使用超低输入载波保持架进行转录启动站点映射

摘要

基因表达(CAGE)帽分析是一种对mRNA 5'ends进行全基因组定量映射的方法,以单核苷酸分辨率捕获RNA聚合酶II转录起始位点。本作品描述了一种低输入(SLIC-CAGE)协议,用于使用纳米图总RNA生成高质量库。

摘要

基因表达(CAGE)帽分析是一种用于RNA聚合酶II转录起始位点(TSSs)的单核苷酸分辨率检测方法。准确检测 TSS 可增强核心启动子的识别和发现。此外,可以通过双向转录启动的签名来检测有源增强剂。此处介绍用于执行超低输入载波 CAGE(SLIC-CAGE)的协议。CAGE协议的这种SLIC适应通过人工增加RNA量,通过使用在感兴趣的样品中加入的体外转录RNA载体混合物,从而从纳米图总量中制备,从而最大限度地减少了RNA损失RNA(即数千个细胞)。载体模拟预期的DNA库片段长度分布,从而消除由同质载体丰度引起的偏差。在协议的最后阶段,载体通过带宿主内分酶的降解被移除,目标库被放大。目标样本库受到保护,防止降解,因为宿主内分酶识别位点很长(在18至27bp之间),使得它们在真核基因组中存在的概率非常低。最终结果是DNA库为下一代测序做好准备。协议中的所有步骤,至顺序,可在 6 天内完成。承运人准备需要一个完整的工作日;然而,它可以大量制备,并保持在-80°C冷冻。一旦测序,读取可以处理获得全基因组的单核苷酸分辨率TSS.TSS可用于核心促进剂或增强剂发现,提供对基因调控的洞察。聚合到启动器后,数据还可用于 5' 为中心的表达式分析。

引言

基因表达(CAGE)的帽分析是一种用于单核苷酸解析全基因组图谱的RNA聚合酶II转录起始位点(TSSs)1。其定量性质还允许 5' 端为中心的表达式分析。围绕TSS(约40 bp上游和下游)的区域是核心启动子,代表RNA聚合酶II和一般转录因子结合的物理位置(前2、3)。有关 TSS 的确切位置的信息可用于核心启动器发现和监测启动子动力学。此外,由于活性增强剂表现出双向转录的特征,CAGE数据也可用于增强剂发现和监测增强剂动力学4。CAGE方法最近越来越受欢迎,因为它在诸如ENCODE 5、modENCODE⁶和FANTOM项目7等备受瞩目的研究项目中有着广泛的应用和用途。此外,TSS 信息也被证明是重要的区分健康和疾病组织,因为疾病特异性的TSS可用于诊断^目的8。

尽管有几种 TSS 映射方法可用(CAGE、RAMPAGE、STRT、纳米笼、纳米CAGE-XL、寡核封盖),但我们和其他人最近已经表明,CAGE 是最无偏见的方法来捕获假阳性数最少的真实 TSS^9,10.最近的CAGE协议,nAnT-iCAGE^11,是TSS分析最公正的协议,因为它避免使用限制性酶将片段切割成短标记,并且不使用PCR扩增。nAnT-iCAGE 协议的局限性是需要大量起始材料(例如,每个样品的总 RNA 量为 5 μg)。为了回答具体、与生物学相关的问题,通常无法获得如此大量的起始材料(例如,对于FACS排序的细胞或早期胚胎阶段)。最后,如果nAnT-iCAGE成功,每个样本只能获得1-2 ng的DNA库材料,从而限制了可实现的测序深度。

为了仅使用总RNA的纳米图进行TSS分析,我们最近开发了超低输入载波-CAGE 10(SLIC-CAGE,图1)。SLIC-CAGE 只需要总 RNA 的 10 纳克才能获得高复杂度库。我们的协议依赖于精心设计的合成RNA载体添加到感兴趣的RNA,实现总共5μg的RNA材料。合成载体在长度分布上模仿目标DNA库,以避免由过量的均质分子引起的潜在偏差。载体的序列基于大肠杆菌-tRNA合成酶基因(表1)的序列,原因有二。首先,最终库中载体的任何剩余,即使已测序,也不会映射到真核基因组。其次,由于大肠杆菌是一种嗜血菌物种,其内务管理基因针对适用于SLIC-CAGE的温度范围进行了优化。载体序列还嵌入了宿主内源内切酶识别位点,允许从载体RNA分子中提取的DNA进行特定降解。目标样本派生库保持不变,因为宿主内分酶识别站点很长(I-CeuI = 27 bp;I-SceI = 18 bp),在真核基因组中不太可能发现。在载体具体降解和通过大小排除去除碎片后,目标库被扩增,为下一代测序做好准备。根据起始RNA量(1-100纳克),预计在13-18PCR扩增周期之间。每个样本的最终DNA量在5-50 ng之间,产生足够的材料进行深度测序。当只使用总RNA的1-2纳克时,可以检测到真正的TSS;但是,这些库的复杂性预计会较低。最后,由于SLIC-CAGE基于nAnT-iCAGE协议11,因此在测序之前,它能对多达8个样本进行多路复用。

研究方案

1. 准备承运商

1. 制备体外转录的DNA模板
   1. 通过组合41μL水、20μL的5xHF缓冲液、8μL的2.5mM dNTP、10μL的10μM独特正向底漆(PCR_GN5_f1,表2;引热器在水中溶解和稀释),为每个PCR模板制备PCR混合物。,10 μL 的 2 纳克/μL 模板质粒,包含合成载体基因和 1 μL Phusion 聚合酶。通过移液混合 PCR 混合物。可以同时准备所有 10 个模板的主组合(为 11 个反应做好准备)。
   2. 将 PCR 混合物的 90 μL 添加到每 10 μM 反向底漆的 10 μL (PCR_N6_r1-r10,表 2)。通过移液混合。
   3. PCR 使用以下程序放大模板:98 °C 表示 60 秒,(98 °C 表示 10 秒,50 °C 表示 30 秒),35 周期为 72°C,72°C 为 10 分钟,在 4°C 保持。
   4. PCR扩增DNA模板的凝胶纯化
      1. 准备1%的甘蔗凝胶(建议低熔胶)。
      2. 为了减小体积,在低温(30-40°C)下,使用真空集中器将PCR反应混合物的总体积从100μL浓缩至20μL总体积。
      3. 加入6μL的6x加载染料,混合良好,并加载在凝胶上。在适用于所用电泳罐(5~10 V/cm)的电压下,在 1x TAE 缓冲液中运行电泳 30 分钟。并行运行 100 bp 或 1,000 bp DNA 阶梯。
      4. 使用干净的手术刀,切除含有目标PCR产品的凝胶片。避免过量的阿加玫瑰凝胶。使用凝胶萃取套件净化 PCR 产品(根据制造商的说明)。
         注:从胶凝糖凝胶中分离出的A260/A230DNA比例通常较低(0.1~0.3)。预期目标产品和侧面产品如图2A所示。100 μL PCR 反应的预期收率为 1.2±3 μg。反应可以放大以获得更高的收率。
2. 载体分子体外转录
   1. 根据制造商的说明,使用T7 RNA聚合酶在体外抄录载体RNA。设置 10~20 μL 反应(推荐的试剂盒在材料表中)。
   2. 使用RNA纯化试剂盒纯化体外转录RNA。按照制造商的标准说明,使用DNase I在溶液中建立DNA消化,并在50μL水中释放RNA。要提高洗脱产量,在离心前将水留在柱中 5 分钟。
      注:请注意不要超过列的最大装订能力(在材料表中提及的套件中,容量高达 100 μg)。PCR 模板 1~10 (长度为 1 kbp 至 200 bp)的预期收率为 10 μL 体外转录反应的 25–50 μg。反应可以放大,以获得更多的载体分子。
3. 体外转录载体RNA分子的封顶
   1. 通过组合 2 μL 的 10x 封盖缓冲液、1 μL 的 10 mM GTP、1 μL 的 2 mM SAM(新鲜稀释)和 1 μL 的 Vaccinia 封盖酶(每个载体 RNA)来制备封盖混合物。
   2. 将每个载体分子的10μg混合在总体积的15μL中,在65°C下变性10分钟。立即放置在冰上,以防止二级结构形成。
   3. 将变性载体RNA与5μL的封顶混合物混合,在37°C下孵育1小时。
   4. 使用RNA纯化试剂盒纯化封顶RNA分子 – 遵循制造商的清理方案。在30μL水中的ELute RNA。要提高洗脱产量,在离心前将水留在柱中 5 分钟。
      注:使用微体积分光光度计测量浓度。预期 A260/A280 比率为 >2,A260/A230 为 >2。请注意,对于某些 RNA 样本,A260/A230 可能介于 1.3⁄2 之间。使用10μg未封顶RNA时的预期收率为9~10μg的封顶RNA。
4. 通过组合表 3中描述的金额,准备封顶和未封顶车厢的组合。通过轻拂管子和使用微体积分光光度计测量浓度,将混合良好。
   注:如果需要较高的载体浓度以适合逆转录反应(见下文),则载波混合物可在中低温(30-35 °C)下使用真空集中器浓缩,直到达到所需的最终浓度。步骤 2_14 从村田等人报告的标准 nAnT-iCAGE 协议修改,¹¹

2. 反向转录

1. 将1 μL的RT引物(2.5mM TCT-N6溶解在水中,对于序列见补充表1),10 ng的总RNA感兴趣和4,990纳克的载体混合物(表3)在10μL的总体积在低结合PCR板。通过轻拂管子进行混合。
   注:如果样品RNA稀释过,无法进行逆转录(见下文),将其与适当量的载体结合,使用真空浓缩器浓缩至9μL总体积,并添加1μL的RT底漆。加入载体耳,达到5μg的RNA总可防止样品流失。
2. 在 65°C 下将混合物从步骤 2.1 加热 5 分钟,并立即放在冰上,以防止补放。
3. 准备逆转录 (RT) 混合。
   1. 对于每个样品,结合6.1 μL的水(无RNase和DNase),7.6 μL的5x第一链缓冲液,1.9μL的0.1M DTT,1μL的10mM dNTP,7.6 μL的沙洛糖/山梨醇混合物(见村田等人11的配方)和3.8μL的推荐逆转录酶(见[见]c)6、材料表)。轻拂管子,将管很好地混合。
4. 将28μL的RT混合物加入PCR管中,加入10μL的RNA、载体和RT底漆(总体积38μL)。通过移液将混合良好。
   注:由于沙沙洛/山梨醇,该混合物具有高度粘性。混合,直到明显同质。
5. 使用以下程序在热循环器中孵育:25 °C 30 秒,50°C 60 分钟,并在 4°C 保持。
6. 使用SPRI磁珠纯化cDNA:RNA杂交
   1. 将68.4 μL的推荐RNA酶和无DNase SPRI磁珠(见材料表)添加到RT混合物的38μL(珠与样品比1.8:1)。在室温 (RT) 下,通过移液和孵育 5 分钟,将混合良好。
   2. 将磁力支架上的珠子分离5分钟,丢弃上清液,用200μL的70%乙醇(新鲜制备)清洗珠子两次。
      注:乙醇在不混合的情况下,当管子位于磁性支架上时,将乙醇添加到磁珠中。添加的乙醇被立即去除。在进行处理时,应小心不要丢失任何珠子,因为它可能导致样品丢失。
   3. 当管子仍然位于磁性支架上时,去除所有乙醇痕迹。使用 P10 移液器可以取出乙醇液滴并将其推出管中。不要让珠子干燥。
   4. 在 37°C 下预热 42 μL 的水,通过上下移液 60 倍来洗取样品。
      注:小心不要通过移液引起发泡,因为它可能导致泡沫中的珠子(即带着样品)损失。
   5. 在37°C下孵育5分钟,不盖,允许微量乙醇蒸发。
   6. 将磁架上的磁珠分开 5 分钟,并将上清液转移到新板。
      注:尝试检索所有上清液,以防止样品丢失,同时避免珠子结转。使用 P10 移液器获取最后一个样品液滴。

3. 氧化

1. 在纯化RT反应中加入2 μL的1M NaOAc(pH 4.5)。通过移液混合,加入 2 μL 的 250 mM NaIO 4,然后再次混合。
2. 在冰上孵育45分钟,用铝箔盖住盘子,避免光线照射。
3. 在氧化混合物中加入16μL的Tris-HCl(pH 8.5),以中和pH值。
4. 使用 SPRI 磁珠纯化氧化 cDNA:RNA 杂交。将 108 μL 的 SPRI 磁珠添加到 60 μL 的氧化混合物中(1.8:1 珠与样品比)。重复步骤 2.6.1~2.6.6 中所述的纯化。使用42μL的水预热至37°C。
   注:通过每 1 毫克 NaIO₄加入 18.7 μL 水,新鲜制备 250 mM NaIO₄ 。NaIO₄是光敏的;因此,将溶液保存在铝箔覆盖的管中或耐光管中。

4. 生物异化

1. 在含有纯化氧化样品的管中加入4μL的1M NaOAc(pH 6.0),并通过移液混合。
2. 加入4μL的10 mM生物素溶液,通过移液混合,在23°C下在热循环器中孵育2小时,以避免光线。
   注:通过将 50 mg 生物锡与 13.5 mL DMSO 混合制备生物锡溶液。制作一次性等分,在-80°C冷冻。
3. 使用 SPRI 磁珠纯化生物素化 cDNA:RNA 杂交。加入12μL的2丙醇,并通过移液混合。加入 108 μL 的 SPRI 珠(1.8:1 珠与样品比),然后重复步骤 2.6.1~2.6.6 中所述的纯化。使用42 μL的水在37°C预热。
   注:协议可以在这里暂停,样品冷冻在-80°C。

5. RNase I 消化不良

1. 将 4.5 μL 的 10x RNase I 缓冲液与每个样品 0.5 μL 的 RNase I (10 U/μL) 混合制备 RNase I。通过移液混合。
2. 在每个纯化样品中加入5μL的混合物(共45μL)。通过移液混合,在37°C下孵育30分钟。

6. 准备链球菌珠

1. 对于每个样品,将30μL的链球菌珠浆与0.38μL的20mg/mL tRNA混合。在冰上孵育30分钟,每5分钟通过轻拂管子混合。
   注:在移液之前,通过轻拂瓶子,重新悬浮链球菌珠浆。tRNA溶液应根据村田^等人11
2. 将磁性支架上的珠子分开 2⁄3 分钟,取出上清液。
3. 通过重新悬浮在15 μL的缓冲液A中清洗珠子。将磁性支架上的珠子分离2⁄3分钟,并去除上清液。重复洗涤并取出上清液。
4. 在105μL的缓冲A中重新悬浮珠子,并加入0.19 μL的20mg/mL的tRNA。通过移液将混合良好。
   注:使用前应新鲜准备珠子。在RNase I消化期间开始准备珠子。对于多个样品,将珠子放在一个管中。

7. 捕获盖

1. 示例绑定
   1. 将105 μL的制备链球菌珠加入45μL的RNase I处理样品中。通过移液混合,在37°C下孵育30分钟。每10分钟移液混合一次。
   2. 将磁性支架上的珠子分开 2⁄3 分钟,取出上清液。
2. 洗涤珠
   1. 加入150 μL的洗涤缓冲液A,并通过移液重新悬浮珠子。将磁性支架上的磁珠分开 2⁄3 分钟,然后取出上清液。
   2. 加入150 μL的洗涤缓冲液B,并通过移液重新悬浮珠子。将磁性支架上的磁珠分开 2⁄3 分钟,然后取出上清液。
   3. 加入150 μL的洗涤缓冲液C,并通过移液重新悬浮珠子。将磁性支架上的磁珠分开 2⁄3 分钟,然后取出上清液。
      注:缓冲液 B 和 C 应预热至 37°C。洗涤缓冲液A、B和C的配方如村田^等人11所述
3. cDNA 释放
   1. 通过将 58.5 μL 的水与 6.5 μL 的 10x RNase I 缓冲液混合,制备 1x RNase I 缓冲液。
   2. 在 35 μL 的 1x RNase I 缓冲液中重新悬浮珠子。在95°C孵育5分钟,直接在冰上转移2分钟,以防止cDNA重新结合。在转移到冰上时握住盖子,因为它们可能会因压力积聚而弹出。
   3. 在磁性支架上分离珠子 2⁄3 分钟,并将上清液转移到新板。
   4. 在 30 μL 的 1x RNase I 缓冲液中重新悬浮珠子。将磁性支架上的珠子分离 2⁄3 分钟,并将上清液转移到先前收集的上清液(洗脱 cDNA 的总体积应约为 65 μL)。

8. RNA去除由RNase H和RNase I消化

1. 每样品,结合2.4 μL的水,0.5 μL的10xRNase I缓冲液,0.1 μL的RNase H和2μL的RNase I。
2. 将5μL的混合物加入释放的cDNA样品的65μL,并通过移液混合。在37°C孵育15分钟,在4°C保持。
3. 使用 SPRI 磁珠从 RNase 消化混合物中纯化 cDNA。将 126 μL 的 SPRI 珠添加到 70 μL 的降解反应中,并通过移液混合。按照 2.6.1~2.6.6 中 SPRI 珠子纯化所述的纯化步骤进行操作。如所述,在37°C下使用42 μL的水预热。
4. 通过组合 4.5 μL 10x RNase I 缓冲液和 0.5 μL RNase I 混合制备 RNase I。
5. 将5μL的RNase混合物加入纯化cDNA样品的40μL。通过移液混合,在37°C下孵育30分钟,在4°C下保持。
6. 使用 SPRI 磁珠净化样品。将 81 μL 的 SPRI 珠添加到 45 μL 的降解反应中,并通过移液混合。按照 2.6.1~2.6.6 中 SPRI 珠子纯化所述的纯化步骤进行操作。如上所述,使用42 μL的水。

9. 5' 链接器的关联

1. 使用真空浓缩器将纯化的 cDNA 样品浓缩到 4 μL。保持温度在30~35 °C。使用移液器测试卷。如果样品干燥至完整,则加入4μL水溶解。
   注:最好避免干燥,防止样品流失。
2. 在95°C孵育浓缩样品5分钟,并立即在冰上放置2分钟,以防止补放。在转移管时握住盖子,因为盖子可能会因压力积聚而弹出。
3. 在55°C下孵育2.5μM 5'连结器的4μL,5分钟,并立即在冰上放置2分钟,以防止肾上当。
4. 将 2.5 μM 5' 链接器的 4 μL 与 4 μL 样品混合。
   注:5'链接者应按照补充表2、补充表3、补充表4和补充表5编制。使用前使用 100 mM NaCl 将 10 μM 5' 连结器稀释至 2.5 μM 浓度。
5. 将16μL的结扎预混合(见材料表)加入混合5'链接器和样品中,并通过移液很好地混合。在16°C孵育16小时。
6. 使用 SPRI 磁珠净化结扎混合物。添加 43.2 μL 的 SPRI 珠,然后按照步骤 2.6.1~2.6.6 进行操作。使用42 μL的水在37°C预热。
7. 在步骤 9.6 中重复纯化,将 72 μL 的 SPRI 磁珠添加到转移的上清液(1.8:1 珠与样品比)。
   注:5'链接器包含条形码,允许在测序前汇集多达 8 个样本(如村田等人¹¹和补充表 1中所述,提供 8 个三核苷酸条形码)。

10. 3' 链接器的关联

1. 使用步骤 9.1 中所述的真空集中器将纯化样品浓缩到 4 μL。
2. 在95°C孵育浓缩样品5分钟,并立即在冰上放置2分钟,以防止补放。在转移管时握住盖子,因为盖子可能会因压力积聚而弹出。
3. 在 65°C 下孵育 2.5 μM 3' 连结器的 4 μL,5 分钟,并立即在冰上放置 2 分钟,以防止肾兴奋。
4. 将2.5 μM 3' 链接器的4 μL添加到浓缩样品的4μL中。
5. 加入16μL的结扎预混合,并通过移液混合良好。在16°C孵育16小时。
6. 使用 SPRI 磁珠净化结扎混合物。添加 43.2 μL 的 SPRI 珠,然后按照步骤 2.6.1~2.6.6 进行操作。使用42 μL的水预热至37°C。
   注:3' 链接器应根据补充表 6和补充表 7进行准备。使用 100 mM NaCl 将 10 μM 3' 连结器稀释至 2.5 μM 浓度。

11. 脱磷化

1. 通过组合 4 μL 的水、5 μL 的 10x SAP 缓冲液和 1 μL SAP 酶来制备 SAP 混合物。
2. 将 10 μL 的 SAP 混合物加入纯化的结扎样品(总体积 50 μL),并使用以下程序在热循环器中孵育:37°C 30 分钟,65°C 15 分钟,在 4°C 保持。

12. 使用乌拉西尔特异性切除酶降解 3' 链接器上绞线

1. 在脱磷酸化样品中加入2μL的尿素特异性切除酶(见材料表),使用以下程序在热循环器中通过移液和孵育混合:37°C30分钟,95°C5分钟,并立即在冰上放置2分钟至防止支离破碎的上股的重新绞合。
2. 在 52μl 混合物中加入 93.6 μL 的 SPRI 磁珠,并通过移液混合均匀地净化反应混合物。重复纯化步骤 2.6.1~2.6.6。如所述,在37°C下预热42μL水。

13. 第二股合成

1. 通过组合 5 μL 的 10x DNA 聚合酶反应缓冲液、2 μL 水、1 μL 的 10 mM dNTP、1 μL 的 50 μM nAnT-iCAGE 第二链底漆(序列在补充表 1中)和 1 μL DNA 外糖缺乏聚合酶酶(参见材料表中推荐的聚合酶)。
2. 将10μL的混合物加入纯化样品中,通过移液混合(总体积为50μL)。使用以下程序在热循环器中孵育:95°C 5分钟,55°C 5分钟,72°C 30分钟,保持4°C。

14. 使用外糖酶I降解第二股合成引物

1. 将1μL的外糖酶I加入第二股合成混合物中。通过移液混合,在37°C孵育30分钟,然后保持在4°C。
2. 将 91.8 μL 的 SPRI 磁珠加入 51 μL 的 Exonuclease I 处理样品,以纯化双绞合 DNA。重复 2.6.1~2.6.6 中所述的纯化步骤。并随42μL的水预热至37°C,如所述。
3. 如步骤 9.1 所述,使用真空集中器将样品浓缩到 15 μL。

15. 质量和数量控制

1. 使用1μL的浓缩样品,并在DNA质量分析仪上运行高灵敏度DNA芯片。预期配置文件/数量如图3所示。

16. 第一轮承运人退化

1. 通过组合2μL的水、2μL的10x限制性酶缓冲液、1μL的I-SceI和1μL的I-CeuI来制备降解混合物。
2. 将6μL的降解混合物加入浓缩样品的14μL,并通过移液混合。在37°C孵育3小时,随后在65°C下进行20分钟失活,并在4°C下保持。
3. 使用 SPRI 磁珠净化降解混合物。加入5μL的水以增加降解混合物的体积,并加入45μL的SPRI珠(1.8:1珠与样品比)。重复纯化,如步骤 2.6.1~2.6.6 中所述。并用42μL的水预热至37°C。
4. 如步骤 9.1 所述,将洗脱样品从总体积的 42 μL 浓缩到 20 μL。

17. 控制降解水平并确定PCR放大周期数

1. 准备 qPCR 组合,用于放大整个库(适配器组合)。将 3.8 μL 的水、5 μL 的 qPCR 预混合 (2x)、0.1 μL 的 10 μM 适配器_f1 引物(5'-AATGATACAGACCACCA-3')和 0.1 μL 的 10 μM 适配器_r1 引物(5' - CAAGAGAGACACACGA-3') (参见推荐材料表)。
2. 将 9 μL 的 qPCR 适配器组合与步骤 16.4 中的 1 μL 样品混合,并通过移液很好地混合。
3. 准备qPCR混合物,用于扩增从载体(载体混合)中提取的DNA。结合 3.8 μL 的水,5 μL 的 qPCR 预混合 (2x), 0.1 μl 10 μM 载波_f1 引基 (5' -GCGGGCGCGCGCTAC-3'), 和 0.1 μL 的 10 μM 适配器_r1 引油每个样品
4. 将 9 μL 的 qPCR 载体混合物与步骤 16.4 中的 1 μL 样品混合,并通过移液很好地混合。
5. 设置 qPCR 程序:95 °C 3 分钟(95 °C 20 秒,60 °C 20 秒,72 °C 2 分钟)重复 40x,然后是仪器特异性变性曲线 (65-95 °C),并保持在 4 °C。
   注:用水替换样品,准备负片控制。

18. 目标库的PCR扩增

1. 通过组合 6 μL 水、0.5 μL 的 10 μM 适配器_f1 底漆、0.5 μL 的 10 μM 适配器_r1 引底和 25 μL 的 PCR 预混合(2x),制备 PCR 扩增混合物。通过移液混合(参见推荐的PCR预混料的材料表)。
2. 从步骤16.4将PCR混合物的32μL添加到样品的18μL。通过移液彻底混合。
3. 设置 PCR 放大:95 °C 3 分钟(98 °C 表示 20 秒,60°C 表示 15 秒,72°C 为 2 分钟)12-18 个周期,72°C 为 2 分钟,在 4°C 下保持。
   注:PCR 循环的确切数量由 qPCR 结果确定,对应于使用适配器引物组合获得的 Ct 值(PCR 周期数等于 Ct 值)。
4. 将 90 μL 的 SPRI 磁珠加入 50 μL 的放大样品中,并通过移液彻底混合,从而净化放大的样品。重复步骤 2.6.1~2.6.6 中描述的纯化步骤。并使用 42 μL 的水对样品进行洗取,如上所述。

19. 第二轮承运人退化

1. 重复步骤 16.1~16.3。
2. 使用 SPRI 磁珠净化降解混合物。向样品中加入10μL的水以增加体积,并与30μL的SPRI珠(1:1珠与样品比)混合。重复纯化,如步骤 2.6.1~2.6.6 中所述。并随42μL的水在37°C下预热,如所述。
3. 将洗脱样品从总体积的42μL浓缩至30μL。

20. 库大小选择

1. 将 24 μL 的 SPRI 磁珠与步骤 19.3 中的 30 μL 样品混合。(0.8:1 珠子与样品比)。重复步骤 2.6.1~2.6.6 中所述的纯化步骤。并在42μL的水中洗取样品,如上所述。
2. 如步骤 9.1 所述,将样品浓缩到大约 14 μL。

21. 质量控制

1. 规模分布评估
   1. 在高灵敏度DNA芯片上运行1μL的样品。预期结果如图4所示。
      注:如果小于 200 bp 的片段可见(参见图 4A,C所示),则应重复大小选择(步骤 20.1–20.2),直到删除短片段(图 4B,D)。通常,额外的一轮大小选择就足够了。如果短片段的量很严重(如图4C所示),珠子与样本比应降至0.6:1。
2. 车厢降解质量控制
   1. 重复步骤 17.1~17.5。
      注:根据HS DNA芯片运行(区域分析)中估计的库的浓度,样品需要在qPCR之前稀释。使用0.5 μL的样品,以避免样品损失,并稀释100~500倍的水(稀释至1~20 pg/μL最终浓度)。使用适配器和载波组合获得的 Ct 值之间的预期差值为 5–10。
3. 库量化
   1. 通过将 20 μL 的 100 mg/mL lambda DNA 标准与 980 μL 的 1x TE 混合(通过稀释 DNA 定量试剂盒中提供的 20x TE 进行制备),制备 lambda DNA 标准的工作稀释。羔羊DNA的稀释可以储存在-20°C。
   2. 根据补充表8,通过混合稀释的lambda标准和1x TE制备lambda DNA标准连续稀释剂。
      注:为获得更高的精度,建议在所有管中添加 100 μL 的 1x TE 缓冲液,并根据需要根据要添加的稀释的 lambda 体积去除 1x TE 体积。不要使用超过 1 μL 的库;建议使用 384 孔板进行此测量。

结果

本报告描述了从起始总RNA材料的纳米图中获取测序就绪库的完整SLIC-CAGE协议(图1)。为了获得合成RNA载体混合物,首先,PCR载体模板需要制备和凝胶纯化,以消除PCR侧产物(图2A)。每个PCR模板(共10个)是使用共同的正向,但不同的反向引物(表2),导致PCR模板的不同长度,使合成RNA载体的大小变异。一旦纯化,PCR模板用于载体分子的体外转录。如果模板经过凝胶纯化,则预期会提供单个RNA载体产品(参见图2B中的代表性凝胶分析)。载体的制备可根据需要进行升级,在制备时,混合和冷冻在-80°C下供将来使用。

使用推荐的最小样品总RNA(10 ng)结合16-18周期的PCR扩增,可以达到高复杂性SLIC-CAGE库。扩增最终库所需的PCR周期数在很大程度上取决于总输入RNA的数量(预期周期数在表4中)。

在第一轮降级后,在 qPCR 结果(步骤 17)中,使用适配器_f1 或载波_f1 引物获得的 Ct 值之间的预期差值为 1-2,使用适配器_f1 比载波_f1 低获得 Ct 值。

最终库中片段长度的分布在 200-2,000 bp 之间,平均片段大小为 700-900 bp(基于使用生物分析仪软件的区域分析,图 4B,D)。如图4A,C所示,较短的片段必须通过额外的大小排除(步骤20-21)来移除。这些短片段是 PCR 扩增人工制品,而不是目标库。请注意,较短的片段在测序流单元上更好地聚类,并可能导致排序问题。

每个样本获得库材料的预期量在 5-50 纳克之间。显著降低数量表明在协议期间样品损失。如果获得的低数量足以进行测序(需要 2-3 ng 的池库),则库的复杂性可能较低(见下文)。

根据测序机的不同,可能需要优化加载到流单元的库数量。使用 Illumina HiSeq 2500,加载 8-12 pM SLIC-CAGE 库平均提供 1.5 亿-2 亿次读取,其中 80% 的读取通过质量分数 Q30 作为阈值。

然后,获取的读取映射到参考基因组 [对于 50 bp 读取,Bowtie2¹²可与允许每个种子序列(22 bp)零不匹配的默认参数一起使用]。预期的映射效率取决于总RNA输入量,如表5。然后,可以将唯一映射的读取加载到 R 图形和统计计算环境¹³中,并使用 CAGEr(生物导体封装¹⁴)进行处理。包晕影易于理解,并详细介绍了映射数据的工作流和处理。库复杂性的一个简单可视化控制是启动子宽度的分布,因为低复杂度库将人为地缩小启动子(图5A,SLIC-CAGE库派生自总RNA的1 ng,详情请见前文出版物¹⁰。然而,即使是低复杂度SLIC-CAGE库也能识别真正的CTSS,其精度比低/中位TSS映射的替代方法更精确(图5B,C)。

图 1:SLIC-CAGE 协议中的步骤。样品RNA与RNA载体混合物混合,达到总RNA材料的5μg。cDNA通过逆转录合成,盖使用酸钠氧化。氧化允许使用生物素氢化物将生物素附着在帽子上。生物蛋白附着在mRNA的3°端,因为它也使用酸钠被氧化。为了从mRNA:cDNA杂交物中消除生物素,从未完全合成的cDNA和mRNA的3°端,用RNase I.cDNA处理,然后通过链球菌素磁珠的亲亲纯化选择达到mRNA5°末端的rNase I.cDNA(捕获帽)。释放cDNA后,5+和3+链接器被连接。源自载体的库分子使用I-SceI和I-CeuI致内分酶降解,并使用SPRI磁珠去除片段。然后,库被放大。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:载体PCR模板和载体体外转录本的代表性凝胶分析。(A)凝胶纯化前的载体PCR模板:第一口井包含1 kbp标记,然后是载体PCR模板1,1-10。(B)载体体外转录本:第一口井包含1 kbp标记,后跟载体转录1-10。在装车前,在95°C下加热5分钟,使载波转录。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:代表性DNA质量(高灵敏度DNA芯片)的SLIC-CAGE在第一轮载体降解前的痕迹。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:PCR扩增后的SLIC-CAGE库的代表性DNA质量(高灵敏度DNA芯片)痕迹。(A) SLIC-CAGE 库需要额外的大小选择来删除短片段。(B) SLIC-CAGE 库在尺寸选择后使用 0.6x SPRI 磁珠与采样比。(C) 输出量较低的 SLIC-CAGE 库,需要选择大小以去除短片段。(D) SLIC-CAGE 库在选择尺寸后输出量较低,使用 0.6:1 SPRI 磁珠与采样比。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:SLIC-CAGE 库的验证。(A)在 SLIC-CAGE 库中标记簇间宽度的分布,这些宽度从S.cerevisae总 RNA 的 1、5 或 10 ng 制备,并在 nAnT-iCAGE 库中从 5 μg 的S. cerevisae总 RNA 制备。1 ng SLIC-CAGE 库中的大量窄标记群集表示其低复杂性。(B) 在S. s. SLIC-CAGE 库中用于 CTSS 标识的 ROC 曲线。所有S. cerevisae nAnT-iCAGE CTSS 都用作真正的集。(C) 在S. cerevisae纳米库中用于 CTSS 识别的 ROC 曲线.所有S. cerevisae nAnT-iCAGE CTSS 都用作真正的集。ROC曲线的比较表明,SLIC-CAGE在CTSS识别中优于纳米凯奇。使用了阵列快递E-MTAB-6519的数据。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:载体合成基因序列。I-SceI 网站为粗体,斜体为紫色,I-CeuI 识别站点为绿色。请点击此处下载此文件。

载体	反向引漆 5'-3'		PCR 产品长度 / bp
1	PCR_N6_r1: NNNNCTACGTCGCGAATT		1034
2	PCR_N6_r2: NNNNATATATATATATATATATGGGGGGGGGGGG		966
3	PCR_N6_r3: NNNNCACTGGGATCTCTTCG		889
4	PCR_N6_r4: NNNNNGCCGTCGATATATTTTCGT		821
5	PCR_N6_r5: NNNNNNNATGCAAGTCTTC		744
6	PCR_N6_r6: NNNNNGTGAATATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT		676
7	PCR_N6_r7: NNNNNCGCGCTCCCTCATAC		599
8	PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGTTTTCGTAC		531
9	PCR_N6_r9: NNNNNACCGCCGCCCCCGCGG		454
10	PCR_N6_r10: NNNNNCAGGACATTTTGCCCCACAA		386
	• 所有载体模板的正向底漆都相同。下划线是 T7 启动子序列。PCR_GN5_f1: 塔塔塔CTCTCTA

表2:载体模板放大的引信。对于所有载波模板,正向底漆都相同。下划线是 T7 启动子序列。PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNCAGCGTTCTA.使用不同的反向引漆,产生PCR模板,从而产生不同长度的载波RNA。

载体	长度	未封顶/μg	盖/μg
1	1034	3.96	0.45
2	966	8.36	0.95
3	889	4.4	0.5
4	821	6.6	0.75
5	744	4.4	0.5
6	676	3.08	0.35
7	599	4.4	0.5
8	531	3.96	0.45
9	454	2.64	0.3
10	386	2.2	0.25

表3:RNA载体混合物。载波混合物共 49 μg 0.3-1 kbp:未封顶 = 44 μg,上限 = 5 μg。

总RNA输入/ng	PCR 周期
1 纳克	18
2 纳克	17
5 纳克	16
10 纳克	15-16
25 纳克	14-15
50 纳克	13-15
100 纳克	12-14

表 4:样品总RNA输入依赖性中PCR周期的预期数量。近似周期数基于使用糖精菌、果蝇黑色素和肌肉总RNA进行的实验。

总RNA输入/纳克	总体映射百分比	% 唯一映射	百分比载波
1 纳克	30	20-30	30
2 纳克	60	20-50	10
5 纳克	60-70	40-60	5-10
10 纳克	60-70	40-60	5-10
25 纳克	65-80	40-70	0-5
50 纳克	65-80	40-70	0-3
100 纳克	70-85	40-70	0-2

表5:预期映射效率和RNA总输入量的依赖程度。根据使用糖精和肌肉总RNA进行的实验,给出了近似数字。

讨论

要成功进行 SLIC-CAGE 库准备,使用低结合提示和管来防止样品吸附导致样品损失至关重要。在涉及检索上清液的所有步骤中,建议恢复整个样本体积。由于该协议具有多个步骤,连续样本丢失将导致库失败。

如果 CAGE (nAnT-iCAGE) 没有正常执行,最好用相同总RNA样本的不同输入量(10 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng)测试SLIC-CAGE,并与使用5μg总RNA制备的nAnT-iCAGE库进行比较。如果 nAnT-iCAGE 库不成功(小于每个样本获得的 DNA 库的 0.5-1 ng),SLIC-CAGE 不太可能工作,并且需要将样本损失降至最低。

确保没有未封顶的降解RNA或rRNA的高质量库是关键步骤,第7节所述的封顶。非常重要的是,链球菌素珠子在洗涤缓冲液中彻底悬浮,在继续下一步洗涤步骤或 cDNA 洗脱之前,清除洗涤缓冲液。

