טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

Summary

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

Abstract

ההסבר של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים סוג פראי וזנים שבו הגן של העניין שובשו. אובדן של פונקציה בעקבות הפרעה גנטית שוחזר לאחר מכן על ידי תוספת אקסודוגני של המוצר של הגן שיבש. זה עוזר לקבוע את התפקיד של הגן. שיטה שתוארה בעבר כרוכה ביצירת מתח Gtfc שיבש סטרפטוקוקוס השיזוף . כאן, שיטה בלתי תובענית מתוארת לטיהור המוצר הגנטי Gtfc מן המתח החדש שנוצר בעקבות הפרעה גנטית. זה כרוך תוספת של רצף polyhistidine-קידוד בסוף 3 ′ של הגן של עניין, אשר מאפשר טיהור פשוט של המוצר הגן באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. אין תגובות אנזימטיות מלבד ה-PCR נדרשים לשינוי גנטי בשיטה זו. השחזור של מוצר הגן על ידי התוספת אקסוסוגני לאחר הפרעה גנטית היא שיטה יעילה לקביעת פונקציה גנטית, אשר עשוי גם להיות מותאם למינים שונים.

Introduction

ניתוח של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים מסוג פראי לזנים בהם הגן של העניין שובשו. ברגע שהוא מופק זן גנטי, תוספת אקסוגני של המוצר הגן מאפשר שיקום פונקציונלי.

השיטה הנפוצה ביותר להשגת מוצרי גנים מטוהרים הנדרשים עבור שחזור שלאחר השחזור הוא על ידי ביצוע ביטוי הטרוולוגי בשנת הכלאיים קולי¹. עם זאת, הביטוי של חלבונים הממברנה או חלבונים מסה גבוהה המולקולרי הוא לעתים קרובות קשה באמצעות מערכת זו¹. במקרים אלה, חלבון היעד מבודד בדרך כלל מן התאים המהווה באופן מקורי את החלבון באמצעות סדרה מורכבת של צעדים, אשר עשוי להוביל לאובדן מוצר הגן. כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פשוט פותחה עבור טיהור מוצר גנטי בעקבות הפרעה גנטית שיטה², pcr מבוססי DNA שילוב שיטה³ (המיועד היתוך שני שלבים PCR), ו אלקטרופורציה גנטית טרנספורמציה בתוך סטרפטוקוקוס. תוספת של תג polyhistidine (שלו-tag) כדי C-הטרמינוס של המוצר הגן מקלה על טיהור שלה על ידי קיבוע מתכת כרומטוגרפיה של זיקה (IMAC).

כדי לבודד את הטאג ' שלו-הבעת מאמץ, את ה-DNA כל גנומית של הגן של עניין (בתוך זה שלו-tag-הבעת זן גן שיבשו) מוחלף גנים סמן אנטיביוטי עמידים. ההליך ליצירת התגים שלו-ביטוי שהוניס כמעט זהה לזה ליצירת זן גנים שיבשו כפי שמתואר קודם לכן^4,5. לכן, השיטות עבור שיבוש גנים ובידוד המוצר הגנטי יש לבצע כניסויים סדרתיים עבור ניתוח פונקציונלי.

בעבודה הנוכחית, רצף polyhistidine-קידוד מצורף לקצה של 3 ′ של Gtfc (מקום genbank תג SMU_1005) גן, קידוד glucosyltransferase-SI (gtfc-si) ב S. מוסטנים⁶. לאחר מכן, בוצעו לימודי ביטויים במינים מסוג streptococcal. השגת ביטוי הטרוולוגי ב- E. coli קשה, כנראה בגלל המסה המולקולרית הגבוהה של gtfc-SI. הנבגהזה נקרא . אס. תרשים סכמטי המתאר את הארגון של ה- gtfc וspectinomycin ההתנגדות הגנטית( spc^r)⁷ הבית בסוג פראי . מוסטנים והנגזרים שלו מוצג ב איור 1. GTF-SI הוא חלבון הסוד שתורם להתפתחות של ביוגניים שיניים מקרגני⁶. תחת נוכחותו של סוכרוז, הארגון משקיף על משטח זכוכית חלק במתח של WT, אבל לא ב-s. המתח המובש(Δ gtfc)^2,5 . היווצרות ביוגניים משוחזר ב -S. mutans gtfc בתוספת אקסוגני של רקומביננטי gtfc-SI. המתח, S. mutans שלו-gtfc, משמש לאחר מכן כדי לייצר את gtfc-SI.

