Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Resumen

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

Resumen

La realización de ensayos basados en anticuerpos para la recolección secreta de insulina después de la muestra suele requerir unas horas a un día de tiempo de ensayo y puede ser costoso, dependiendo del ensayo específico. Los ensayos de luciferasa secretas aceleran los resultados y reducen sustancialmente el costo del ensayo por muestra. Aquí presentamos un enfoque relativamente infrautilizado para medir la actividad secretora de insulina de las células pancreáticas mediante el uso de Gaussia luciferasa insertada genéticamente dentro del péptido C. Durante el procesamiento proteolítico de la proinsulina, el péptido C se extirparte liberando la luciferasa dentro de la vesícula secretora de insulina donde se co-secreta con insulina. Los resultados se pueden obtener en cuestión de minutos después de la recolección de muestras debido a la velocidad de los ensayos de luciferasa. Una limitación del ensayo es que es una medida relativa de la secreción de insulina y no una cuantificación absoluta. Sin embargo, este protocolo es económico, escalable y se puede realizar utilizando la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia estándar. Las pipetas multicanal analógicas y digitales facilitan múltiples pasos del ensayo. Muchas variaciones experimentales diferentes se pueden probar simultáneamente. Una vez que se decide un conjunto focalizado de condiciones, las concentraciones de insulina deben medirse directamente utilizando ensayos basados en anticuerpos con curvas estándar para confirmar los resultados del ensayo de luciferas.

Introducción

El método presentado aquí permite que la secreción de insulina de una línea de células beta modificadagenéticamente se ensaye rápida y asequiblemente en formato de 96 placas de pozo. La clave de este protocolo es una versión modificada de la insulina con la Gaussia luciferase naturalmente secretada (GLuc, 18 kDa) insertada (ver Figura 1) en el péptido C para generar insulina-Gaussia (InsGLuc)^1,2. Otras proteínas más grandes, como la GFP (25 kDa), se han insertado con éxito en el péptido C de la insulina y han exhibido el procesamiento post-traduccional esperado de la proinsulina-GFP a la insulina y el péptido GFP-C^3,4. Para el ensayo de este protocolo, GLuc ha sido optimizado para la expresión de mamíferos y sehan introducido dos mutaciones para mejorar la cinética brillante 5,^6. Múltiples combinaciones y réplicas de las condiciones de tratamiento se pueden probar fácilmente en formato 96-bien-placa y los resultados de la secreción se pueden obtener inmediatamente después del experimento.

Una ventaja importante, como se señaló anteriormente², es el bajo costo de esta medición de secreción basada en luciferasa (< $0.01/well) que la diferencia de los costos relativamente más altos y los aspectos técnicos de los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) ( > Ensayos de "2$/bien) y fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) u otros ensayos de anticuerpos basados en la transferencia de energía por resonancia de la familia (FRET) (> $1/bueno). En comparación con estos ensayos basados en anticuerpos, que miden la concentración de insulina haciendo referencia a una curva estándar, el ensayo InsGLuc mide la actividad secretora como una comparación relativa con los pozos de control en la placa. Por esa razón, cada experimento requiere la inclusión de controles adecuados. Esta distinción es una compensación para permitir mediciones rápidas y baratas. Sin embargo, se ha demostrado que la secreción de InsGLuc está altamente correlacionada con la secreción de insulina medida por ELISA^1,2. Esta tecnología se ha ampliado para el cribado de alto rendimiento^1,2,7 y ha llevado a la identificación de nuevos moduladores de la secreción de insulina, incluyendo un inhibidor del canal de potasio cerrado por voltaje⁷ así como un producto natural inhibidor de la función celular, cromomicina A₂⁸. El uso de InsGLuc es más adecuado para los investigadores que planean probar continuamente muchas condiciones de tratamiento diferentes para su impacto en la secreción de insulina. En los experimentos de seguimiento es necesario repetir los hallazgos clave en una línea celular de los padres, y de manera óptima en islotes murinos o humanos, y medir la secreción de insulina mediante un ensayo basado en anticuerpos.

