Purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans

Résumé

Décrit ici est une méthode simple pour la purification d'un produit génique dans Streptococcus mutans. Cette technique peut être avantageuse dans la purification des protéines, en particulier les protéines membranaires et les protéines de masse moléculaire élevée, et peut être utilisée avec diverses autres espèces bactériennes.

Résumé

L'élucidation de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches et souches de type sauvage dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. La perte de fonction à la suite d'une perturbation génétique est ensuite rétablie par l'ajout exogène du produit du gène perturbé. Cela aide à déterminer la fonction du gène. Une méthode précédemment décrite consiste à générer une souche de Streptococcus mutans perturbée par le gène gtfC. Ici, une méthode peu exigeante est décrite pour purifier le produit de gène de gtfC de la souche nouvellement produite de S. mutans suivant la perturbation de gène. Il s'agit de l'ajout d'une séquence de codage de polyhistidine à l'extrémité 3 du gène d'intérêt, ce qui permet une simple purification du produit génique à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée. Aucune réaction enzymatique autre que PCR n'est requise pour la modification génétique de cette méthode. La restauration du produit génique par ajout exogène après la rupture des gènes est une méthode efficace pour déterminer la fonction génique, qui peut également être adaptée à différentes espèces.

Introduction

L'analyse de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches de type sauvage aux souches dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. Une fois que la souche perturbée par le gène est produite, l'ajout exogène du produit génique permet une restauration fonctionnelle.

La méthode la plus courante pour obtenir les produits géniques purifiés requis pour les essais de restauration ultérieures est en effectuant l'expression hétérologue dans Escherichia coli¹. Cependant, l'expression des protéines membranaires ou des protéines de masse moléculaire élevée est souvent difficile à l'aide de ce système¹. Dans ces cas, la protéine cible est habituellement isolée des cellules qui synthétisent la protéine par une série complexe d'étapes, qui peuvent mener à la perte du produit génique. Pour surmonter ces problèmes, une procédure simple a été développée pour la purification des produits géniques à la suite d'une méthode de perturbation génétique², pcR à base de méthode d'épissage de l'ADN³ (désigné en deux étapes de fusion PCR), et l'électroporation pour la génétique transformation dans Streptococcus mutans. L'ajout d'une étiquette de polyhistidine (His-tag) au c-terminus du produit génique facilite sa purification par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).

Pour isoler la souche His-tag-expressing, l'ADN génomique entier du gène d'intérêt (dans cette souche son-étiquette-exprimant gène-perturbé) est remplacé par un gène de marqueur antibiorésistant. La procédure pour générer la souche His-tag-exprimant est presque identique à celle pour générer une souche gène-perturbée comme décrit précédemment^4,5. Par conséquent, les méthodes de perturbation génétique et d'isolement des produits géniques devraient être effectuées en série d'expériences pour l'analyse fonctionnelle.

Dans le présent travail, une séquence de codage de polyhistidine est attachée à l'extrémité 3 du gène gtfC (GenBank locus tag SMU 1005), codant la glucosyltransferase-SI (GTF-SI) en S. mutans⁶. Ensuite, des études d'expression chez une espèce streptococcique ont été réalisées. Il est difficile d'atteindre l'expression hétérologue de la gtfC par E. coli, probablement en raison de la masse moléculaire élevée de GTF-SI. Cette souche est nommée S. mutans His-gtfC. Une illustration schématique représentant l'organisation de la cassette de gène de résistance à la gtfC et à la spectinomycine (spc^r)⁷ loci dans le type sauvage S. mutans (S. mutans WT) et ses dérivés est montrée dans Figure 1. Le GTF-SI est une protéine sécrétrice qui contribue au développement du biofilm dentaire cariogénique⁶. Sous la présence du saccharose, un biofilm adhérent est observé sur une surface de verre lisse dans la souche WT S. mutans, mais pas dans la souche S. mutans gtfC-perturbée (S. mutans 'gtfC)^2,5 . La formation de biofilms est restaurée dans S. mutans -gtfC après l'ajout exogène du GTF-SI recombinant. La souche, S. mutans His-gtfC, est ensuite utilisé pour produire le GTF-SI recombinant.

Protocole

REMARQUE: Génération de S. mutans gtfC, dans lequel toute la région de codage du gène gtfC est remplacée par spc^r, doit être complétée avant d'effectuer ces protocoles. Consultez l'article publié pour plus de détails sur la génération⁵.

