공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

요약

이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.

초록

분비된 인슐린 후 샘플 수집을 위한 항체 기반 분석은 일반적으로 분석 시간의 하루에 몇 시간을 필요로 하며, 특정 분석법에 따라 비쌀 수 있다. 분비된 루시페라아제 분석제는 결과를 신속히 하고 샘플당 분석 비용을 실질적으로 낮춥시한다. 여기에서 우리는 C-펩티드 내의 유전으로 삽입된 Gaussia luciferase를 사용하여 췌장 β 세포에서 인슐린 분비 활동을 측정하기 위하여 상대적으로 과소 이용된 접근을 제시합니다. 프로 인슐린의 프로테올리처리 동안, C-펩타이드는 인슐린과 병용비되는 인슐린 분비 소포 내에서 루시페라제를 방출하는 절제된다. 결과는 luciferase assays의 속도 때문에 견본 수집 후에 분 안에 장악될 수 있습니다. 분석의 한계는 인슐린 분비의 상대적인 측정이지 절대 정량이 아니라는 것입니다. 그러나 이 프로토콜은 경제적이고 확장 가능하며 대부분의 표준 발광 플레이트 판독기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 아날로그 및 디지털 멀티채널 파이펫은 분석의 여러 단계를 용이하게 합니다. 많은 다른 실험 적 변형을 동시에 테스트 할 수 있습니다. 조건의 집중된 세트가 결정되면, 인슐린 사격량은 luciferase 분석 결과를 확인하기 위하여 표준 곡선을 가진 항체 기지를 둔 분석제를 사용하여 직접 측정되어야 합니다.

서문

여기에 제시된 방법은 유전자 변형 베타 세포주에서 인슐린 분비가 96 웰 플레이트 형식으로 신속하고 저렴하게 분석될 수 있게 한다. 이 프로토콜의 핵심은 인슐린-가우시아(InsGLuc) ^1,2를생성하기 위해 C-펩티드내로 삽입된 자연분비 가우시아 루시퍼라제(GLuc, ~18 kDa)를 삽입한 인슐린의 변형된 버전이다. GFP (~25 kDa)와 같은 다른 더 큰 단백질은 성공적으로 인슐린의 C-펩티드에 삽입되고 인슐린과 GFP-C-펩타이드^3,4에대한 프로인슐린-GFP로부터 예상되는 번역 후 처리를 나타냈다. 본 프로토콜의 분석의 경우, GLuc는 포유류 발현에 최적화된 코돈및 2개의 돌연변이가 도입되어광과 같은 역학을 향상시키고 5,^6. 치료 조건의 다중 조합 및 복제는 96 웰 플레이트 형식으로 용이하게 테스트할 수 있으며 실험 직후 분비 결과를 얻을 수 있다.

앞서 언급한 바와같이 2의 주요 장점은 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)의 상대적으로 높은 비용과 기술적 측면과 차별화되는 이 루시퍼라제 기반 분비 측정(&$0.01/well)의 저렴한 비용입니다. > $2/well) 및 균일한 시간 해결 형광 (HTRF) 또는 다른 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 항체 (> $1/well) 분석. 표준 곡선을 참조하여 인슐린의 농도를 측정하는 이러한 항체 기반 분석과 비교하여 InsGLuc 분석은 플레이트상에서 웰을 제어하는 상대적 비교로 분비 활성을 측정합니다. 이러한 이유로 모든 실험에는 적절한 컨트롤이 포함되어야 합니다. 이러한 구분은 신속하고 저렴한 측정을 허용하는 절충안입니다. 그러나, InsGLuc 분비는 ELISA^1,2에의해 측정된 바와 같이 인슐린 분비와 높은 상관관계가 있는 것으로 입증되었다. 이 기술은 고처리량 스크리닝 1,^2,7을 위해 확장되었으며 전압 게이트 칼륨 채널 억제제 7을 포함한 인슐린 분비물의 새로운 변조기의 식별을 주도하고 있다⁷ 뿐만 아니라 β 세포 기능의 천연 생성억제제, 크로모마이신 A2^8. InsGLuc의 사용은 지속적으로 인슐린 분 비에 미치는 영향에 대 한 많은 다른 치료 조건을 테스트 하려는 연구원에 대 한 가장 적합. 후속 실험에서 부모 β 세포주에서 주요 발견을 반복하고, 뮤린 또는 인간 아일에서 최적으로, 항체 기반 분석을 사용하여 인슐린 분비를 측정할 필요가 있다.