Protocolo

1. Preparación de reactivos, medios y buffers (Tabla 1)

1. Preparar el medio completo de la min6 en 500 ml de medio águila modificado (DMEM) de alta glucosa (4,5 g/L) de Dulbecco con los siguientes aditivos: 15% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 292 g/ml de glutamina y 50 m lglutinamina y 50 ml -mercaptoetanol.
   NOTA: La línea celular estable en este caso se mantiene en 250 g/ml de antibiótico G418.
2. Preparar el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) haciendo una solución que contenga 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂y 1 mg/ml de aalbúmina de suero bovino de grado bovino (BSA). La glucosa se añadirá cuando se especifique a partir de una población de 2 M.
   NOTA: KRBH se utiliza para incubar las células con y sin estimulación con el fin de evaluar la insulina y / o secreción de gaussia luciferasa.
3. Prepare la solución de material de celenterazine (CTZ) de la siguiente manera. Preparar el metanol acidificado añadiendo 106 ml de HCl concentrado a 10 ml de metanol. A continuación, disolver CTZ liofilizado en metanol acidificado a 1 mg/ml y almacenar a -80 oC en tubos de tapa de tornillo.
   NOTA: Estas existencias conservan suficiente actividad en los ensayos de rutina de luciferasa, incluso después de 1 año de almacenamiento adecuado.
4. Preparar el tampones del ensayo Gaussia luciferase (GLuc) basado en la literatura 9, así como la información de patente¹⁰ para ayudar en la vida media del ensayo Gaussia luciferase en formato de placa de 96 pozos. Utilice la fórmula: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/ml Na₂PO₄, 300 mM de ascorbato sódico, 200 mM Na₂SO₃ en agua. Congele las existencias a -20 oC. Después de descongelar, almacene el tampón a 4oC.
5. Para preparar la solución de trabajo Gaussia luciferase, añada 4,2 l/ml de la solución de stock CTZ de 1 mg/ml (2,36 mM) al búfer de ensayo GLuc. Esto da como resultado una solución de trabajo de 2x de 10 M de CTZ que tendrá una concentración final de 5 M en el ensayo.

2. Cultivo de células InsGLuc MIN6 y sembrado para ensayos de secreción

1. Para cultivar células MIN6, tiza y sembra las células una vez por semana usando técnicas de cultivo celular estándar. Cambie los medios en las celdas cada dos o tres días. Incluya el antibiótico de selección adecuado, como 250 g/ml de G418 en los medios de comunicación.
   1. Para proporcionar un número suficiente de células semanalmente para los experimentos, mantenga las células en frascos T75. La sembración de 6 x 10⁶ células por T75 en 10 ml de medios normalmente producirá 30 x 10⁶ a 40 x 10⁶ celdas en total por T75 después de 7 días de cultivo.
2. Para preparar las células para el enchapado en placas de 96 pocillos, lave un confluente T75 de células InsGLuc MIN6 dos veces con PBS y agregue 2 ml de trippsina. Incubar a 37oC durante 5 min o hasta que las células se disocien del matraz. Determinar la concentración celular por mililitro.
   1. Diluir las células en un medio completo a 1 x 10⁶ celdas/ml para dar como resultado 1 x 10⁵ celdas en 100 ol por poca en una placa de 96 pocillos. Las células deben ser lo suficientemente confluentes para el ensayo después de 3-4 días.
      NOTA: Para extender el período de cultivo, se puede chapar la mitad de la concentración celular. No se requieren cambios en los medios antes del día del ensayo, a menos que las células deban someterse a tratamientos experimentales.

3. Ensayo de secreción de Gaussia luciferase estimulada por glucosa

1. El día del ensayo preparar suficiente KRBH para el experimento (paso 1.2). Se requiere un mínimo de 50 ml de KRBH por placa de 96 pocillos, por lo tanto, prepare al menos 75 ml para asegurar un búfer suficiente para el experimento. Prepare un tampón adicional si diferentes combinaciones de condiciones de tratamiento de medicamentos requerirán KRBH para la dilución.
2. Prepare un depósito con KRBH libre de glucosa. Decantar el medio de 96 placas de pozo sin invertir rápidamente la placa sobre un fregadero de laboratorio y luego blotar firmemente en una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de medio.
3. Usando una pipeta electrónica o manual de 8 canales, pipeta 100 l /bien KRBH desde el depósito a través de la placa de 96 pocillos. Repita el proceso para un total de dos lavados.
4. (Paso opcional de los tratamientos compuestos agudos) Si no realiza tratamientos farmacológicos, continúe con los pasos 3.5 y 3.6 sin modificaciones. Para probar los efectos de moléculas pequeñas en la secreción de insulina, se pueden agregar compuestos a las células durante el período de preincubación, período de estimulación, o ambos.
   1. Una técnica es añadir compuestos por lotes al KRBH en tubos de 1,5 ml y utilizar una pipeta digital ajustable de 8 canales para transferir el fármaco-KRBH de los tubos a las células en placas de 96 pocillos.
      NOTA: Si no hay una pipeta ajustable disponible, se puede hacer una réplica de 96 pocillos de fármaco-KRBH y se puede utilizar una pipeta estándar de 8 canales para transferir el búfer. Se pueden realizar modificaciones adicionales en el paradigma del tratamiento para tratar las células durante 24 horas en medios anteriores al ensayo, como se describió anteriormente^1,8.
5. Añadir 100 l de KRBH que contenga la concentración deseada de glucosa o compuestos y colocar el plato en la incubadora de 37 oC durante 1 h.
   NOTA: Dependiendo del diseño experimental, es extremadamente útil tener una pipeta electrónica multicanal que permita la transición de las distancias de canal de una columna de ocho tubos de 1,5 ml a las 8 filas de una placa de 96 pocillos.
6. Después de la 1 h de preincubación, decantar el tampón en el fregadero y blot firmemente en la toalla de papel. Añadir 100 l de KRBH libre de glucosa por pozo para lavar el fondo acumulado de Gaussia luciferase. Decantar la placa de nuevo y añadir condiciones de control y estimulantes a la placa a 100 ol por poca. Colocar el plato en la incubadora de 37oC durante 1 h.
7. Recoja cuidadosamente 50 ml de sobrenadante utilizando una pipeta multicanal, cambiando las puntas entre las condiciones de tratamiento según sea necesario, y transfiera el sobrenadante a una placa de ensayo blanca opaca limpia de 96 pocillos.
   NOTA: Las placas de fondo transparente de paredes blancas se pueden utilizar si es necesario, aunque se perderá una cantidad significativa de señal de luciferasa.
8. Después de la recolección de 50 l de sobrenadante KRBH, la muestra se puede analizar inmediatamente. Si es necesario, sellar y almacenar las muestras a 4 oC durante unos días (vida media de la actividad de GLuc a 6 días) o -20 oC hasta un mes^11,12.