1. Conception d'apprêt

1. Préparer les amorces pour la construction de S. mutans His-gtfC.
   REMARQUE: Les séquences d'amorce utilisées dans ce protocole sont indiquées dans le tableau 1. La méthode PCR de fusion en deux étapes pour la génération de S. mutans His-gtfC est schématiquement illustrée dans la figure 2.
   1. Amorces de conception(gtfC-reverse et spc^r-forward)pour l'attachement de sa séquence de codage de tag, intervenant entre le gène gtfC et spc^r (Figure 2A).
      1. Inclure le lien GS et la séquence de codage His-tag dans les deux amorces gtfC-reverse et spc^r-avant,dans lesquelles 24 bases aux régions de 5' sont complémentaires les unes aux autres.
         REMARQUE : La séquence d'acides aminés du lien GS et de son étiquette (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His) est attachée au terminus C de GTF-SI par la traduction de gènes.
      2. Concevoir une amorce gtfC-avantpour cibler le gène gtfC dans le génome de S. mutans WT en aval du gène et l'amorce spc^r-reversepour cibler la région de flanc en aval de spc^r dans le S. mutans -gtfC. Définir la température de fonte⁸ (T_m) du gtfC-avant et spc^r-inverse amorces pour correspondre avec les températures de fonte de la gtfC-inverse et spc^r- amorces avant, respectivement.
   2. Concevoir des amorces non-parisées (nichées vers l'avant et inversées) pour le deuxième PCR (Figure 2B).
   3. Amorces de conception(gtfC-avant et colonie-revers) spécifiques pour l'ADN génomique du transformateur (figure 2C; les amorces sont utilisées pour la colonie PCR).
      REMARQUE: Les amplicons chevauchent la frontière entre gtfC et spc^r. L'amorce avant gtfCpeut être appliquée comme amorce avant.
   4. Amorces de conception (vers l'avant et vers le bas) pour la confirmation finale de la génération de S. mutans His-gtfC (Figure 2C; le produit PCR amplifié par les amorces est utilisé pour le séquençage de l'ADN).

2. Extraction d'ADN génomique de S. mutans

REMARQUE: Chaque souche de S. mutans doit être cultivée dans le milieu d'infusion cardiaque du cerveau (BHI) à 37 oC dans des conditions anaérobies. Les souches mutantes de S. mutans et S. mutans His-gtfC sont cultivées en BHI complétées par une spectinomycine de 100 g/mL.

1. Streak S. mutans WT et S. mutans -gtfC séparément sur chacune des plaques d'agar BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
2. Choisissez des colonies simples de S. mutans WT ou S. mutans -gtfC à l'aide d'un cure-dent stérilisé et inoculez-vous dans 1,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
   REMARQUE: Les colonies peuvent être utilisées comme source d'ADN modèle pour le premier PCR (étape 3.1).
3. Transférer 1 ml de chaque culture bactérienne dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugelant la culture pendant 1 min à 15 000 x g.
4. Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml du tampon Tris-EDTA (pH 8,0) pour suspendre à nouveau le granule cellulaire.
5. Centrifugeuse suspension pendant 1 min à 15 000 x g. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 oL de tampon Tris-EDTA (pH 8,0).
6. Chauffer la suspension à l'aide d'un incubateur de blocs pendant 5 min à 95 oC. Centrifugeuse suspension pendant 5 min à 15 000 x g.
7. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml (le supernatant servira d'ADN modèle pour le premier PCR).

3. Amplification DE PCR

REMARQUE: Le tableau 1, le tableau 2et le tableau 3 résument respectivement les amorces, les réactifs et les cycles d'amplification du PCR.

1. Effectuez le premier PCR en utilisant le génome S. mutans WT et S. mutans gtfC comme modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles qui hébergent spc^r à l'aide des amorces décrites à l'étape 1.1.1.2 (Figure 2A).
2. Électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Accises les fragments d'ADN souhaités d'environ 1 000 pb et 2 000 pb. Purifiez les fragments des gels à l'aide de la méthode d'extraction de gel à base de membrane de silice.
   REMARQUE: Les procédures de base pour PCR⁹, l'électrophorèse de gel d'ADN^10,et la purification^{d'ADN 11} sont détaillées ailleurs.
3. Effectuez un deuxième PCR à l'aide des produits du premier PCR (environ équimolar) comme modèles PCR avec les amorces non remue-avant et nichées -inversées (figure 2B).
4. Électrophorese un dixième du mélange PCR sur le gel d'agarose. Confirmer la génération de l'amplicon approprié d'environ 3 000 pb.
5. Précipitez le produit PCR restant.
   REMARQUE : La purification du produit PCR n'est pas nécessaire, car les amplicons non spécifiques générés par le deuxième PCR n'interfèrent pas avec la recombinaison homologue.
   1. Ajouter de l'eau sans nauséabonde au mélange DE PCR et porter le volume total à 100 l, suivi de 0,1 volume (10 l) d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et de 2,5 volumes (250 l) d'éthanol absolu. Mélanger et conserver le mélange pendant 10 min à température ambiante (RT).
   2. Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Ajouter 1 ml d'éthanol à 70 % pour laver le granule d'ADN.
   3. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Séchez et dissez la pastille d'ADN avec 10 l l d'eau exempte de nucléane.