Protocol

הערה: דור של S. mutans gtfc, שבו כל אזור הקידוד של הג gtfc מוחלף עם spc^r, יש להשלים לפני ביצוע פרוטוקולים אלה. עיין במאמר המתפרסם לקבלת פרטים על דור⁵.

1. פריימר עיצוב

1. הכן את התחל לבניית S. מוסטנים שלו-gtfc.
   הערה: הרצפים הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 1. שיטת ה-PCR של שני השלבים עבור הדור של S. מוזטאן שלו-gtfc מומחש באיור 2.
   1. עיצוב התחל (gtfc-הפוכה ו- spc^r-קדימה) עבור הקובץ המצורף שלו-תג-קידוד רצף, מהתערב בין הגנים gtfc ו- spc^r (איור 2a).
      1. כלול מקשר GS ו-תג שלו-coding רצף לתוך שניהם Gtfc-הפוכה ו spc^r-קדימה התחל, שבו 24 בסיסים באזורים 5 ' משלימים אחד את השני.
         הערה: רצף חומצת האמינו של GS המקשר והתג שלו (בסדר-בסדר-מאוד-מאוד-שלו-שלו-שלו-שלו) מחובר ל-C הטרמינוס של GTF-SI באמצעות תרגום גנטי.
      2. עיצוב gtfc-קדימה לכוון את הגן Gtfc ב -S. מוסטטאן הגנום > 1 kb במורד הגן ו- spc^r-הפוך פריימר למקד את אזור במורד הזרם של spc^r ב -S. מוסטנים ∆gtfc. הגדר את טמפרטורת ההיתוך⁸ (T_m) של gtfc-קדימה ו- spc^r-הפוך התחל להתאים עם טמפרטורות ההיתוך של gtfc-הפוכה ו- spc^r- התחל קדימה, בהתאמה.
   2. עצב צבעי יסוד מקוננים (מקוננים קדימה והפוך מקונן) עבור ה-PCR השני (איור 2B).
   3. עיצוב התחל (Gtfc-קדימה והמושבה-הפוך) מיוחד עבור ה-DNA הגנומי של הטרנספורנט (איור 2c; התחל משמש למושבה ה-PCR).
      הערה: הגברה על הגבול בין Gtfc ו- spc^r. ניתן להחיל את התחל הקדמי של Gtfcבתור התחל הקדמי.
   4. עיצוב התחל (למעלה-קדימה ולמטה לאחור) לקבלת אישור סופי של הדור של ס. מוסיקה שלו-gtfc (איור 2c; מוצר ה-PCR המוגדל על ידי התחל משמש לרצפי DNA).

2. הפקת דנ א גנומית מ -S. מוסטנים

הערה: מאמץ של כל S. מוסטנים צריך להיות מתורבת בינוני בלב המוח (bhi) בינונית ב 37 ° c בתנאים אנאירובית. זנים מוטציה של s. מוסטנים ∆Gtfc ו ס מוסטנים שלו-gtfc הם מתורבתים ב bhi בתוספת עם 100 μg/mL spectinomycin.

1. פס s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc בנפרד על כל הצלחות bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
2. בחר מושבות יחיד של s. mutans WT או s. מוסטנים ∆gtfc באמצעות קיסם שיניים מעוקר לתוך 1.5 mL של ציר bhi. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
   הערה: ניתן להשתמש במושבות כמקור ל-DNA של תבנית עבור ה-PCR הראשון (שלב 3.1).
3. העבר 1 מ ל של כל תרבות בקטריאלי לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה את התרבות עבור 1 דקות ב 15,000 x g.
4. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0) כדי להשעות מחדש את הגלולה התא.
5. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 1 דקות ב 15,000 x g. . הסר את הסופרנטאנט להשעות מחדש את הגלולה תא ב 50 μL של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0).
6. לחמם את ההשעיה באמצעות אינקובטור בלוק עבור 5 דקות ב 95 ° c. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 5 דקות ב 15,000 x g.
7. העבר את הסופרנטאנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL (הסופרנטאנט ישמש כ-DNA תבנית עבור ה-PCR הראשון).

3. הגברה של הPCR

הערה: טבלה 1, טבלה 2 ושולחן 3 מסכמים את מחזורי התחל, הריאגנטים והגברה של ה-PCR, בהתאמה.

1. לבצע את ה-PCR הראשון באמצעות s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc הגנום כמו תבניות ה-PCR. הגבר את האזורים המהווים מחסה לחלק הזרם של גן Gtfc ואלה המהווים מחסה ב- spc באמצעות התחל המתואר בשלב 1.1.1.2 (איור 2a).
2. כל מוצר של ה-PCR ב-1% העלה ג'ל. בלו את שברי ה-DNA הרצויים של כ 1,000 bp ו 2,000 bp. לטהר את השברים מן הג באמצעות ממברנה סיליקה מבוססי ג'ל שיטת החילוץ.
   הערה: ההליכים הבסיסיים של PCR⁹, ה-dna ג'ל אלקטרופורזה¹⁰, ו-DNA טיהור¹¹ מפורטים במקום אחר.
3. לבצע ה-PCR השני באמצעות המוצרים של ה-PCR הראשון (כ equimolar) כמו תבניות PCR עם ההתחלה המקוננת קדימה והמקוננת הפוכה (איור 2B).
4. אלקטרופורסה עשירית מתערובת ה-PCR על ג'ל הצמח. לאשר את הדור של אמפליקון המתאים של כ 3,000 bp.
5. מזרז את מוצר ה-PCR הנותר.
   הערה: הטיהור של מוצר ה-pcr אינו הכרחי, משום שהגברה שאינה ספציפית שנוצרת על ידי ה-pcr השני אינה מפריעה לשילוב מחדש של הומוולוגי.
   1. הוסף nuclease-מים חינם לתערובת ה-PCR ולהביא את הנפח הכולל ל 100 μL, ואחריו 0.1 נפח (10 μL) של 3 מז נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 אמצעי אחסון (250 μL) של אתנול מוחלט. לערבב ולאחסן את התערובת עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. צנטריפוגה את המדגם עבור 20 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט להוסיף 1 mL של 70% אתנול כדי לשטוף את הגלולה DNA.
   3. צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט האוויר יבש ולפזר את הגלולה DNA עם 10 μL של nuclease-מים ללא תשלום.

4. המרת תאים

1. הכנת המוצרים המוסמכים של s. mutans כדי להציג את מוצר ה-PCR השני על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרסום הקודם⁵. אחסן את התאים בשעה-80 ° c.
   הערה: לניסוי זה, התאים המוסמכים s. mutans WT כבר נשמרו ב-80 ° c כדי לייצר S. מוסטנים ∆gtfc.
2. מערבבים 5 μl של המוצר השני מרוכז PCR כדי 50 μl סדרת מחלקים של תאים קר קרח מוסמך קפואים בעבר. הוסיפו את התערובת לתוך כימיקלים אלקטרופורציה. לתת פולס חשמלי יחיד (1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF) לתאים באמצעות מנגנון אלקטרופורציה.
3. השהה מחדש את התאים ב-500 Μi של ציר BHI. מיד, להפיץ 10 – 100 μL של ההשעיה אל BHI אגר צלחות המכילות spectinomycin. מודיית את הצלחות עבור 2 – 6 ימים ב 37 ° צ' עד המושבות גדלו מספיק כדי לקבל.

5. אימות של GEnome שילוב ואחסון

1. בצעו את המושבה ה-PCR באמצעות gtfC-פורוורד והמושבה-היפוך התחל על המסך עבור השילוב החוזר. אלקטרופורז כל מושבה מתוצרת ה-PCR על ג'ל שנוצר. אשר את רסיס ה-DNA של כ 1,500 bp.
2. בחר אחת המושבות החיוביות באמצעות קיסם ומתת תת התאים הלילה ב 2 מ ל של ציר BHI המכיל spectinomycin.
3. מערבבים 0.8 mL של התרבות החיידקית עם 0.8 mL של מערך סטרילי 50% גליצרול ומלאי ב-80 ° c או-20 ° c.
4. העבר את הנותרים 1 mL של השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלבים 2.3 – 2.7 כדי לחלץ את ה-DNA גנומית מן התאים.
5. לבצע ה-PCR באמצעות למעלה-קדימה ולמטה לאחור ולמטה DNA גנומית כתבנית. חזור על שלב 3.2 כדי לטהר את מוצר ה-DNA הוגבר מן הג.
6. לקבוע את רצף ה-dna של אמפליקון מטוהרים על ידי רצפי DNA.
   הערה: הקפד לאשר את הדור של ה-S. השיזוף שלו-gtfc על ידי רצפי DNA.