프로토콜

1. 시약, 매개체 및 완충제 의 준비 (표 1)

1. 다음 첨가제와 함께 500 mL의 고포도당 (4.5 g / L) 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 MIN6 완전한 매체를 준비하십시오 : 15 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 단위 / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙 토마이신, 292 μl/ ll β-메르카포에탄올.
   참고: 이 경우 안정된 세포주 G418 항생제의 250 μg/mL에서 유지된다.
2. Krebs-링거 중탄산염 완충제(KRBH)를 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES(pH 7.4),24 mM NaHCO 3, 1 mM MM MgCl_2,2 mM CaCl_2,및 1 mg/mL 방사성 면역 분석 등급 소수 나트륨 혈청(BSA)을 포함하는 용액을 제조한다. 포도당은 2M 스톡으로부터 지정된 곳에 첨가되어야 한다.
   참고: KRBH는 인슐린 및/또는 가우시아 루시퍼라아제 분비를 평가하기 위해 자극유무에 관계없이 세포를 배양하는 데 사용됩니다.
3. 다음과 같이 coelenterazine (CTZ) 스톡 솔루션을 준비합니다. 106 μL의 농축 된 HCl을 메탄올 10 mL에 첨가하여 산성화된 메탄올을 준비합니다. 다음으로, 1 mg/mL에서 산성화된 메탄올에 동포화된 CTZ를 용해시키고 나사 캡 튜브에 -80°C로 보관합니다.
   참고 : 이 주식은 적절한 보관 1 년 후에도 일상적인 루시퍼라아제 어세이에서 충분한 활동을 유지합니다.
4. 문헌^9뿐만 아니라 특허 정보(10)에 기초한 가우시아 루시퍼라제(GLuc) 분석 완충제를 준비하여 96웰 플레이트 형식으로 가우시아 루시플라아 어라세아제분석법의 반감기를 돕는다. 공식을 사용: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 mg/mL Na₂PO_4,300 mM 나트륨 아스코르브산염, 200 mM Na₂SO₃ 물에. -20 °C에서 주식을 동결. 해동 후 버퍼를 4°C에 보관합니다.
5. 가우시아 루시퍼라제 작업 용액을 준비하려면 GLuc 분석 버퍼에 1 mg/mL(2.36 mM) CTZ 스톡 솔루션의 4.2 μL/mL을 추가합니다. 이것은 분석법에서 5 μM 최종 농도를 가질 것이다 10 μM CTZ의 2x 작업 용액 을 초래한다.

2. InsGLuc MIN6 세포의 배양 및 분비 세포 에 대한 파종

1. MIN6 세포를 배양하기 위해, 표준 세포 배양 기술을 사용하여 일주일에 한 번 세포를 트립시니화하고 종화시화한다. 2~3일마다 세포의 미디어를 변경합니다. 미디어에 G418의 250 μg/mL와 같은 적절한 선택 항생제를 포함시다.
   1. 실험을 위해 매주 충분한 수의 세포를 제공하려면 T75 플라스크에서 세포를 유지합니다. 배지의 10 mL에서 T75당 6 x 10⁶ 세포를 파종하는 것은 전형적으로 7일 의 배양 후 T75당 총 30 x 10⁶ 내지 40 x 10⁶ 세포를 산출할 것이다.
2. 96 웰 플레이트에 도금을 위한 세포를 준비하려면, INsGLuc MIN6 세포의 콘립 T75를 PBS로 두 번 세척하고 트립신 2 mL을 추가합니다. 37°C에서 ~ 5분 동안 또는 세포가 플라스크에서 해리될 때까지 배양한다. 밀리리터당 세포 농도를 결정합니다.
   1. 세포를 완전한 매체에 1 x 10⁶ 세포/mL로 희석하여 96웰 플레이트에서 웰당 100 μL에서 1 x 10⁵ 세포를 생성합니다. 세포는 3-4 일 후에 분석에 충분히 결합되어야합니다.
      참고: 배양 기간을 연장하기 위해, 세포 농도의 절반을 도금할 수 있다. 세포가 실험적인 처리를 복종하지 않는 한 매체 변경은 분석의 날 의 앞에 요구되지 않습니다.

3. 포도당 자극 가우시아 루시퍼라제 분비 분석

1. 분석의 날에 실험에 대한 충분한 KRBH를 준비 (단계 1.2). 96웰 플레이트당 최소 50 mL의 KRBH가 필요하므로 실험을 위한 충분한 완충액을 보장하기 위해 적어도 75 mL을 준비한다. 약물 치료 조건의 상이한 조합이 희석을 위해 KRBH를 필요로 하는 경우에 추가 완충제를 준비하십시오.
2. 포도당이 없는 KRBH로 저수지를 준비합니다. 실험실 싱크대 위에 플레이트를 빠르게 뒤집어 서 96 웰 플레이트에서 배지를 장식한 다음 종이 타월 더미에 단단히 얼룩을 대고 여분의 배지를 제거합니다.
3. 전자 또는 수동 8채널 파이펫을 사용하여, 96웰 플레이트(들)를 가로지르는 저수지로부터 피펫 100 μL/well KRBH. 총 2회 를 반복합니다.
4. (급성 화합물 치료의 선택적 단계) 약물 치료를 수행하지 않는 경우 수정없이 3.5 단계 및 3.6 단계를 진행하십시오. 인슐린 분비에 대한 작은 분자의 효과를 테스트하기 위해, 화합물은 사전 인큐베이션 기간, 자극 기간, 또는 둘 다 동안 세포에 첨가될 수 있다.
   1. 한 가지 기술은 1.5 mL 튜브에서 KRBH에 화합물을 일괄첨가하고 조절 가능한 8채널 디지털 파이펫을 사용하여 튜브에서 96웰 플레이트의 세포로 약물 KRBH를 전달하는 것입니다.
      참고: 조정 가능한 파이펫을 사용할 수 없는 경우, 약물-KRBH의 복제 96웰 플레이트를 만들 수 있으며 표준 8채널 파이펫을 사용하여 버퍼를 전달할 수 있습니다. 치료 패러다임에 대한 추가적인 변형은 앞서 설명한^바와같이 분석전에 24시간 동안 세포를 분석하기 위해 이루어질 수 있고,^8.
5. 원하는 포도당 또는 화합물 농도를 함유하는 KRBH 100 μL을 넣고 접시를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다.
   참고: 실험 레이아웃에 따라 8개의 1.5mL 튜브 열에서 96웰 플레이트의 8열로 채널 거리를 전환할 수 있는 전자 멀티채널 파이펫을 만드는 것이 매우 유용합니다.
6. 1시간 의 선입견 후, 완충기를 싱크대에 넣고 종이 타월에 단단히 얼룩을 지습니다. 100 μL의 포도당 무당류 KRBH를 잘 추가하여 가우시아 루시퍼라아제의 축적된 배경을 씻어내도록 합니다. 플레이트를 다시 장식하고 웰당 100 μL로 플레이트에 제어 및 자극 조건을 추가합니다. 접시를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다.
7. 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 상층의 50 μL을 수집하고, 필요에 따라 처리 조건 사이의 팁을 변경하고, 깨끗한 불투명 한 흰색 96-well assay 플레이트에 상류를 전송합니다.
   참고: 필요한 경우 흰색 벽의 투명 바닥 플레이트를 사용할 수 있지만 상당량의 루시퍼라아제 신호가 손실됩니다.
8. KRBH 상급제의 50 μL의 수집 후, 샘플을 즉시 분석할 수 있다. 필요한 경우, 샘플을 4°C에서 며칠 동안 밀봉 및 저장(GLuc 활성 반감기 ~6일) 또는 -20°C에서 최대 1개월^{동안 11,12.}

4. 분비 가우시아 루시퍼라아제 분석

1. GLuc 분석 작업 용액을 준비하려면 GLuc 분석 버퍼에 필요한 양의 CTZ 스톡 솔루션(4.2 μL/mL)을 파이펫합니다. CTZ의 온난화를 방지하기 위해-80°C 냉동고에서 CTZ를 빠르게 파이펫하거나 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오.
2. 전자 멀티채널 파이펫을 사용하여 수집된 KRBH 상피제를 함유한 96웰 접시에 걸쳐 GLuc 분석 작업 용액당 50 μL을 신속하게 추가합니다. 우물 의 측면에 물방울이있는 경우, 잠시 테이블 탑 스윙 버킷 원심 분리기에 접시를 회전.
3. 몇 분 내에 적합한 플레이트 리더에서 발광을 읽고 0.1 s의 통합 시간으로 각 잘 읽습니다.

결과

대조군 조건하에서 분석의 성능을 측정하기 위해, 디아옥사이드 패러다임을 이용한 간단한 포도당 투여량-반응 곡선 또는 자극을 완료할 수 있다. 전자의 경우, 포도당 없는 조건에서 1시간 동안 세포를 미리 배양한 다음 포도당 농도가 증가하여 1시간 동안 치료하면 5mM 이하에서 분비 활동이 거의 발생하지 않아야 하며, 분비는 8이상으로 관찰됩니다. mM 포도당

토론

여기서 우리는 MIN6 β 세포로부터의 포도당 자극 인슐린 분비 반응을 신속하게 평가하는 방법을 제시한다. 분석에서 최상의 응답을 위해 적절한 밀도로 MIN6 세포를 시드하고 85-95 % 동시성으로 하는 것이 중요합니다. 이는 1차 섬^{17,18,19,20,21뿐만} 아니라 MIN6에서 모두 발생하는 향상된 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710