4. Transformation cellulaire

1. Préparer compétent S. mutans WT pour introduire le deuxième produit PCR en suivant les étapes décrites dans la publication précédente⁵. Conserver les cellules à -80 oC.
   REMARQUE: Pour cette expérience, les cellules WT compétentes de S. mutanont déjà été conservées en -80 oC pour générer S. mutans etgtfC.
2. Mélanger 5 'L du deuxième produit PCR concentré à l'aliquot de 50 L de cellules compétentes glacées congelées précédemment. Ajouter le mélange dans des cuvettes d'électroporation. Donner une seule impulsion électrique (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 F) aux cellules à l'aide de l'appareil d'électroporation.
3. Resuspendre les cellules dans 500 'L de bouillon BHI. Immédiatement, étalez 10 à 100 l de la suspension sur des plaques d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les assiettes pendant 2 à 6 jours à 37 oC jusqu'à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées.

5. Vérification de larecombinaison et du stockage de Genome

1. Effectuer la PCR de la colonie, à l'aide d'amorces gtfC-avant et de colonie-inversées pour dépister la recombinaison. Électrophorese chaque produit PCR de colonie sur un gel d'agarose. Confirmer le fragment d'ADN d'environ 1 500 pb.
2. Choisissez l'une des colonies positives à l'aide d'un cure-dent stérilisé et la sous-culture des cellules pendant la nuit dans 2 ml de bouillon BHI contenant de la spectinomycine.
3. Mélanger 0,8 ml de culture bactérienne avec 0,8 ml de glycérol stérile à 50 % et stocker à -80 oC ou -20 oC.
4. Transférer les 1 ml restants de suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Répétez les étapes 2.3-2.7 pour extraire l'ADN génomique des cellules.
5. Effectuez PCR en utilisant les amorces vers l'avant et vers le bas et l'ADN génomique comme modèle. Répétez l'étape 3.2 pour purifier le produit d'ADN amplifié des gels.
6. Déterminer la séquence d'ADN de l'amplicon purifié par séquençage de l'ADN.
   REMARQUE: Assurez-vous de confirmer la génération de S. mutans Son-gtfC par séquençage de l'ADN.

