. 전기 조는 각 PCR 제품에 1% 아가로즈 젤. 약 1,000 bp 및 2,000 bp의 원하는 DNA 단편을 절제합니다. 실리카 막 기반 겔 추출 방법을 사용하여 겔에서 단편을 정화합니다.
   참고: PCR^9,DNA 겔 전기동10,DNA^{정제(11)에} 대한 기본 절차는 다른 곳에서 상세히 설명되어 있다.
3. 중첩된 전진 및 중첩 역방향 프라이머(그림2B)를사용하여 첫 번째 PCR(약 등가)의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다.
4. 아가로즈 겔 상에 PCR 혼합물의 1/10을 전기포르제. 약 3,000 bp의 적절한 앰플리온의 생성을 확인합니다.
5. 나머지 PCR 제품을 침전시.
   참고 : 두 번째 PCR에 의해 생성 된 비 특이적 앰플리콘도 상동 재조합을 방해하지 않기 때문에 PCR 제품의 정제가 필요하지 않습니다.
   1. PCR 혼합물에 뉴클레아제 없는 물을 넣고 총 부피를 100 μL로 가져온 다음 3M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 및 절대 에탄올 2.5 부피 (250 μL)의 0.1 부피 (10 μL)를 가져옵니다. 혼합물을 실온(RT)에서 10분 동안 혼합하고 보관합니다.
   2. 4 °C에서 15,000 x g에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. DNA 펠릿을 세척하기 위해 70 % 에탄올 1 mL을 추가하십시오.
   3. 4 °C에서 15,000 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. 10 μL의 뉴클레아제 없는 물로 DNA 펠릿을 공기 건조하고 용해시다.

4. 세포 변환

1. ^[5]앞서 간행물에 기재된 단계에 따라 제2 PCR 제품을 소개할 수 있는 유능한 S. mutans WT를 준비한다. 세포를 -80°C에 보관하십시오.
   참고: 본 실험을 위해, 유능한 S. 뮤탄sWT 세포는 이미 -80°C에서 보존되어 S. 뮤탄스 □gtfC를생성한다.
2. 농축된 제2 PCR 생성물의 5 μL을 이전에 동결된 얼음 차가운 유능한 세포의 50 μL aliquot에 혼합한다. 혼합물을 전기 개화 큐벳에 추가합니다. 전기 천공 장치를 사용하여 셀에 단일 전기 펄스(1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF)를 부여합니다.
3. BHI 국물의 500 μL에서 세포를 다시 중단하십시오. 즉시, 스펙티노마이신을 함유한 BHI 한천 플레이트에 현탁액의 10-100 μL을 퍼뜨리세요. 식민지가 충분히 자라날 때까지 37 °C에서 2-6 일 동안 접시를 배양하십시오.

5. Genome 재조합 및 보관 확인

1. 재조합을 위해 gtfC-forward 및 콜로니 리버스 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행합니다. 전기조 각 콜로니 PCR 제품을 아가로즈 겔 상에. 약 1,500 bp의 DNA 단편을 확인합니다.
2. 멸균 된 이쑤시개를 사용하여 양성 콜로니 중 하나를 선택하고 스펙티노마이신을 함유한 BHI 국물 2 mL에서 밤새 세포를 배양합니다.
3. 0.8 mL의 세균 배양을 멸균 50% 글리세롤 0.8 mL와 혼합하고 -80 °C 또는 -20 °C에서 스톡합니다.
4. 나머지 1 mL의 세포 현탁액을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 2.3-2.7 단계를 반복하여 세포로부터 게놈 DNA를 추출합니다.
5. 상향 및 하향-역방향 프라이머 및 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행합니다. 3.2 단계를 반복하여 겔로부터 증폭된 DNA 생성물을 정제한다.
6. DNA 염기서열 분석으로 정제된 앰플리코의 DNA 서열을 결정합니다.
   참고: DNA 염기서열분석으로 S. 뮤탄스 의 생성을 확인하십시오.