6. טיהור של פוליהיסטידין-מתויג GTF-SI

1. פס המכיל את ה -gtfc שלו לצלחת מspectinomycin המכילה את הלוח bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
2. להרים מושבה אחת באמצעות שיניים מעוקר ותאי תת-תרבות ב 3 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
3. להכין שני מבחנות חרוט עם 1 L של ציר BHI ללא spectinomycin. החזר 1 מ ל של תרבות הלילה ההשעיה לתוך 1 L של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
4. לרכז חלבונים מן התרבות על ידי משקעים אמוניום גופרתי.
   הערה: לחלץ מגופי תא אם חלבון היעד הוא תאיים. ההליכים הבסיסיים עבור משקעים אמוניום גופרתי מפורטים במקומות אחרים¹².
   1. צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית במשך 20 דקות ב-10,000 x g ב -4 ° c. לשחזר את התרבות הסופרנטית לתוך מיכל זכוכית 3 L.
   2. הוסף 1,122 גרם של אמוניום גופרתי ל -2 ליטר של סופרנאטנט (80% רוויה) עם ערבוב נמרץ באמצעות מערבב מגנטי. הניחו לזרז להיווצר 4 שעות או יותר ב -4 ° c עם ערבוב.
      הערה: ניתן להמשיך את היווצרות הזרז למשך הלילה.
   3. צנטריפוגה את הפתרון אמוניום סולפט-זירז ב 15,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. . בסדר.
   4. לאסוף את הזרז עם מרית ולהעביר לתוך גביע זכוכית 200 mL. השהה מחדש את כדורי 35 mL של מאגר כריכה (50 mM נה₂PO₄, 300 מ"מ הנאל, 5 מ"מ הסרביאזול, pH 8.0).
   5. Dialyze ההשעיה נגד 2,500 mL של מאגר הכריכה באמצעות צינור דיאליזה שנוצר מחדש התאית, ב 4 ° c, עם ערבוב. החליפו את פתרון הדיאליזה לאחר 2 שעות והמשיכו בדיאליזה לילה.
   6. החלף שוב את פתרון הדיאליזה. המשך לdialyze עבור 2 שעות נוספות.
5. צנטריפוגה את ההשעיה דיאליזה ב 20,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. מסננים את הסופרנטנט דרך מסנן קרום באמצעות ציוד סינון יניקה. העבר את פילטרט לבקבוקון 75 ס מ² .
6. אנגיופלסטיקה הפוליהיסטידין-מתויג GTF-SI מההשעיה המלאכותית על ידי קיבוע כרומטוגרפיה של זיקה מתכת (IMAC).
   1. העברה 2 מ ל של משקע ה-IMAC הטעון Ni (כ-1 מ ל שרף) ועד לטור כרומטוגרפי שהפורקן שלו מותאם לצינור סיליקון. הסר את פתרון האחסון על-ידי זרימת כבידה.
      זהירות: אל תאפשר שרף להתייבש ברחבי IMAC.
   2. הוסף 3 מ ל של מים מזוקקים לתוך הטור כדי לשטוף את שרף. הוסף 5 מ ל של מאגר הכריכה כדי לבטלת את השרף.
   3. תכבה את הזרם. עם הזין של הופמן הוסף 5 מ ל של ההשעיה מסוננים משלב 6.5 כדי להפוך את השאיפה.
   4. מוסיפים את כל השאיפה להשעיה המסוננת הנותרת. מערבולת בעדינות את התערובת למשך 30 דקות ב -4 ° c.
   5. העמיסו את התערובת בחזרה על הטור. להסיר את ההשעיה על ידי זרם הכבידה. שטוף את שרף ה-IMAC עם 20 מ ל של מאגר מחייב.
      הערה: להתאים את קצב הזרימה כ 2 מ ל/דקה עם הזין קמצוץ הופמן לאורך ה-IMAC הבא.
   6. אליוט רקומביננטי GTF-SI עם 20 מ ל של מאגר להתחמק (50 mM נה₂PO₄, 300 מ"מ הנאל, 500 מ"מ הסרמאזול, pH 8.0).
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. יש לאחסן את החומק ב-4 ° c. שרף IMAC ניתן לשימוש חוזר. עיין בהוראות של שרף ה-IMAC.
7. החלף את מאגר האגירה עם מאגר האחסון (מאגר פוספט 50 מ"מ, pH 6.5) ורכז את הפתרון רקומביננטי GTF-SI כ-1 mL באמצעות יחידת אולטרה-מיון צנטריפוגליים. אחסן את התמיסה הרקומביננטי GTF-SI ב -4 ° c.
   הערה: לאשר את polyhistidine-מתויג GTF-SI טיהור באמצעות SDS-עמוד¹³ ו בלוק מערבי¹⁴ על ידי שימוש בחזרת peroxidase-מעלה מעלה אנטי פוליהיסטידין נוגדן חד שבטיים. תוספת של בחורים (ריכוז סופי, 0.1%) כדי למנוע את הצורך להימנע ספיחה ספציפי ליחידה, בהתאם חלבון היעד.