6. Purification du GTF-SI étiqueté polyhistidine

1. Streak S. mute sa gtfC sur une plaque d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
2. Ramassez une seule colonie à l'aide d'un cure-dent stérilisé et de cellules de sous-culture dans 3 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
3. Préparer deux flacons coniques avec 1 L de bouillon BHI sans spectinomycine. Inoculer 1 ml de la suspension de culture de nuit dans 1 L du bouillon BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
4. Concentrer les protéines du supernatant de culture par la précipitation de sulfate d'ammonium.
   REMARQUE : Extraire des corps cellulaires si une protéine cible est intracellulaire. Les procédures de base pour les précipitations de sulfate d'ammonium sont détaillées ailleurs¹².
   1. Centrifugelant la suspension de culture bactérienne pendant 20 min à 10 000 x g à 4 oC. Récupérer le supernatant de culture dans un bécher en verre de 3 L.
   2. Ajouter 1 122 g de sulfate d'ammonium à 2 L du supernatant (80% de saturation) avec un remuant vigoureux à l'aide d'un agitateur magnétique. Laisser le précipité se former pendant 4 h ou plus à 4 oC en remuant.
      REMARQUE : La formation précipitée peut se poursuivre pendant la nuit.
   3. Centrifugeuse solution précipitée par le sulfate d'ammonium à 15 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Decant le supernatant.
   4. Recueillir le précipité à l'une spatule et le transférer dans un bécher en verre de 200 ml. Resuspendre les granulés en 35 ml de tampon de liaison (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).
   5. Dialyser la suspension contre 2 500 ml du tampon de liaison à l'aide d'un tube de dialyse de cellulose régénéré, à 4 oC, en remuant. Remplacer la solution de dialyse après 2 h et poursuivre la dialyse toute la nuit.
   6. Remplacez à nouveau la solution de dialyse. Continuer à dialyser pendant 2 h supplémentaires.
5. Centrifuger la suspension dialysée à 20 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre à membrane à l'aide d'un équipement de filtration par aspiration. Transférer le filtrate dans un flacon de 75 cm^2.
6. Fractionner le GTF-SI étiqueté polyhistidine de la suspension filtérée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
   1. Transférer 2 ml de boue de résine IMAC chargée par Ni (environ 1 ml de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est montée sur un tube de silicone. Retirez la solution de stockage par le flux de gravité.
      MISE EN GARDE: Ne laissez pas la résine sécher dans l'ensemble de l'IMAC.
   2. Ajouter 3 ml d'eau distillée dans la colonne pour laver la résine. Ajouter 5 ml du tampon de liaison pour réquiliber la résine.
   3. Arrêtez le flux avec une bite Hoffmann pincement. Ajouter 5 ml de la suspension filtrée de l'étape 6.5 pour faire la boue.
   4. Ajouter toute la boue à la suspension filtrée restante. Faire tourbillonner doucement le mélange pendant 30 min à 4 oC.
   5. Chargez le mélange sur la colonne. Retirez la suspension par le flux de gravité. Laver la résine IMAC avec 20 ml de tampon de liaison.
      REMARQUE: Ajustez le débit à environ 2 ml/min avec un coq Hoffmann pincement tout au long de l'IMAC suivant.
   6. Elute le GTF-SI recombinant avec 20 mL de tampon d'élution (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8,0).
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. L'éluate doit être stockée à 4 oC. La résine IMAC peut être réutilisée. Consultez les instructions pour la résine IMAC.
7. Remplacez le tampon d'élution par le tampon de stockage (tampon de phosphate de 50 mM, pH 6,5) et concentrez la solution RecombinantGTF-SI à environ 1 ml à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge. Entreposez la solution GTF-SI recombinante à 4 oC.
   REMARQUE: Confirmer la purification GTF-SI étiquetée polyhistidine à l'aide de SDS-PAGE¹³ et de l'ouest de l'ouest en utilisant un anticorps monoclonal anti-polyhistidine conjugué au raifort. Ajout de CHAPS (concentration finale, 0,1 %) à l'éluence peut être nécessaire pour éviter l'adsorption non spécifique à l'unité, selon la protéine cible.

7. Restauration fonctionnelle par Recombinant GTF-SI

1. Stries chaque souche S. mutansur une plaque d'agar BHI individuellement. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 oC.
2. À l'aide d'un cure-dent stérilisé, prendre une seule colonie pour inoculer 2 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
3. Utilisez 20 l de la culture de la nuit de S. mutans etgtfC pour inoculer 2 ml de bouillon DE BHI contenant 1 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube à essai en verre. Ajoutez le GTF-SI ou un volume équivalent du véhicule à la culture S. mutans etgtfC, et cultureles les cellules avec le tube placé en position inclinée pendant la nuit.
   REMARQUE: Stérilisez la solution GTF-SI à l'aide d'un filtre à seringues stériles et déterminez la concentration en protéines à l'aide d'un test de protéines d'acide bicinchoninique¹⁵ avant utilisation.
4. Agiter les suspensions de culture avec un mélangeur de vortex pour 10 s. Décant les suspensions. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée.
5. Tainer les biofilms sur la paroi du tube avec 1 ml de 0,25% Coomassie bleu brillant (CBB).
6. Décant la solution de coloration après 1 min. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée. Séchez à l'air les tubes à essai.

Résultats

La figure 3 montre la taille de chaque amplicon du premier PCR (Figure 3A) et du deuxième PCR (Figure 3B). La taille de chaque amplicon correspondait à la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 4A montre des colonies de S. mutans transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d'agar BHI contenant...

Discussion

La conception des amorces est l'étape la plus critique du protocole. Les séquences des amorces gtfC-reverse et spc^r-avantont été automatiquement déterminées en fonction des séquences de la région d'extrémité de 3 degrés de gtfC et de la région de fin de 5 degrés de spc^r. Chaque amorce comprend 24 bases complémentaires qui codent un lien GS et une séquence de codage His-tag dans leurs régions de 5'. La perturbation des séquences réglementaires ind...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation