使用共同分泌的Luciferase代理物测量相对胰岛素分泌

摘要

该协议描述了如何使用胰岛素相关的高辛比酶作为β细胞胰岛素分泌的代理,在中等通量下执行快速低成本荧光素酶测定。大多数发光板读取器和多通道移液器都可以进行测定。

摘要

对分泌胰岛素样品后收集进行基于抗体的检测通常需要几个小时到一天的测定时间,并且可能非常昂贵,具体取决于特定的测定。分泌的荧光素酶测定可加快结果,大大降低每个样品的测定成本。在这里,我们提出了一种相对使用不足的方法,通过使用高西亚荧光素酶基因插入C肽中,测量胰腺β细胞的胰岛素分泌活性。在蛋白酶处理蛋白酶胰岛素过程中,将C-肽切除释放胰岛素分泌囊泡内的荧光素酶,与胰岛素共同分泌。由于荧光素酶测定的速度,在样品收集后几分钟内即可得到结果。测定的一个限制是,它是胰岛素分泌的相对测量,而不是绝对定量。但是,此协议经济、可扩展,可以使用大多数标准发光板读取器执行。模拟和数字多通道移液器有助于多个步骤的测定。可以同时测试许多不同的实验变异。一旦确定了一组聚焦条件,应直接使用具有标准曲线的基于抗体的测定法测量胰岛素浓度,以确认荧光素酶测定结果。

引言

这里介绍的方法允许从转基因β细胞系的胰岛素分泌快速和负担得起的96孔板格式测定。该协议的关键是胰岛素的改良版本,将自然分泌的高斯卢西酶(GLuc,#18 kDa)插入C肽(见图1),以产生胰岛素高西亚(InsGLuc)1,2。其他较大的蛋白质,如GFP(+25 kDa),已成功插入胰岛素的C-肽中,并表现出从蛋白酶-GFP到胰岛素和GFP-C-肽3、4的预期转化后处理。对于该协议中的测定,GLuc已经针对哺乳动物的表达进行了柯顿优化,并引入了两个突变来增强发光动力学5,6。治疗条件的多种组合和复制可以很容易地以96孔板格式进行测试,并在实验后立即获得分泌结果。

如前^{所述,如前所述,}一个主要优势是这种基于荧光酶的分泌测量(<0.01美元/井)的成本较低,这与酶相关免疫吸附测定(ELISAs)的成本和技术方面相对较高。> $2/油井) 和同质时间解荧光 (HTRF) 或其他 Fürster 共振能量转移 (FRET) 为基础的抗体 (> $1/well) 测定。与通过参照标准曲线测量胰岛素浓度的基于抗体的测定相比,InsGLuc 测定测量分泌活性,作为对板上控制井的相对比较。因此,每个实验都需要包含适当的控件。这种区别是一种权衡,允许快速和廉价的测量。然而,InsGLuc分泌已被证明与ELISA1,2测量的胰岛素分泌高度相关。该技术已扩展至高通量筛选1、2 、7,并确定了胰岛素分泌的新型调制器,包括电压门状钾通道抑制剂⁷以及天然产物抑制剂β细胞功能,色霉素A₂⁸。InsGLuc 的使用最适合那些计划持续测试许多不同的治疗条件以测试其对胰岛素分泌的影响的研究人员。在后续实验中,有必要在亲子细胞系中重复关键发现,在小鼠或人类胰岛中以最佳方式重复关键发现,并使用基于抗体的测定测量胰岛素分泌。

研究方案

1. 试剂、介质和缓冲液的制备(表1)

1. 用以下添加剂制备500 mL高葡萄糖(4.5克/升)Dulbeco改性鹰培养基(DMEM)的完整介质:15%胎儿牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素、100微克/mL链霉素、292微克/mL L-谷氨酰胺和50μMβ-麦卡托托乙醇。
   注:本例中稳定的细胞系在G418抗生素的250μg/mL中保持。
2. 通过制造含有 5 mM KCl、120 mM NaCl、15 mM HEPES (pH 7.4)、24 mM NaHCO 3、1mM MgCl2、2 mM CaCl₂和 1 mg/mL 放射性免疫性血清白蛋白 (BSA) 的溶液,制备克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液 (KRBH)。葡萄糖是添加从2M股票指定的地方。
   注:KRBH用于在无刺激和无刺激的情况下孵育细胞,以评估胰岛素和/或高星花酶分泌。
3. 准备锥素 (CTZ) 库存溶液,如下所示。将106μL的浓缩HCl加入10 mL甲醇制备酸化甲醇。接下来,在1mg/mL的酸化甲醇中溶解冻干CTZ,并储存在-80°C的螺帽管中。
   注:即使在适当储存1年之后,这些库存在常规荧光酶测定中仍保持足够的活性。
4. 根据文献9以及专利信息10制备高斯卢西酶(GLuc)测定缓冲液,以帮助在96孔板格式中帮助高斯卢西酶测定的半寿命。使用公式: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% 甘油, 1 毫克/mL Na₂PO₄, 300 mM 钠抗坏血酸钠, 200 mM Na₂SO₃在水中.将库存冻结在 -20°C。解冻后,将缓冲液储存在4°C。
5. 要制备高斯卢西沙酶工作溶液,将1mg/mL(2.36 mM)CTZ库存溶液的4.2μL/mL添加到GLuc测定缓冲液中。这产生了10μMCTZ的2倍工作溶液,在测定中的最终浓度为5μM。

2. InsGLuc MIN6细胞培养和分泌测定种子

1. 要培养MIN6细胞,使用标准细胞培养技术每周对细胞进行胰蛋白化和播种一次。每两到三天更改单元格上的介质。在介质中加入适当的选择抗生素,如 250 μg/mL G418。
   1. 为了每周为实验提供足够数量的细胞,请保持T75瓶中的细胞。在 10 mL 的介质中每 T75 播种 6 x 10⁶个细胞,在培养 7 天后,通常每 T75 产生 30 x 10⁶到 40 x 10⁶个细胞。
2. 要制备细胞电镀到96孔板中,用PBS洗涤InsGLuc MIN6细胞的汇流T75两次,并加入2 mL的胰蛋白酶。在37°C孵育+5分钟,或直到细胞脱离烧瓶。确定每毫升的细胞浓度。
   1. 将完整介质中的细胞稀释至 1 x 10⁶细胞/mL,在 96 孔板中每孔 100 μL 中产生 1 x 10⁵个细胞。细胞应在3~4天后充分结合进行测定。
      注:为了延长培养期,可以镀一半的细胞浓度。除非细胞要接受实验性治疗,否则在测定日之前不需要更换介质。

3. 葡萄糖刺激高斯卢西酶分泌测定

1. 在测定当天为实验准备足够的KRBH(步骤1.2)。每96孔板至少需要50 mBH的KRBH,因此至少准备75 mL,以确保为实验提供足够的缓冲。准备额外的缓冲,如果不同的药物治疗条件组合将需要KRBH稀释。
2. 准备一个储液罐,无葡萄糖KRBH。将介质从 96 孔板中去除,快速将板倒置在实验室水槽上,然后牢固地在纸巾上印上,以去除多余的介质。
3. 使用电子或手动 8 通道移液器,移液器 100 μL /孔 KRBH 从储液罐穿过 96 孔板。重复两次。"
4. (急性复合治疗的可选步骤)如果不进行药物治疗,则不进行步骤 3.5 和 3.6,无需修改。为了测试小分子对胰岛素分泌的影响,可以在预孵育期、刺激期或两者同时向细胞添加化合物。
   1. 一种技术是在1.5 mL管中批量向KRBH添加化合物,并使用可调节的8通道数字移液器将药物KRBH从管转移到96孔板中的细胞。
      注:如果没有可调节移液器,则可以制作药物KRBH的96孔板,并使用标准的8通道移液器来传输缓冲液。可以进一步修改治疗模式,在测定前在介质中治疗细胞24小时,如前^所述1,8。
5. 加入含有所需葡萄糖或化合物浓度的KRBH100 μL,并将菜肴放入37°C培养箱1小时。
   注:根据实验布局,使用电子多通道移液器,允许将通道距离从 8 根 1.5 mL 管的列转换为 96 孔板的 8 行,这是非常有用的。
6. 预孵化 1 小时后,将缓冲液放入水槽中,并在纸巾上牢固地印上斑点。每口井加入100μL无葡萄糖KRBH,洗去高斯荧光素酶的累积背景。再次将板分给板,并在每孔 100 μL 时向板添加控制和刺激条件。将盘子放入 37°C 培养箱中 1 小时。
7. 使用多通道移液器仔细收集 50 μL 的上清液,根据需要在治疗条件之间更换提示,并将上清液转移到干净不透明的白色 96-和测定板。
   注:如有必要,可以使用白墙透明底板,但会丢失大量荧光素酶信号。
8. 收集50μL的KRBH上清液后,样品可立即测定。如有必要,将样品密封并在4°C下存放几天(GLuc活性半寿命=6天)或-20°C,长达1个月11,12。

4. 秘密高斯卢西酶测定

1. 要制备 GLuc 测定工作溶液,请将所需量的 CTZ 库存溶液 (4.2 μL/mL) 移入 GLuc 测定缓冲液中。为防止 CTZ 升温,在 -80°C 冷冻室快速移液 CTZ 或将管放在干冰上。
2. 使用电子多通道移液器,在包含收集的KRBH超生剂的96井盘上,快速添加每口96井的GLuc测定工作溶液50μL。如果任何井的两侧有任何液滴,在桌面回转桶离心机中短暂旋转板。
3. 在几分钟内阅读合适的板读器中的发光,并读取每个井,并具有 0.1 秒的集成时间。

结果

为了测量在控制条件下的测定性能,可以完成一个简单的葡萄糖剂量反应曲线或使用二氧化二氮范式的刺激。在前者的情况下,在无葡萄糖条件下预孵化细胞1小时,然后以葡萄糖浓度增加治疗1小时,在5 mM及以下的分泌活性应极小,而观察到8以上增加的分泌mM 葡萄糖 (图 2)35 mM KCl 的刺激也可用作刺激分泌的阳性控制。在刺激期间纳入分泌调节药物应给予分?...

讨论

在这里,我们提出一种方法,快速评估来自MIN6+细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌反应。为了在测定中获得最佳反应,重要的是将MIN6细胞播种在适当的密度,并允许它们成为85-95%的汇合物。这改善β细胞对葡萄糖的反应,因为改善的细胞-细胞接触和同步,这发生在主小岛17,18,19,20,21以及MIN6

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710