4. Ensayo secreto de Gaussia luciferase

1. Para preparar la solución de trabajo del ensayo GLuc, pipetee la cantidad necesaria de solución de stock CTZ (4,2 l/ml) en el búfer de ensayo DeLuc. Para evitar el calentamiento del CTZ, pipetee el CTZ rápidamente en el congelador de -80 oC o mantenga el tubo en hielo seco.
2. Usando una pipeta electrónica multicanal, agregue rápidamente 50 sde la solución de trabajo de ensayo GLuc por pozo en el plato de 96 pozos que contiene los sobrenatantes KRBH recogidos. Si hay gotas en los lados de cualquier pozo, gire brevemente la placa en una centrífuga de columpio de mesa.
3. Lea la luminiscencia en un lector de placas adecuado en pocos minutos y lea cada pozo con un tiempo de integración de 0,1 s.

Resultados

Para medir el rendimiento del ensayo en condiciones de control, se puede completar una simple curva de dosis-respuesta de glucosa o una estimulación utilizando el paradigma de diazoxida. En el caso de la primera, la preincubación de las células durante 1 h en condiciones libres de glucosa seguida de tratamiento durante 1 h con concentraciones de glucosa crecientes debe dar lugar a muy poca actividad secretora en y por debajo de 5 mM, mientras que el aumento de la secreción se observa ...

Discusión

Aquí presentamos un método para evaluar rápidamente las respuestas de secreción de insulina estimuladas por la glucosa de las células MIN6. Para obtener las mejores respuestas en el ensayo es importante sembrar las células MIN6 con la densidad adecuada y permitir que se conviertan en un confluente del 85-95%. Esto mejora las respuestas celulares a la glucosa debido a la mejora de los contactos y la sincronización de células celulares, que se produce tanto en los islotes primarios^17,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
rIns-GLuc stable MIN6 cells			Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418
DMEM	Sigma	D6429	4.5 g/L glucose media
fetal bovine serum, heat-inactivated	Sigma	F4135
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	SV30010
beta-mercaptoethanol	Thermo-Fisher Scientific	BP 176-100
glutamine	Thermo-Fisher Scientific	BP379-100
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-500
G418	Gold Biotechnology	G418-10	Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.
T75 tissue culture flasks	Fisher Scientific	07-202-000
96 well tissue culture plates	Celltreat	229196
Reagent reservoirs (50 mL)	Corning	4870
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secretion assay reagents
BSA (RIA grade)	Thermo-Fisher Scientific	50-146-952
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG
KCl	Thermo-Fisher Scientific	P217-500
NaCl	Thermo-Fisher Scientific	S271-3
Hepes, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	50-213-365
NaHCO3	Thermo-Fisher Scientific	15568414
MgCl2	Thermo-Fisher Scientific	M9272-500G
CaCl2	Sigma	C-7902
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional drugs for stimulation experiments
Diazoxide	Sigma	D9035	Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.
epinephrine (bitartrate salt)	Sigma	E4375	Stock solution: 5 mM in water
PMA (phorbol 12-myristate)	Sigma	P1585	Stock solution: 100 µM in DMSO
Name	Company	Catalog Number	Comments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)	Thermo-Fisher Scientific	S374-500
Glycerol	Thermo-Fisher Scientific	G334
Sodium Bromide	Thermo-Fisher Scientific	AC44680-1000
EDTA	Thermo-Fisher Scientific	AC44608-5000	Stock solution: 0.5 M pH 8
Tris base	RPI	T60040-1000.0	Stock solution: 1 M pH 8
Ascorbic Acid	Fisher Scientific	AAA1775922	US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.
Na2SO3	Sigma	S0505-250G	US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA
Coelenterazine (native)	Nanolight / Prolume	3035MG	Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	6005290	Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent	BioTek	8041000	A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.
8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL)	Integra	4724	An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format
8-channel 200 µL pipette	Transferpette S 20-200 µL	2703710