7. שחזור פונקציונלי על ידי רקומביננטי GTF-SI

1. רצף כל s. mutans המתח על צלחת bhi אגר בנפרד. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c
2. באמצעות קיסם שיניים מעוקר, לאסוף מושבה אחת כדי לחסן ל 2 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
3. השתמש 20 μL של תרבות הלילה של S. mutans gtfc כדי לחסן 2 מ ל של ציר bhi המכיל 1% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה בצינור מבחן זכוכית. הוסף את GTF-SI או נפח שווה ערך של הרכב ל -S. mutans gtf תרבות, ותרבות את התאים עם הצינור ממוקם בתנוחה נוטה לילה.
   הערה: לחטא את הפתרון GTF-SI עם פילטר מזרק סטרילי ולקבוע ריכוז חלבונים באמצעות שימוש בחלבון חומצות בתוך שיטת הפרוטאין¹⁵ לפני השימוש.
4. מתפרעים את השעיות בתרבות עם מערבל מערבולת במשך 10 ס מ. הדנט את השעיות. רוחצים את צינורות הבדיקה בכמות מספקת של מים מזוקקים.
5. הכתם את ביומאמים על קיר הצינור עם 1 מ ל של 0.25% Coomassie כחול מבריק (CBB).
6. Decant הפתרון המכתים אחרי 1 דקות. שטוף את צינורות הבדיקה עם כמות מספקת של מים מזוקקים. . האוויר מתייבש את צינורות הבדיקה

תוצאות

איור 3 מציג את הגודל של כל אמפליצין מ-pcr הראשון (איור 3a) ו-Pcr השני (איור 3a). הגודל של כל אמפליקון התכתב עם הגודל החזוי, כפי שמתואר בטבלה 1. איור 4A הופעות S. מושבות מוסדרות שינתה את המוצר השני של ה-PCR ומ...

Discussion

עיצוב התחל הוא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול. רצפי של Gtfc-הפוכה ו- spc^r-קדימה נקבע באופן אוטומטי על בסיס רצפים של שניהם אזור סוף 3 ′ של gtfc ו 5 ′ קצה אזור של spc^r. כל פריימר כולל 24 בסיסים משלימים הקודדים מקשר GS ורצף התגים שלו-coding באזורים 5 ' שלהם. שיבוש רצפי הרגולציה הילי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	For agarose gel electrophoresis
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227	Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture medium
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit	Sartorius	VS2032	Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge	Kubota	7780II
Chromatographic column	Bio-Rad	7321010	For IMAC
Dialysis membrane clamp	Fisher brand	21-153-100
Dialysis tubing	As One	2-316-06
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing	Eurofins Genomics
ECL substrate	Bio-Rad	170-5060	For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette	Bio-Rad	1652086	0.2 cm gap
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr solution	Nippon Gene	315-90051	For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Imager	GE Healthcare	29083461	For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole	Wako	095-00015	Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	EZ-022	Temperature setting: 4 °C
Incubator	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperature setting: 37 °C
Membrane filter	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm diameter
Microcentrifuge	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O	Wako	192-02815	Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH	Wako	198-13765	Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4	Wako	015-06737	Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin	Bio-Rad	1560133	For IMAC
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered
Protein standard	Bio-Rad	161-0381	For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus	As One	FH-1G
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC	Stock strain in the lab.		gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159	Stock strain in the lab.		S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA buffer preparation