如果第一轮载波降级后qPCR的结果显示适配器_f1和载波_f1引能的使用没有区别,仍建议继续使用该协议。如果在第二轮载波降级后,Ct 值的差异小于 5,则建议进行第三轮载波降级。我们从来没有发现第三轮降解是必要的,如果发生,建议取代宿主内分糖种群。

如果获得的库的最终量不足以进行测序,则可在协议中添加其他多轮 PCR 扩增。然后,PCR 扩增可以设置所需的最小扩增周期,以产生足够的材料进行测序,同时考虑到在尺寸选择中无法避免的样品损失。然后,应使用 SPRI 磁珠进行纯化或尺寸选择,直到去除所有小 (<200 bp) 片段(如果需要,使用 0.6:1 珠与采样比),并且库应使用 Picogreen 进行量化。

库可以在单端或成对端模式下排序。使用成对端测序,可以获得有关转录等形的信息。此外,由于使用随机引物(TCT-N 6,N₆是随机六项机)进行逆转录,因此,来自测序3'端的信息可用作唯一分子标识符(UMI),以折叠PCR重复项。由于使用适量的PCR扩增周期(最多18个),以前发现使用UMIs是不必要的。

由于协议的核心依赖于nAnT-iCAGE1,SLIC-CAGE使用8个条形码。因此,当前不支持多路复用超过 8 个示例。此外,SLIC-CAGE 和 nAnT-iCAGE 都不适合捕获小于 200 bp 的 RNA,因为协议旨在通过使用 AMPure XP 磁珠排除尺寸来去除链接器和 PCR 人工制品。

SLIC-CAGE 是唯一一种使用总RNA材料的纳米图绘制转录起始位点的无偏低输入单核苷酸分辨率方法。替代方法依赖于逆转录酶的模板切换活性,以条形码封盖RNA,而不是捕获上限(例如,NanoCAGE¹⁵和 NanoPARE¹⁶)。由于模板切换,这些方法在TSS检测中表现出序列特定的偏差,导致误报TS的数量减少和真TSS9、10的数量减少。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	59304-100ML-F	Used in RNAclean XP purification.
3' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol.
5' linkers			Sequences are described in Murata et al. 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol.
Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881	Purification of DNA
Agencourt RNAClean XP Kit	Beckman Coulter	A63987	Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.
Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips	Axygen (available through Corning)	PCR-0208-CP-C	Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).
Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps	Axygen (available through Corning)	PCR-02CP-C	Caps for PCR plates.
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube	Axygen (available through Corning)	MCT-150-L-C	Low-binding 1.5 mL tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.
Axygen 96 well no skirt PCR microplate	Axygen (available through Corning)	PCR-96-C	Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples
Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits	Agilent		To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)
Biotin (Long Arm) Hydrazide	Vector laboratories	SP-1100	Biotinylation/tagging
Cutsmart buffer	NEB		Restriction enzyme buffer
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase	NEB	M0259S	Second strand synthesis
DNA Ligation Kit, Mighty Mix	Takara	6023	Used for 5' and 3'-linker ligation
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	18427013	dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)
Dynabeads M-270 Streptavidin	Invitrogen	65305	Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.
DynaMag-2 Magnet	ThermoFisher Scientific	12321D	Magnetic stand for 1.5 mL tubes - used to prepare Streptavidin beads.
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	ThermoFisher Scientific	12027	Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.
Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	51976-500ML-F	Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.
Exonuclease I (E. coli)	NEB	M0293S	Leftover primer degradation
Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS	NEB	B7025S	agarose gel loading dye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S	Kit for carrier in vitro transcription
Horizontal electrophoresis apparatus			purification of carrier DNA templates from agarose gels
I-Ceu	NEB	R0699S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
I-SceI	NEB	R0694S	Homing endonuclease used for carrier degradation.
KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK2601	PCR mix for target library amplification
KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x	Kapa Biosystems (Supplied by Roche)	KK4600	qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles
Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µL, 1-20 µL, 20-200 µL)	Gilson		Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.
Microplate reader			For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.
nuclease free water	ThermoFisher Scientific	AM9937	Or any nuclease (DNase and RNase) free water
PCR thermal cycler			incubation steps and PCR amplficication
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F530S	DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Purification of carrier PCR templates from agarose gels.
qPCR machine			determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent	ThermoFisher Scientific	P11495	Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	NEB	N0551S	DNA ladder
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N0550S	DNA ladder
Ribonuclease H	Takara	2150A	Digestion of RNA after cap-trapping.
RNase ONE Ribonuclease	Promega	M4261	Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free	VWR	AAJ63669-AK	Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free			Or any nuclease (DNase and RNase) free solution
Sodium periodate	Sigma-Aldrich	311448-100G	Oxidation of vicinal diols
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719390-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1,000 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719463-1000EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719412-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated	Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)	Z719447-960EA	Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.
SpeedVac Vacuum Concentrator			concentrating samples in various steps to lower volume
SuperScript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044	Used for reverse transcription (1st CAGE step)
Trehalose/sorbitol solution			Preparation is described in Murata et al. 2014.
Tris-HCl, 1 M aq.soln, pH 8.5			1 M solution, DNase and RNase free
tRNA (20 mg/mL)			tRNA solution. Preparation is described in Murata et al. 2014.
UltraPure Low Melting Point Agarose	ThermoFisher Scientific	16520050	Or any suitable pure low-melt agarose.
USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)	Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)	78390500UN
USER Enzyme	NEB	M5505S	Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme
Vaccinia Capping System	NEB	M2080S	Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules
Wash buffer A			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer B			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.
Wash buffer C			Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al. 2014.