6. 폴리히스티딘 태그 GTF-SI의 정화

1. Streak S. mutans His-gtfC를 스펙티노마이신 함유 BHI 한천 플레이트에. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
2. BHI 국물의 3 mL에서 멸균 된 이쑤시개 및 하위 배양 세포를 사용하여 단일 콜로니를 선택합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
3. 스펙토마이신 없이 BHI 국물 1L로 원추형 플라스크 2개를 준비합니다. BHI 국물의 1 L에 하룻밤 배양 현탁액의 1 mL을 접종. 37 °C에서 하룻밤 배양.
4. 황산 암모늄 침전으로 배양 상급단백질을 농축한다.
   참고: 표적 단백질이 세포내인 경우 세포체에서 추출합니다. 황산 암모늄 강수량에 대한 기본 절차는^{다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다 12.}
   1. 4°C에서 10,000 x g에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리기. 배양부체를 3L 유리 비커로 회수한다.
   2. 마그네틱 교반기를 사용하여 격렬한 교반으로 황산 암모늄 1,122 g을 상급 (80 % 포화)의 2 L에 추가하십시오. 침전물 4°C에서 4시간 이상 교반하여 형성되도록 한다.
      참고 : 침전물 형성은 하룻밤 동안 계속 될 수 있습니다.
   3. 4 °C에서 20 분 동안 15,000 x g에서 황산 암모늄 침전 액을 원심 분리기. 상급자.
   4. 주걱으로 침전을 수집하고 200 mL 유리 비커로 전송합니다. 결합 완충액의 35 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단 (50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0).
   5. 회생된 셀룰로오스 투석 튜브를 사용하여 결합 완충액의 2,500 mL에 대하여 현탁액을 투석, 4°C에서 교반하였다. 2 시간 후에 투석 용액을 교체하고 밤새 투석을 계속하십시오.
   6. 투석 용액을 다시 교체하십시오. 추가 2 시간 투석을 계속하십시오.
5. 투석액을 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 흡입 여과 장비를 사용하여 멤브레인 필터를 통해 상류물을 필터링합니다. 여과액을 75cm² 플라스크로 옮김.
6. 폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI를 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 여과 된 현탁액으로부터 분별하십시오.
   1. Ni 충전 IMAC 수지 슬러리 2 mL(약 1 mL의 수지)를 실리콘 튜브에 장착된 크로마토그래피 컬럼으로 옮니다. 중력 흐름에 의해 저장 솔루션을 제거합니다.
      주의 사항: 수지가 IMAC 전체에서 마르지 않도록 하십시오.
   2. 3 mL의 증류수를 컬럼에 추가하여 수지세척합니다. 수지의 평형을 위해 바인딩 버퍼의 5 mL를 추가합니다.
   3. 호프만 핀치 수탉으로 흐름을 차단합니다. 슬러리를 만들기 위해 6.5 단계에서 여과 된 현탁액 5 mL을 추가하십시오.
   4. 모든 슬러리를 나머지 여과된 현탁액에 추가합니다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 부드럽게 돌이십시오.
   5. 혼합물을 열에 다시 로드합니다. 중력 흐름에 의해 현탁액을 제거합니다. IMAC 수지의 결합 버퍼 20 mL로 세척하십시오.
      참고: 후속 IMAC 전체에서 호프만 핀치 콕으로 유량을 약 2mL/min으로 조정합니다.
   6. 용출 완충제의 20 mL로 재조합 GTF-SI를 용출 완충한다(50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0).
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 용리수체는 4°C에서 보관해야 한다. IMAC 수지재사용이 가능합니다. IMAC 수지의 지침을 참조하십시오.
7. 용출 완충액을 저장 버퍼(50 mM 인산 완충제, pH 6.5)로 교체하고 원심 초여과 유닛을 사용하여 재조합 GTF-SI 용액을 약 1 mL에 농축한다. 재조합 GTF-SI 용액을 4°C에 저장합니다.
   참고: 폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI 정제를 SDS-PAGE¹³ 및 서부^{블로팅(14)을} 사용하여 고추냉이 과옥시다제-공액항 폴리히스티딘 모노클로날 항체를 채용하여 확인한다. CHAPS 추가 (최종 농도, 0.1%) 용리제는 표적 단백질에 따라 단위에 대한 비특이적 흡착을 피하기 위해 요구될 수 있다.

7. 재조합 GTF-SI에 의한 기능 복원

1. 각 S. 뮤탄의변형을 BHI 한천 플레이트에 개별적으로 연속한다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 살균 된 이쑤시개를 사용하여 단일 식민지를 집어 BHI 국물 2 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 하룻밤 배양.
3. 유리 시험관에서 항생제 없이 1% 자당을 함유하는 BHI 국물 2 mL을접종하기 위해 S. 뮤탄의 하룻밤 배양물 20 μL을 사용한다. GTF-SI 또는 이에 상응하는 부피를 S. 뮤탄스 □gtfC 배양에 추가하고, 하룻밤 동안 기울어진 위치에 놓인 튜브로 세포를 배양한다.
   참고: 멸균 주사기 필터로 GTF-SI 용액을 살균하고 사용 전에 비신코닌산 단백질 분석법^15를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
4. 10s. 서스펜션을 10s. Decant에 대한 와류 믹서로 배양 현탁액을 교반한다. 충분한 양의 증류수로 시험관을 씻으십시오.
5. 0.25 % 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB)의 1 mL로 튜브 벽에 생물 막을 얼룩.
6. 염색 용액을 1분 후에 데낸트. 충분한 양의 증류수로 시험관을 세척한다. 시험관을 공기 건조시.

결과

도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도?...

토론

프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spc^r-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spc^r의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation